D2-40/S100、CD34/S100檢測在皮膚惡性黑素瘤脈管轉(zhuǎn)移診斷中的應用

朱小紅 張熔熔

·論著·

D2-40/S100、CD34/S100檢測在皮膚惡性黑素瘤脈管轉(zhuǎn)移診斷中的應用

朱小紅 張熔熔

目的 探討皮膚惡性黑素瘤（CMM）脈管微轉(zhuǎn)移的免疫組化檢測方法及臨床意義。方法 經(jīng)組織病理檢查證實的CMM患者53例，男32例，女21例。年齡52～72（61.2±8.4）歲。每例取腫瘤中心部位的瘤組織，部分病例包括清掃淋巴結(jié)標本。平均隨訪時間（65.00±5.68）個月。隨訪期間17例患者死于CMM復發(fā)或轉(zhuǎn)移，6例失訪。采用組合式單克隆抗體和雙酶標記的免疫組化雞尾酒法檢測53例CMM標本，在同一張組織切片上檢測D2-40、S100、CD34抗原的表達情況。結(jié)果 53例CMM患者，HE染色+組合式單克隆抗體陽性16例（30.19%），雙酶標記的免疫組化雞尾酒法陽性26例（49.06%），兩種方法的陽性率差異有統(tǒng)計學意義（χ2=3.94，P＜0.05）。血管淋巴管瘤栓組26例中21例（80.77%）、無瘤栓組27例中10例（37.04%）有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，兩組差異有統(tǒng)計學意義（χ2=10.43，P＜0.001）；血管淋巴管瘤栓組與同期無血管淋巴管瘤栓組5年生存率分別為42.31%（11/26）與70.37%（19/27）（χ2=4.25，P＜0.05）。結(jié)論 免疫組化雞尾酒法檢測在診斷血管和淋巴管瘤栓上優(yōu)于HE+組合式單克隆抗體檢查，血管和淋巴瘤栓是CMM患者的重要預后因素。

黑色素瘤；淋巴轉(zhuǎn)移；S100蛋白質(zhì)類；抗原，CD34；D2-40；免疫組化雞尾酒法

隨著皮膚惡性黑素瘤（CMM）臨床病理研究的不斷深入，微小轉(zhuǎn)移灶（亞臨床病灶）的治療日益受到重視。本文用組合式單克隆抗體和雙酶標記的免疫組化雞尾酒法檢測CMM標本特異性淋巴管標記物（D2-40）、S100蛋白、CD34內(nèi)皮細胞標記（CD34）抗原的表達情況，分析了淋巴管/血管瘤栓與CMM治療及預后的相關(guān)性，并比較了上述二種方法對CMM腫瘤中及其腫瘤周圍淋巴管、血管瘤栓檢出率以及檢出率高低與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

資料與方法

一、病例資料

研究對象為2005年1-12月無錫市第二人民醫(yī)院普外科及皮膚科行CMM手術(shù)切除的病例，共53例，其中男32例，女21例。年齡52～72（61.2±8.4）歲。每例取腫瘤中心部位的瘤組織，部分病例包括清掃淋巴結(jié)標本。所有病例均經(jīng)病理證實。隨訪期末為2010年12月31日，平均隨訪時間（65.00±5.68）個月。隨訪期間17例患者死于CMM復發(fā)或轉(zhuǎn)移，6例失訪。17例死亡患者最短生存時間為7個月，最長生存時間70個月。

二、染色方法

將所有石蠟標本連續(xù)4 μm切片6張。3張采用組合式單克隆抗體和2張采用雙酶標記的免疫組化雞尾酒法檢測D2-40、S100、CD34抗原的表達情況，1張行HE染色。試劑均為福建邁新生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，有單染試劑盒和雙染試劑盒，染色方法為SP法。全部標本均用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照，采用該公司提供的已知CMM組織切片作陽性對照，操作步驟根據(jù)試劑盒說明書操作。

三、結(jié)果判斷

D2-40陽性染色位于淋巴管內(nèi)皮細胞胞膜和胞質(zhì)內(nèi)，為棕黃色顆粒；免疫組化雞尾酒法D2-40為黑色。CD34陽性染色位于血管內(nèi)皮細胞胞膜和胞質(zhì)內(nèi)，為棕黃色顆粒；免疫組化雞尾酒法CD34為黑色；血管、淋巴管為由內(nèi)皮細胞形成的條狀、裂隙狀、管狀等孤立或簇狀結(jié)構(gòu)。S100陽性表達為腫瘤細胞胞質(zhì)或胞核被染成棕黃色；免疫組化雞尾酒法S100為紅色。CMM組織D2-40/S100、CD34/S100雞尾酒染色顯示，D2-40、CD34陽性物質(zhì)分別定位于淋巴管、血管內(nèi)皮細胞的胞膜和胞質(zhì)，腫瘤細胞表達S100，在部分D2-40、CD34陽性的淋巴管、血管內(nèi)觀察到S100陽性的腫瘤細胞團，作為判斷淋巴管、血管內(nèi)瘤栓的依據(jù)。

HE染色明確血管或淋巴管，結(jié)合單克隆抗體免疫組化染色該血管或淋巴管內(nèi)確實為S100陽性的腫瘤細胞；或HE染色明確腔內(nèi)為腫瘤細胞，結(jié)合單克隆抗體免疫組化染色證實該腫瘤細胞位于CD34陽性的血管或D2-40陽性的淋巴管內(nèi)，則認為該血管或淋巴管內(nèi)有瘤栓。

四、統(tǒng)計學方法

應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件包分析處理。兩組間的比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

53例CMM患者中，HE染色+單克隆抗體免疫組化陽性16例（30.19%），雙酶標記的免疫組化雞尾酒法陽性26例（49.06%），兩種方法的陽性率差異有統(tǒng)計學意義（χ2=3.94，P＜0.05）。27例無血管淋巴管瘤栓的患者中有10例（37.04%）已有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而26例有血管淋巴管瘤栓的患者中21例（80.77%）有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，血管淋巴管瘤栓組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率顯著高于無瘤栓組（χ2=10.43，P＜0.001）。見表1。

26例有血管淋巴管瘤栓患者中，血管內(nèi)瘤栓3例，5年后無1例生存；淋巴管內(nèi)瘤栓18例，5年后11例生存；血管及淋巴管內(nèi)均有瘤栓5例，5年后無1例生存。血管瘤栓患者的5年生存率為0，淋巴管瘤栓患者為66.11%。

血管淋巴管瘤栓組26例5年生存率為42.31%（11/26），無血管淋巴管瘤栓組27例為70.37%（19/27），兩組差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.25，P ＜ 0.05）。見表1。

討 論

文獻報道［1］，CMM的預后除了與腫瘤的厚度、部位、組織學類型、患者性別以及有無潰瘍有密切關(guān)聯(lián)以外，血管和淋巴管浸潤也是CMM患者預后的重要因素，血管浸潤與患者的生存率顯著相關(guān)。由于血管、淋巴管內(nèi)腫瘤細胞數(shù)量較少且無任何臨床表現(xiàn)，常規(guī)的影像學、病理學檢查難以發(fā)現(xiàn)，因此，應用免疫組化染色區(qū)分血管瘤栓和淋巴管瘤栓具有非常重要的臨床價值。單純的HE染色對區(qū)分淋巴管和小毛細血管帶有主觀性，并受主檢醫(yī)生經(jīng)驗的限制，較難鑒別血管、淋巴管或組織間隙（圖1）。血管和淋巴管相同起源，很多標記物在血管、淋巴管均有表達，長期以來一直缺乏特異性的免疫標記物區(qū)別二者。D2-40是新近發(fā)現(xiàn)的特異性淋巴管標記物［2］，它能特異性地與一種唾液酸糖蛋白M2A結(jié)合，而M2A僅表達于淋巴管內(nèi)皮而不表達于血管內(nèi)皮［3］。CD34是泛血管內(nèi)皮標記物之一，應用廣泛，認為是重復性好、穩(wěn)定性高、較成熟及相對特異和敏感的血管內(nèi)皮標記物。S100是廣譜S100，其敏感性比HMB-45大，染色強，在CMM的診斷中實用性較大，比較適用于檢測常規(guī)病理檢查難以發(fā)現(xiàn)的微轉(zhuǎn)移［4］。

表1 皮膚惡性黑素瘤組織血管淋巴管瘤栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與生存率的關(guān)系

圖1 皮膚惡性黑素瘤組織HE染色觀察（HE×200） 1A、1B：明確為脈管組織，但不能確定其內(nèi)的細胞為腫瘤細胞；1C、1D：明確為腫瘤組織，但不確定其周圍為脈管

免疫組化雙染法觀察不同的抗原成分，步驟繁復，耗時長，需要2次標記，而且反復在一張切片上進行操作容易引起脫片，結(jié)果也欠穩(wěn)定。單染已顯示為血管或淋巴管，不能同時確定腔內(nèi)細胞是否為腫瘤細胞；已顯示腔內(nèi)為腫瘤細胞，不能同時確定腔隙為組織間隙還是脈管（圖2）。雞尾酒標記染色法是針對同一靶組織的不同靶抗原，同步觀察幾種抗原在病變組織中的不同表達情況，較傳統(tǒng)雙染方法縮短了實驗時間，并有效避免了內(nèi)源性生物素的干擾，克服了切片間各種差異引起的時間、空間的樣本誤差，采用抗體組合搭配，結(jié)果穩(wěn)定，且縮減了操作步驟［5］。雞尾酒雙染法可以同時標記血管上皮及腫瘤細胞，如果鏡下排除制片因素造成的假象，則可以明確為血管或淋巴管的轉(zhuǎn)移。本研究設(shè)計的D2-40/S100、CD34/S100雞尾酒雙染法只需在一張切片上同時加2種抗體，一次就能同步標記D-40/S100、CD34/S100各二種抗體，讓我們清晰地看到了血管及淋巴管內(nèi)的腫瘤細胞（圖3），從而能夠及時簡便地給臨床提供診斷。

CMM的轉(zhuǎn)移途徑主要是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，CMM淋巴結(jié)內(nèi)轉(zhuǎn)移與否是判斷CMM生物學行為的重要參考指標之一，并直接影響腫瘤臨床分期的準確性，對預測預后及術(shù)后綜合治療具有重要的指導意義［6］。因此是腫瘤根治術(shù)后復發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因之一［7］，是為廣大學者所公認的對CMM的惡性度判斷最有意義的標準。

腫瘤的淋巴管浸潤是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的前提，常規(guī)診斷很困難。本實驗中，在CMM中心區(qū)、周邊區(qū)均可見D2-40染色陽性的淋巴管分布（圖2A）。如果淋巴管中查見S100染色陽性的腫瘤細胞，表明這些淋巴管內(nèi)已有瘤栓形成，腫瘤侵犯血管。提示CMM淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能主要是通過瘤組織邊緣區(qū)淋巴管引起的。D2-40/S100抗體雞尾酒法在一張切片上清楚地觀察到腫瘤細胞S100蛋白的表達情況（圖3A、3B）、腫瘤微淋巴管密度以及淋巴管侵犯的情況，提供的結(jié)果信息量大，標記結(jié)果易于判斷，可更直觀清晰地辨別腫瘤細胞和淋巴管的關(guān)系，易于檢出被腫瘤侵犯的微淋巴管。同樣，CD34/S100抗體雞尾酒法在一張切片上清楚地觀察到腫瘤細胞S100蛋白在血管內(nèi)的表達情況（圖3C、3D），說明腫瘤侵犯血管。雞尾酒標記染色法的陽性檢出率明顯高于HE染色組合單克隆抗體染色法，該方法的建立對于進一步探討CMM血管淋巴管轉(zhuǎn)移的特點、評估患者的預后，指導臨床術(shù)后治療均有幫助。

圖2 皮膚惡性黑素瘤組織免疫組化單染法觀察（免疫組化SP法×200） 2A：D2-40顯示淋巴管陽性，不能明確其內(nèi)細胞是否為腫瘤細胞；2B：CD34顯示血管陽性，不能確定其內(nèi)細胞是否為腫瘤細胞；2C、2D：S100顯示腫瘤組織陽性，不能確定其是否在脈管內(nèi)

圖3 皮膚惡性黑素瘤組織D2-40/S100、CD34/S100雞尾酒染色觀察（雞尾酒雙染SP法×200） 3A、3B：D2-40顯示淋巴管陽性，S100顯示腫瘤細胞陽性；3C、3D：CD34顯示血管陽性，S100顯示腫瘤細胞陽性

本試驗中我們觀察到，檢測出血管淋巴管瘤栓的26例患者中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的為21例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者明顯高于無血管淋巴管瘤栓的患者。26例血管淋巴管瘤栓患者中8例累及血管的患者5年后無1例生存，提示腫瘤周圍血管淋巴管瘤栓對惡性黑素瘤患者的預后有一定的影響［8］，它的存在提示外科治療中淋巴結(jié)清掃的重要意義，淋巴管內(nèi)見到瘤栓，其臨床意義等同于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，血管內(nèi)查見瘤栓是CMM預后差的指標之一。

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2015年英夫利西單抗（類克?）臨床應用有獎征文通知

銀屑病是一種慢性復發(fā)性炎癥性皮膚病，其患病率呈上升趨勢，估計中國至少有600萬銀屑病患者。隨著科學的進步和對疾病的認識，生物制劑已經(jīng)成為治療銀屑病的新選擇。為了促進皮膚科醫(yī)師對生物制劑的認識和交流，西安楊森制藥有限公司與中華皮膚科雜志編輯部聯(lián)合舉辦英夫利西單抗（類克?）臨床應用有獎征文活動。2014年征文收到數(shù)十篇高質(zhì)量的文章，將擇優(yōu)刊登在中華皮膚科雜志上。本次征文活動得到皮膚科醫(yī)師的歡迎，因此，從2015年繼續(xù)進行有獎征文活動，旨在與皮膚科醫(yī)生攜手，交流生物制劑治療銀屑病的經(jīng)驗，共同促進銀屑病治療的發(fā)展。

一、征文范圍：英夫利西單抗治療重度斑塊型銀屑病的圖片和內(nèi)容展示。

二、征文要求：①未在公開出版的雜志上發(fā)表，未在全國性學術(shù)會議上交流；②應征論文寫作格式請參考中華皮膚科雜志稿約要求；③至少提供患者3組照片，治療前、2周、6周的照片；④請注明第一作者姓名、單位、職稱、地址、郵編、電子郵箱以及聯(lián)系電話；⑤只接受電子郵箱投稿（Word排版），征文電子版發(fā)至郵箱beauty_life2014@163.com，并注明“美麗人生征文”字樣。所有征文恕不退稿，請自留底稿。征文截稿時間：2015年9月30日。

三、評選方法和獎項設(shè)置：由知名專家及相關(guān)專業(yè)專家組成評審委員會，對征文稿件進行評審。獎項設(shè)置：獲前10名文章作者，資助第一作者參加2016年中華醫(yī)學會皮膚性病學學術(shù)年會；其余參與投稿第一作者，均贈閱中華皮膚科雜志2016年全年雜志。

2015年全國皮膚外科、抗衰老及美容學習班通知

為提高皮膚美容及皮膚老化治療水平，由中國中西醫(yī)結(jié)合學會皮膚性病學專業(yè)委員會、中國整形美容協(xié)會抗衰老分會主辦，重慶市中醫(yī)院暨重慶市第一人民醫(yī)院承辦的全國皮膚外科、抗衰老及美容學習班，定于2015年5月15-17日在重慶市舉辦。屆時將邀請國內(nèi)知名專家趙啟明、刁慶春、方方等教授就皮膚美容外科的基礎(chǔ)及臨床進行系統(tǒng)講座。學習內(nèi)容涉及皮膚腫瘤、瘢痕與瘢痕疙瘩、皮膚老化、注射微美容、激光、光動力技術(shù)的應用等。學習結(jié)束經(jīng)考核合格后，頒發(fā)中國中西醫(yī)結(jié)合學會皮膚性病專業(yè)委員會、中國整形美容協(xié)會抗衰老分會皮膚外科、抗衰老及美容學習班結(jié)業(yè)證書，并授予國家級Ⅰ類繼續(xù)醫(yī)學教育學分。學習班聯(lián)系人：蒲楊 13996088144，Email：1354468542@qq.com，汪蓉 13883103189，Email：gyz917@126.com。

Application of D2-40/S100 and CD34/S100 detection in the diagnosis of blood and lymphatic vessel invasion of cutaneous malignant melanoma

Zhu Xiaohong,Zhang Rongrong.Department of Dermatology,Wuxi No.2 People′s Hospital,Wuxi 214002,Jiangsu,China

Zhang Rongrong,Email:852718606@qq.com

ObjectiveTo develop an immunohistochemical assay for the diagnosis of cutaneous malignant melanoma（CMM）micrometastasis via blood and lymphatic vessels,and to evaluate its clinical significance.MethodsFifty-three patients （32 males and 21 females）histopathologically diagnosed as CMM were enrolled in this study.The patients were aged （61.2±8.4）years（range,52－72 years）.Tissue specimens were obtained from the central area of tumor in each case,and also from removed lymph nodes in some cases.The average duration of follow-up was（65.00±5.68）months.During the follow-up,17 patients died of the recurrence or metastasis of CMM,and 6 patients were lost to follow-up.The expressions of D2-40,S100 and CD34 antigens in 53 tissue specimens were examined by immunohistochemical staining with three individual monoclonal antibodies,or by an immunohistochemical method using 2 two-antibody cocktails （D2-40/S100 and CD34/S100）and double-color chromogens in single tissue sections.ResultsOf the 53 patients,30.19% （16/53） were positive for hematoxylin-eosin （HE） staining combined with immunohistochemical staining with individual monoclonal antibodies,and 49.06%（26/53）for the immunohistochemical method using two-antibody cocktails and double-color chromogens.Statistical differences were found in the positive rate between the two methods（χ2=3.94,P＜0.05）.Compared with patients without blood/lymph vessel tumor emboli,those with blood/lymph vessel tumor emboli showed higher lymph node metastasis rate（80.77%（21/26）vs.37.04%（10/27）,χ2=10.43,P ＜ 0.001）,but lower five-year survival rate （42.31% （11/26）vs.70.37% （19/27）,χ2=4.25,P ＜ 0.05）.ConclusionsThe immunohistochemical method with two-antibody cocktails is superior to HE staining combined with immunohistochemical staining with individual monoclonal antibodies in the detection of blood/lymph vessel tumor emboli.And blood/lymph vessel tumor emboli may be an important prognostic factor in patients with CMM.

Melanoma;Lymphatic metastasis;S100 proteins;Antigens,CD34;D2-40;Immunohistochemical method with antibody cocktails

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.04.012

214002江蘇，無錫市第二人民醫(yī)院皮膚科

張熔熔，Email：852718606@qq.com

2014-09-01）

（本文編輯：顏艷）