miR-203及其下游靶基因p63、生存素在銀屑病皮損中的表達(dá)

許功軍 蔡綏勍

·論著·

miR-203及其下游靶基因p63、生存素在銀屑病皮損中的表達(dá)

許功軍 蔡綏勍

目的 檢測尋常性銀屑病皮損中miR-203及其下游靶基因p63、生存素的表達(dá)水平。方法 實(shí)時(shí)PCR法檢測30例尋常性銀屑病患者皮損及30例健康對(duì)照皮膚中miR-203、p63、生存素mRNA的表達(dá)水平，miR-203以U6為內(nèi)參照，p63和生存素以GAPDH為內(nèi)參照；Western印跡法檢測靶基因p63、生存素蛋白表達(dá)水平，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，尋常性銀屑病皮損中miR-203與生存素、p63表達(dá)的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。結(jié)果 與健康對(duì)照皮膚相比，尋常性銀屑病皮損中miR-203 mRNA表達(dá)量為對(duì)照組的（0.41±0.11）倍，表達(dá)明顯下調(diào)（t=3.16，P＜0.05）；其靶基因 p63、生存素 mRNA表達(dá)量分別為對(duì)照組的（4.79±0.63）和（3.43±0.46）倍，表達(dá)水平明顯上調(diào)（t值分別為4.72、4.35，均P＜0.05）；靶基因p63、生存素蛋白表達(dá)量分別為對(duì)照組的（2.40±0.23），（3.49± 0.14）倍，表達(dá)水平也明顯上調(diào)（t值分別為 3.87、4.36，均 P ＜0.05）。尋常性銀屑病皮損中miR-203 mRNA 與生存素 mRNA 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.36，P＜0.05），與 p63 mRNA 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.43，P＜0.05）。結(jié)論 miR-203及其下游靶基因p63、生存素可能參與了銀屑病的發(fā)病過程。

銀屑??；miR-203；基因，p63；生存素

銀屑病的確切病因尚未明確，以往的研究證實(shí)，凋亡抑制基因生存素和p63在尋常性銀屑病皮損中高表達(dá)［1-2］，且參與角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖等病理過程，但其具體的調(diào)控機(jī)制不清。miRNA廣泛存在于哺乳動(dòng)物基因組中，具有高度的保守性，在腫瘤、炎癥等疾病的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用［3］。根據(jù)5′端序列不同，miRNA可分為多個(gè)家族，無法劃分為一個(gè)家族的稱為孤兒miRNA，其中miR-203位于14q32.33，在上皮組織特異性表達(dá)，參與皮膚發(fā)育、穩(wěn)態(tài)及功能維持，是皮膚中重要的調(diào)控因子［4］。此外，miR-203在上皮組織腫瘤中有抑癌和促凋亡作用，參與上皮來源腫瘤的發(fā)生［5］。miR-203為生存素和p63上游重要的調(diào)控基因［6-7］。本研究檢測尋常性銀屑病皮損組織中miR-203、生存素和p63 mRNA及蛋白的表達(dá)水平，探討尋常性銀屑病皮損中p63和生存素基因表達(dá)上調(diào)的原因。

材料和方法

一、臨床資料

收集2013年1-12月我科病理室保存的30例尋常性銀屑病患者皮損蠟塊標(biāo)本。其中男15例，女15例，年齡17～56歲，平均年齡30.1歲。部位包括四肢19例，頭面部1例，胸背部10例。另選取30例健康人皮膚為對(duì)照組，兩組在年齡、性別、取材部位上相匹配。本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有銀屑病患者與健康人對(duì)照組均簽署知情同意書。

二、材料與試劑

石蠟組織miRNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)公司），一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒（美國羅氏公司），引物（上海吉瑪生物技術(shù)公司），DEPC及RNA-free水（北京索萊寶生物技術(shù)公司），氯仿、異丙醇、無水乙醇等均為分析純（國藥集團(tuán)上海試劑公司），鼠抗人p63、生存素、β肌動(dòng)蛋白多克隆抗體（英國Abcam公司）；HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗（中杉金橋公司）；苯甲基磺酰氟（PMSF）、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL顯色試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.總RNA和miRNA提?。喝コ龢?biāo)本周圍盡量多的石蠟，10 μm連續(xù)切片，取4張切片裝入1個(gè)無RNase的Ep管中，二甲苯脫蠟，無水乙醇洗滌并晾干，后續(xù)提取步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。應(yīng)用微量紫外分光光度計(jì)測定總RNA的純度和濃度。

2.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測miR-203、生存素及p63 mRNA的表達(dá)：采用一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用20 μl反應(yīng)體系，具體參見試劑盒說明書，miRNA的反轉(zhuǎn)錄采用加尾。SYBR green I染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)，取1 μl上述cDNA為模板，miR-203以U6作為內(nèi)參照，生存素和p63以GAPDH作為內(nèi)參照。每個(gè)檢測樣本做3個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)熱 3 min；95℃ 12 s，60℃40 s，40個(gè)循環(huán)。ΔCt值=目的基因Ct值-同組內(nèi)參Ct值，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)-ΔCt對(duì)照。以對(duì)照組目的基因表達(dá)量為1，2-ΔΔCt值即為實(shí)驗(yàn)組目的基因較對(duì)照組目的基因表達(dá)的倍數(shù)。

3.Western印跡法檢測生存素及p63蛋白的表達(dá)水平：同一批健康對(duì)照組新鮮皮膚組織和銀屑病患者新鮮皮損組織中加入含1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液，經(jīng)玻璃勻漿器勻漿直至充分裂解。14 000×g離心5 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度。以30 μg上樣量經(jīng)SDS-PAGE膠電泳（濃縮膠80 V、分離膠120 V），以200 mA恒流1.5 h濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，鼠抗人p63、生存素、β肌動(dòng)蛋白多克隆抗體4℃孵育過夜（工作濃度1∶1 000），TBST洗膜 3次，每次 10 min。加入 HRP標(biāo)記的二抗（1∶5 000）孵育 1 h，TBST洗膜 3次，每次10 min，ECL法顯色。Image J分析軟件分析目的蛋白條帶的平均灰度值，以β肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參，以目的蛋白與β肌動(dòng)蛋白的灰度比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，miR-203、生存素、p63的表達(dá)水平以±s表示，兩組之間的差異比較采用t檢驗(yàn)，應(yīng)用Pearson相關(guān)性分析，分析miR-203 miRNA表達(dá)與生存素miRNA、p63 miRNA表達(dá)之間的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、miR-203、生存素、p63 mRNA在尋常性銀屑病皮損中的表達(dá)水平

銀屑病皮損中miR-203 mRNA表達(dá)量為對(duì)照組的0.41±0.11倍，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.16，P＜0.05）。生存素和p63 mRNA在銀屑病皮損中的表達(dá)量分別為對(duì)照組的3.43±0.46和4.79±0.63倍，兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為 4.35、4.72，均 P＜0.05）。經(jīng) Pearson相關(guān)性分析，miR-203 mRNA與生存素mRNA呈負(fù)相關(guān)（r=-0.36，P＜0.05），與 p63 mRNA 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.43，P ＜ 0.05）。

二、靶基因生存素、p63蛋白在尋常性銀屑病皮損中的表達(dá)水平

生存素和p63蛋白在銀屑病皮損中的表達(dá)量分別為對(duì)照組的3.49±0.14和2.40±0.23倍，經(jīng)t檢驗(yàn)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為4.36、3.87，均 P ＜ 0.05）。見圖 1。

討 論

miRNA是內(nèi)源性非蛋白編碼單鏈小分子RNA，主要功能為轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)，參與基因表達(dá)的調(diào)控過程，從而在細(xì)胞分化、增殖、凋亡、抗病毒及腫瘤免疫中發(fā)揮作用［3］，miRNA對(duì)其靶基因的調(diào)節(jié)障礙會(huì)導(dǎo)致不同疾病的發(fā)生［8］。miR-203是一種具有高度皮膚特異性的miRNA，明顯表達(dá)于表皮基底層，通過抑制增殖潛能、誘導(dǎo)細(xì)胞周期退出，促進(jìn)表皮的分化［4-5］，其低表達(dá)于銀屑病皮損中，這與本研究的結(jié)果一致。

圖1 Western印跡法檢測尋常性銀屑病皮損與健康對(duì)照組皮膚組織中生存素以及p63蛋白的相對(duì)表達(dá)量 上圖為Western印跡結(jié)果，下圖為相對(duì)灰度值的柱狀圖。與對(duì)照組相比，尋常性銀屑病皮損中生存素和p63表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）

生存素和p63都是miR-203進(jìn)化保守的靶基因。生存素主要在細(xì)胞周期G2/M期表達(dá)，定位于細(xì)胞有絲分裂的紡錘體，具有促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的作用［9］。此外，生存素還可以直接抑制各種凋亡途徑的終末效應(yīng)蛋白Caspase-3和Caspase-7，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用［10］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，尋常性銀屑病皮損中生存素mRNA的表達(dá)水平較健康對(duì)照皮膚組織明顯上調(diào)，這與國內(nèi)外的研究結(jié)果均一致［11-14］。生存素的高表達(dá)與銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖和分化有關(guān)，同時(shí)參與了真皮乳頭層毛細(xì)血管的增生、擴(kuò)張［15］。p63基因是腫瘤抑制基因p53家族成員之一，其在細(xì)胞死亡、分化、腫瘤發(fā)生中扮演重要角色，在維持表皮干細(xì)胞和表皮的分層中發(fā)揮較大作用［16］，控制著角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和分化。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p63在銀屑病皮損中表達(dá)上調(diào)，這與國外的研究結(jié)果一致［17-18］，有研究表明，p63基因可能參與銀屑病的早期階段，并與表皮突的延伸相關(guān)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，miR-203 mRNA的表達(dá)水平與生存素mRNA的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，與p63 mRNA的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，由此推測，miR-203的異常表達(dá)可能導(dǎo)致生存素和p63基因表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，抑制其凋亡，參與皮損的形成過程。

綜上所述，miR-203可能通過調(diào)控其下游靶基因生存素、p63的異常表達(dá)參與尋常性銀屑病皮損的形成過程。

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Expressions of miR-203 and its downstream target genes p63 and survivin in psoriatic lesions

Xu Gongjun,Cai Suiqing*.*Department of Dermatology,Second Affiliated Hospital,Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou 310009,China

Cai Suiqing,Email:caisuiqing@163.com

ObjectiveTo measure the expressions of miR-203 and its downstream target genes p63 and survivin in psoriasis vulgaris lesions.MethodsTissue specimens were collected from lesions of 30 patients with psoriasis vulgaris and normal skin of 30 healthy human controls.Real-time PCR was performed to detect miR-203 mRNA expression with U6 as the internal control,as well as p63 and survivin mRNA expressions with glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）as the internal control,and Western blot to measure the protein expressions of miR-203 targets p63 and survivin.Statistical analysis was carried out byttest for intergroup comparisons and by Pearson correlation analysis for the analysis of correlation between miR-203,p63 and survivin expressions in psoriasis vulgaris lesions.ResultsCompared with the normal control skin,psoriasis vulgaris lesions showed significantly decreased mRNA expression level（2-△△C）tof miR-203（0.41±0.11,t=3.16,P＜0.05）,but increased mRNA expression levels of p63（4.79±0.63,t=4.72,P＜0.05）and survivin（3.43±0.46,t=4.35,P＜0.05）.The protein expression levels of p63 and survivin in these lesions were（2.40 ± 0.23）times（t=3.87,P ＜ 0.05）and（3.49 ± 0.14）times（t=4.36,P ＜ 0.05）those in the normal control skin respectively.In psoriasis vulgaris lesions,the mRNA expression level of miR-203 showed a significantly negative correlation with that of survivin （r=-0.36,P＜0.05）and p63 （r=-0.43,P＜0.05）.ConclusionmiR-203 and its downstream target genes p63 and survivin may participate in the occurrence of psoriasis vulgaris.

Psoriasis;MiR-203;Genes,p63;Survivin

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.04.005

310009杭州，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院皮膚科［許功軍（現(xiàn)在浙江省金華市第五醫(yī)院，321000）、蔡綏勍］

蔡綏勍，Email：caisuiqing@163.com

2015-01-28）

（本文編輯：顏艷）