兩性霉素B和伏立康唑?qū)︸R爾尼菲青霉菌臨床株超微形態(tài)影響的研究

張倩影 梁伶 曹存巍 劉棟華

·研究報道·

兩性霉素B和伏立康唑?qū)︸R爾尼菲青霉菌臨床株超微形態(tài)影響的研究

張倩影 梁伶 曹存巍 劉棟華

目的 通過掃描電鏡和透射電鏡觀察馬爾尼菲青霉菌臨床株經(jīng)兩性霉素B和伏立康唑作用前后超微形態(tài)的變化。方法 采用微量稀釋法先測定兩性霉素B和伏立康唑?qū)︸R尼菲青霉菌臨床株的最小抑菌濃度（MIC），在MIC和10倍MIC條件下，藥物與菌作用24、48、72 h，分別在掃描電鏡和透射電鏡下觀察馬爾尼菲青霉菌的超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果 馬爾尼菲青霉菌經(jīng)兩性霉素B作用后，隨著藥物作用時間延長及濃度增加，掃描電鏡下可見到菌體破損，外層剝離、皺縮、斷裂及粘連；透射電鏡下線粒體變性，細胞核碎裂，細胞膜皺縮，胞質(zhì)內(nèi)細胞器消失，細胞壁斷裂。經(jīng)伏立康唑作用后，掃描電鏡下可見到菌體破損、皺縮、干癟、坍塌；透射電鏡下均看到胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)許多高密度的電子致密顆粒，線粒體變性，細胞壁表面粗糙，細胞膜皺縮、破損，胞質(zhì)內(nèi)各細胞器消失。結(jié)論 兩性霉素B和伏立康唑?qū)︸R爾尼菲青霉菌有明顯抗菌作用，均可使其超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，與藥物濃度及作用時間呈正相關(guān)。兩種藥物相比，兩性霉素B對菌細胞損傷更明顯。

顯微鏡檢查，電子，掃描；顯微鏡檢查，電子，透射；兩性霉素B；伏立康唑；馬爾尼菲青霉菌

馬爾尼菲青霉?。≒enicilliosis Marneffei）是由馬爾尼菲青霉（Penicillium marneffei，PM）感染引起的系統(tǒng)性真菌病，是東南亞地區(qū)艾滋病患者最常見的機會性感染之一，誤診率極高［1］。及時、足量、有效的抗真菌治療可使馬爾尼菲青霉病長期緩解，兩性霉素B仍是目前國內(nèi)外推薦治療的首選藥［2］，但由于其嚴(yán)重的不良反應(yīng)，限制了使用。伏立康唑是第二代三唑類廣譜抗真菌藥，具有廣譜、抗菌效力強、安全的特點，但因價格昂貴，臨床未能作為一線常規(guī)使用藥物，對馬爾尼菲青霉病的治療經(jīng)驗缺乏。為了解兩性霉素B和伏立康唑體外對PM形態(tài)學(xué)的影響，本實驗采用微量稀釋法測定兩性霉素B和伏立康唑?qū)M臨床株的最小抑菌濃度（MIC），并在掃描電鏡和透射電鏡下觀察藥物作用前后PM的超微結(jié)構(gòu)變化，為臨床用藥提供一定的理論依據(jù)。

一、材料

1.受試菌株：來源于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科真菌室收藏PM臨床株1株，編號R9031。

2.抗真菌藥物：兩性霉素B標(biāo)準(zhǔn)粉末（壽光富康制藥有限公司，批號：HAN0704302，純度99.7%），伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)粉末（壽光富康制藥有限公司，批號：070724，純度99.9%），均由北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心贈送。

作者單位：530021南寧，廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科

3.培養(yǎng)基：RPMI 1640液體培養(yǎng)基。

二、方法

1.MIC測定：用RPMI 1640液體培養(yǎng)基將藥物稀釋，兩性霉素B起始濃度32 mg/L，終末濃度0.0625 mg/L；伏立康唑起始濃度4 mg/L，終末濃度0.0078 mg/L，即2倍應(yīng)測試藥物。依次加入96孔板，每孔100 μl。采用CLSI推薦的M38-A方案將活化后的受試PM菌株用生理氯化鈉溶液制成0.4×106～5×106CFU/ml菌懸液，再用RPMI1640液體培養(yǎng)基稀釋50倍得2倍終濃度的菌懸液。96孔板中依次加入100 μl菌懸液，37℃培養(yǎng)72 h后用視覺法判定終點，兩性霉素B和伏立康唑?qū)M臨床株的MIC分別為0.25 mg/L、0.125 mg/L。

2.電鏡觀察：應(yīng)用相應(yīng)MIC及10倍MIC藥物作用于對數(shù)生長期PM，放置37℃培養(yǎng)，分別于作用前及作用后24、48、72 h取標(biāo)本用于電鏡觀察。

掃描電鏡標(biāo)本制備［2-4］：將培養(yǎng)液置于3%甲醛等量固定，4℃冰箱靜置固定或過夜；將1滴培養(yǎng)液滴在粘有L-多聚賴氨酸的蓋玻片上，干燥后磷酸鹽緩沖液漂洗3次，每次10 min，4℃冰箱靜置；乙醇系列脫水，乙酸異戊脂置換，二氧化碳臨界點干燥，離子濺射儀噴金。

透射電鏡標(biāo)本制備［5-6］：將培養(yǎng)液置于3%甲醛溶液等量固定，4℃冰箱靜置4 h或過夜。1 500 r/min，離心半徑6 cm離心5 min，棄上清液，加入1~2滴瓊脂液薄層封閉真菌，自然凝固，1%鋨酸二次固定2～3 h；乙醇系列脫水，丙酮和包埋劑1∶1混合液浸透，室溫靜置，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片及醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染色。

三、結(jié)果

1.掃描電鏡觀察結(jié)果：PM臨床株培養(yǎng)24、48、72 h在掃描電鏡下菌體表面光滑，分隔、分支（圖1）。經(jīng)0.25 mg/L兩性霉素B作用后24 h：菌體皺縮，有輕度缺損和大小不等的凹陷；48 h：菌體外層明顯剝離，干癟；72 h：菌體明顯干癟、坍塌。經(jīng)2.5 mg/L兩性霉素B作用后24 h：多數(shù)菌體彌漫破損；48 h：菌體完全斷裂、皺縮；72 h：菌體完全破損及碎片粘連。經(jīng)0.125 mg/L伏立康唑作用后24 h：菌體局部出現(xiàn)小破損；48 h：菌體破損增大，部分干癟、皺縮；72 h：菌體缺損，較多斷裂。經(jīng)1.25 mg/L伏立康唑作用后24 h：菌體部分破損凹陷，表面粗糙及皺縮；48 h：菌體表面不光滑，斷裂；72 h：菌體干癟、坍塌。見圖1。

2.透射電鏡觀察結(jié)果：PM菌株見完整細胞壁、細胞膜，胞質(zhì)內(nèi)可見線粒體、微體、脂質(zhì)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞核等結(jié)構(gòu)（圖2）。經(jīng)0.25 mg/L兩性霉素B作用后24 h：細胞膜輕度皺縮，線粒體膜破損、嵴紊亂，細胞核部分溶解；48 h：細胞膜明顯皺縮，細胞壁皺縮，細胞器結(jié)構(gòu)不清晰；72 h：細胞膜、細胞器消失，胞質(zhì)出現(xiàn)大片空白區(qū)，細胞壁斷裂。經(jīng)2.5 mg/L兩性霉素B作用后24 h：細胞膜破損，可見大脂質(zhì)體、線粒體殘骸，余細胞器不清晰；48 h：細胞膜明顯皺縮，胞質(zhì)內(nèi)細胞器不清晰，胞質(zhì)濃縮呈顆粒狀；72 h：細胞膜、細胞器溶解消失，細胞壁斷裂，胞質(zhì)內(nèi)大片空白區(qū)。經(jīng)0.125 mg/L伏立康唑作用后24 h：胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)高密度電子致密顆粒，線粒體嵴融合消失；48 h：細胞膜明顯皺縮、缺損，細胞核及線粒體等結(jié)構(gòu)不清晰；72 h：胞質(zhì)濃縮呈顆粒狀，胞質(zhì)內(nèi)各細胞器消失，細胞膜降解，細胞壁輕度皺縮。1.25 mg/L伏立康唑作用后24 h：線粒體嵴不清，細胞核部分溶解，細胞壁粗糙；48 h：胞質(zhì)濃縮、空泡，胞質(zhì)內(nèi)各細胞器結(jié)構(gòu)不清；72 h：胞質(zhì)明顯空泡，細胞器消失，細胞膜溶解（圖1）。

圖1 馬爾尼菲青霉菌經(jīng)不同濃度兩性霉素B、伏立康唑作用不同時間后的掃描電鏡觀察（×4 000） 未經(jīng)藥物作用的馬爾尼菲青霉菌臨床株菌體表面光滑，分隔、分支；隨著兩性霉素B作用時間延長及濃度增加，可見到菌體出現(xiàn)凹陷，外層壁剝離，菌體表面皺縮、彎曲，大小不一的破損，多處斷裂及碎片粘連；經(jīng)伏立康唑作用后，可見到菌體凹凸不平，部分干癟、斷裂，菌體表面粗糙、皺縮、凹陷，出現(xiàn)斷裂、彎曲，粗細不一，縮窄處可見菌絲干癟及坍塌

四、討論

兩性霉素B是多烯類抗真菌藥，抗菌譜廣，通過選擇性地與真菌細胞膜的麥角固醇結(jié)合改變膜通透性，導(dǎo)致細胞內(nèi)重要物質(zhì)外滲而致真菌死亡。Brajatburg等［7］認為兩性霉素B使細胞死亡并非單純由于膜通透性增高所致，可能是由于膜通透性增高而使胞內(nèi)離子紊亂及其他成分丟失等因素，導(dǎo)致細胞代謝紊亂；而細胞外自由基的進入加劇了細胞代謝紊亂，并可使細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)破壞。伏立康唑?qū)儆诘诙蝾惪拐婢?，具有廣譜抗真菌活性。兩性霉素B血藥濃度約為2～4 mg/L，伏立康唑平均血藥濃度為1 193～4 380 μg/L，本研究采用2種藥物MIC和10倍MIC（兩性霉素B和伏立康唑均處于血藥濃度）作用于PM后，分別在掃描電鏡和透射電鏡下觀察藥物作用前后PM的超微結(jié)構(gòu)變化。

圖2 馬爾尼菲青霉菌經(jīng)不同濃度兩性霉素B、伏立康唑作用不同時間后的透射電鏡觀察 正常馬爾尼菲青霉菌株有完整的細胞壁、細胞膜，胞質(zhì)內(nèi)可見線粒體、微體、脂質(zhì)體、細胞核；隨著兩性霉素B作用時間延長及濃度增加，可見到線粒體變性，細胞核碎裂，細胞膜皺縮，胞質(zhì)內(nèi)細胞器消失，細胞壁斷裂；經(jīng)伏立康唑作用后，均看到胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)許多高密度電子致密顆粒，線粒體變性，細胞壁表面粗糙，細胞膜皺縮、破損，胞質(zhì)內(nèi)各細胞器消失

本實驗中，掃描電鏡下，未經(jīng)藥物作用的PM臨床株菌體有分隔、短分支，表面光滑。低濃度和高濃度兩性霉素B和伏立康唑作用后，PM臨床株可見到菌體出現(xiàn)破損、皺縮，最后斷裂。透射電鏡下，PM臨床株經(jīng)MIC兩性霉素B和伏立康唑作用24 h后，線粒體嵴紊亂不清，細胞核部分溶解。線粒體發(fā)生改變或消失，細胞呼吸鏈和整套酶系統(tǒng)受到抑制，氧化磷酸化和能量偶聯(lián)系統(tǒng)遭到破壞，細胞能量減少，加上細胞核破壞消失，從而影響基因調(diào)控以及蛋白質(zhì)、核酸的合成和DNA復(fù)制而導(dǎo)致細胞死亡。藥物濃度增加及作用時間延長，兩性霉素B作用后細胞壁斷裂，細胞膜連續(xù)性被破壞，胞質(zhì)內(nèi)各細胞器模糊不清，內(nèi)容物流出，作用至72 h細胞裂解。真菌細胞壁是真菌細胞最外層結(jié)構(gòu)，在維持真菌形態(tài)及胞內(nèi)高滲狀態(tài)中起著極為重要的作用。PM臨床株隨著藥物濃度增加及作用時間的延長，細胞壁、細胞膜、胞質(zhì)內(nèi)各細胞器損傷更明顯，說明這兩種藥物對PM均具有較好及較穩(wěn)定的殺傷作用。兩性霉素B作用于PM后，除胞質(zhì)內(nèi)細胞器溶解、出現(xiàn)空泡等改變與伏立康唑的作用相似外，細胞壁也受到一定程度的破壞，胞質(zhì)內(nèi)容物流出，最后細胞凋亡，提示兩性霉素B對PM的損傷可能更嚴(yán)重。

PM對于兩性霉素B、伊曲康唑以及其他三唑類藥物都敏感［8］。多數(shù)國家抗PM治療均推薦首選兩性霉素與伊曲康唑的治療方案［9-11］。本實驗菌株R9031分離于一艾滋病合并播散性馬爾尼菲青霉病男性患者，該患者臨床上首先用兩性霉素B靜脈滴注，首日5 mg，每日增加5 mg，至30 mg/d，療程6周，病情控制后改為口服伊曲康唑400 mg/d鞏固治療3個月，完成治療后改為口服伊曲康唑200 mg/d維持，觀察1年內(nèi)無復(fù)發(fā)。該菌株在掃描電鏡和透射電鏡觀察，MIC濃度兩性霉素B作用后72 h開始出現(xiàn)細胞凋亡，而濃度為10倍MIC時細胞損傷出現(xiàn)的時間更早且更明顯，48 h細胞開始凋亡，72 h細胞完全崩解，故馬爾尼菲青霉病應(yīng)早期診斷，盡早應(yīng)用有效、足量抗真菌藥物。體外藥敏試驗結(jié)果顯示，PM對伏立康唑有較高的敏感性［12］。國內(nèi)外文獻報道［13-14］，伏立康唑?qū)︸R爾尼菲青霉病的治療有較滿意效果，而且患者容易耐受。本研究中應(yīng)用MIC及10倍MIC的伏立康唑作用后，經(jīng)掃描電鏡和透射電鏡觀察，對PM臨床株有明顯抗菌作用，與體外藥敏的高度敏感性呈正相關(guān)，提示該藥對馬爾尼菲青霉病的治療也有較大的臨床應(yīng)用前景。對于因兩性霉素B的毒副作用尤其是較嚴(yán)重的肝腎功能損害而不能耐受的馬爾尼菲青霉病患者，伏立康唑可考慮作為代替的治療藥物之一。

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Effects of amphotericin B and voriconazole on ultrastructure of a clinical isolate ofPenicillium marneffei

Zhang Qianying,Liang Ling,Cao Cunwei,Liu Donghua.Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China

ObjectiveTo observe ultrastructural changes in a clinical isolate ofPenicillium marneffei（PM）before and after treatment with amphotericin B or voriconazole by using scanning electron microscopy （SEM）and transmission electron microscopy（TEM）.MethodsA microdilution method was performed to determine the minimum inhibitory concentration（MIC）of amphotericin B and voriconazole against a clinical isolate of PM.Then,the PM isolate was treated with amphotericin B or voriconazole at their MICs and 10-fold MICs for 24,48 and 72 hours.The ultrastructural changes in this isolate before and after the treatment were observed by using SEM and TEM.ResultsAfter the treatment with amphotericin B,SEM showed that the conidia or yeast cells of the PM isolate were gradually damaged,and their outer layers experienced detachment,shrinkage,breakage and adhesion with the increase in treatment duration and concentrations of amphotericin B;TEM also showed degenerated mitochondria,broken nuclei and cell walls,and shrunken cytoplasmic membrane with disappearance of cytoplasmic organelles.Similarly,the damage,shrinkage,shriveling and collapse of PM cells were seen by using SEM,and TEM showed many high-density electron-dense granules in cytoplasm,degeneration of mitochondria,roughening of cell wall surface,damage and shrinkage of cytoplasmic membrane,and disappearance of cytoplasmic organelles after voriconazole treatment.ConclusionsAmphotericin B and voriconazole both had a strong antifungal effect on PM,and could induce evident ultrastructural changes,which were positively associated with treatment duration and concentrations.Moreover,amphotericin B caused more severe damage to PM compared with voriconazole.

Microscopy,electron,scanning;Microscopy,electron,transmission;Amphotericin B;Voriconazole;Penicillium marneffei

Liang Ling,Email:gxmull@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.08.013

國家自然科學(xué)基金（30560143）

梁伶，Email：gxmull@163.com

2014-08-01）

（本文編輯：顏艷）