氨基酮戊酸光動力療法誘導(dǎo)中波紫外線應(yīng)激性衰老成纖維細(xì)胞發(fā)生凋亡

張麗超 張海榮 周炳榮 駱丹 馬立文 張家安 王申 易飛 Maya Valeska Gozali劉娟

·論著·

氨基酮戊酸光動力療法誘導(dǎo)中波紫外線應(yīng)激性衰老成纖維細(xì)胞發(fā)生凋亡

張麗超 張海榮 周炳榮 駱丹 馬立文 張家安 王申 易飛 Maya Valeska Gozali劉娟

目的 研究氨基酮戊酸光動力療法（ALA-PDT）對中波紫外線（UVB）應(yīng)激性衰老成纖維細(xì)胞（UVB-SIPS-FB）的氧化損傷和凋亡作用。方法 正常成纖維細(xì)胞及UVB-SIPS-FB均分為2 h和6 h孵育組，每組內(nèi)再分為7組：對照組、ALA組、100 J/cm2照光組、3組不同紅光照射劑量ALA-PDT處理組（25 J/cm2組、50 J/cm2組、100 J/cm2組）及抗氧化劑NAC+50 J/cm2紅光照射ALA-PDT處理組。采用635 nm紅光（能量密度50 mW/cm2）照射處理后，使用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞中活性氧及線粒體膜電位水平；Hoechst染色、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件分析，多組間均數(shù)行單因素方差分析，結(jié)合q檢驗。結(jié)果 孵育2 h，25、50、100 J/cm2ALA-PDT組UVB-SIPS-FB凋亡率（分別為7.34%±0.87%、8.39%±1.16%、17.03% ±1.29%）較對照組（3.81% ±0.59%）上升（F=102.70，均 P＜0.05），NAC+50 J/cm2ALA-PDT組凋亡率（5.35%±0.58%）下降（P＜0.05）；孵育 6 h，25、50、100 J/cm2ALA-PDT組UVB-SIPS-FB 凋亡率（分別為 13.85%±1.71%、23.40% ±2.14%、41.02% ±2.73%）較對照組（5.09% ±1.64%）顯著上升（F=106.00，均 P＜0.05），NAC+50 J/cm2ALA-PDT組凋亡率（9.97%±3.23%）顯著下降（P＜0.05）。單純ALA組或照光組UVB-SIPS-FB凋亡率與對照組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。ALA-PDT處理組細(xì)胞活性氧熒光強度顯著上升，線粒體去極化增強，這些現(xiàn)象與ALA孵育時間及紅光照射劑量均呈量效依賴性關(guān)系。使用抗氧化劑NAC預(yù)處理可以減少ALA-PDT誘導(dǎo)的活性氧增多及線粒體去極化增強，與凋亡率變化一致。結(jié)論 ALA-PDT可誘導(dǎo)UVB-SIPS-FB出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡，其作用機制可能與ALA-PDT對細(xì)胞的氧化損傷有關(guān)。

氨基酮戊酸；紫外線；成纖維細(xì)胞；細(xì)胞衰老；光化學(xué)療法；氧化性應(yīng)激；細(xì)胞凋亡

皮膚光老化主要由日光中的紫外線長期照射引起，表現(xiàn)為皮膚曝光部位出現(xiàn)不規(guī)則色素斑、深皺紋、毛孔粗大、毛細(xì)血管擴張以及皮膚松弛等。Varani等［1］發(fā)現(xiàn)，光老化皮膚中正常成纖維細(xì)胞（FB）數(shù)目減少，代之以老化FB，細(xì)胞合成膠原能力降低，基質(zhì)降解成分增多，導(dǎo)致皮膚松弛，出現(xiàn)皺紋。近年臨床證明，氨基酮戊酸光動力療法（aminolevulinic acid photodynamic therapy，ALAPDT）具有嫩膚效應(yīng)，可用于治療皮膚光老化［2-4］。Park 等［5］發(fā)現(xiàn)，ALA-PDT 能使表皮厚度減少，真皮膠原增加。一般認(rèn)為，ALA-PDT治療的原理為外敷ALA吸收后在組織內(nèi)轉(zhuǎn)化成光敏劑原卟啉IX（PpIX），特定波長激光照射后，產(chǎn)生大量活性氧簇（ROS），調(diào)節(jié)細(xì)胞脂質(zhì)過氧化和血管反應(yīng)，產(chǎn)生直接或間接的細(xì)胞毒性效應(yīng)，造成病變細(xì)胞凋亡［6］。鑒于光老化FB在皮膚光老化中的重要作用，本實驗以中波紫外線（UVB）誘導(dǎo)的衰老FB（UVB-SIPS-FB）作為光老化細(xì)胞模型，間接探討ALA-PDT對光老化皮膚FB的影響。

材料和方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)、試劑和儀器

人皮膚成纖維細(xì)胞（HSF）取自成年健康男性包皮組織。37℃，5%CO2條件下用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。取5～10代對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗，細(xì)胞每天換液1次；UVB照射組每次照射前用磷酸鹽緩沖液（PBS）替換培養(yǎng)基，照射后換含1%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)5 d，每日1次照射UVB，培養(yǎng)板距燈管15 cm，每次劑量為10 mJ/cm2，總劑量為50 mJ/cm2，劑量設(shè)置參照文獻(xiàn)［7］。

ALA粉劑（118mg/瓶，上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥有限公司），細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（美國BD公司），CCK-8試劑盒、ROS檢測試劑盒、NAC抗氧化劑、羅丹明123、細(xì)胞凋亡-Hoechst染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所）；SS-04P型UVB臺式紫外線光療儀及UVB輻照度監(jiān)視器（上海希格瑪高技術(shù)有限公司）；XD-635AB型光動力激光治療儀（波長635 nm，上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司）。

二、熒光顯微鏡觀察

將密度約為2×105/ml正常FB及UVB-SIPS-FB接種于6 cm培養(yǎng)皿培養(yǎng)24 h，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS漂洗3遍。正常FB及UVB-SIPS-FB均分為2 h和6 h孵育組，每組內(nèi)再分為7組：對照組（無ALA無紅光照射）、ALA組（單純ALA孵育，無紅光）、100 J/cm2照光組（單純紅光，無ALA）、3組ALAPDT 處理組（25 J/cm2組、50 J/cm2組、100 J/cm2組）及NAC組（ALA孵育后于照光前1 h加入5 mmol/L NAC，再予50 J/cm2紅光照射）。ALA溶液為現(xiàn)配的1 mmol/L ALA+DMEM培養(yǎng)液，按上述分組分別避光培養(yǎng)2 h或6 h后，棄去培養(yǎng)液，PBS漂洗3遍，加入1 ml PBS防止干涸，采用635 nm紅光照射，距離細(xì)胞10 cm，功率50 mW/cm2，光照后棄去原培養(yǎng)液，PBS洗3遍，吸盡液體，嚴(yán)格按照說明書要求進行以下各項檢測。

1.ROS檢測：采用原位裝載探針的方法，以1∶1 000比例稀釋相應(yīng)探針，每皿加入1 ml稀釋液，37℃避光孵育20 min。用PBS洗滌細(xì)胞3次，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.線粒體膜電位（MMP）檢測：采用羅丹明123染色法，每皿加入1 ml稀釋液，終濃度為1 μmol/L，37℃避光孵育30 min。用PBS洗滌細(xì)胞3次，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

3.Hoechst染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)變化：加入0.5 ml固定液，10 min后去固定液，PBS洗2遍，加入0.5 ml Hoechst 33258染色液染色5 min。去染色液，PBS洗2遍，吸盡液體，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

三、流式細(xì)胞儀定量檢測

將密度約為5×106/ml細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)貼壁。上述分組后各加入培養(yǎng)液10 ml，避光培養(yǎng)6 h后，棄去培養(yǎng)液，PBS漂洗3遍，加入5 ml PBS防止干涸，采用635 nm紅光，距離細(xì)胞10 cm，照射功率密度50 mW/cm2，光照后棄去原培養(yǎng)液，PBS洗3遍，吸盡液體，消化離心收集細(xì)胞于15 ml離心管中，根據(jù)上述染色方法，分別上機檢測細(xì)胞ROS、MMP的平均熒光強度。激發(fā)波長設(shè)為488 nm，發(fā)射波長設(shè)為525 nm。

Annexin V/PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡率：分別用100 μl的標(biāo)記溶液重懸各組收集的細(xì)胞，室溫下避光孵育15 min，離心收集細(xì)胞并去上清。加入熒光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20 min，避光并不停振動，上機檢測，計算Annexin V和PI雙標(biāo)的細(xì)胞分群作為凋亡細(xì)胞。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 13．0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，采用單因素方差分析，結(jié)合q檢驗，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、細(xì)胞內(nèi)ROS、MMP的變化

ALA孵育2 h或6 h，正常FB及UVB-SIPS-FB兩種細(xì)胞ALA-PDT組ROS、MMP熒光強度均高于各自對照組（P ＜ 0．05），加入 NAC 后，熒光強度降低，與各自50 J/cm2ALA-PDT組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；ALA組及100 J/cm2照光組與對照組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0．05）。

ALA孵育2 h后予紅光照射，正常FB及UVBSIPS-FB兩組內(nèi)25 J/cm2與50 J/cm2ALA-PDT組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），當(dāng)光照強度增至100 J/cm2，兩組內(nèi)ROS、MMP熒光強度均較50 J/cm2時增大（P ＜ 0.05）；光照強度為 50 J/cm2，UVB-SIPSFB組細(xì)胞內(nèi)ROS低于正常FB組（P＜0.05）；光照強度為 25 J/cm2或 100 J/cm2，正常 FB和 UVBSIPS-FB組細(xì)胞內(nèi)ROS差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表 1。

ALA孵育6 h后予紅光照射，隨著照光劑量增大，正常FB及UVB-SIPS-FB組細(xì)胞內(nèi)ROS、MMP熒光強度均較各自對照組有升高；相同照光劑量下，正常FB組細(xì)胞內(nèi)ROS、MMP熒光強度均高于UVB-SIPS-FB組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。見表1。

同一照光劑量下，正常FB或UVB-SIPS-FB組內(nèi)，6 h ALA孵育組細(xì)胞內(nèi)ROS、MMP水平均高于各自2 h孵育組（P＜0.05）。見表1。

二、ALA-PDT對細(xì)胞凋亡的影響

熒光顯微鏡下，對照組與ALA組及100 J/cm2照光組Hoechst染色細(xì)胞核呈均勻淡染藍(lán)色，ALAPDT組觀察到呈致密濃染的凋亡細(xì)胞核，且隨著ALA孵育時間延長、光照劑量增加，細(xì)胞凋亡特征越明顯，比例也越高；加入NAC后，細(xì)胞凋亡受到抑制。孵育6 h ALA-PDT組可見凋亡細(xì)胞顯著增多，細(xì)胞核染色質(zhì)固縮明顯，呈致密濃染。見圖1。

流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，正常FB及UVB-SIPS-FB在ALA-PDT組凋亡率均高于各自對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；加入NAC后，凋亡率下降。與對照組相比，ALA組、100 J/cm2照光組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。ALA孵育正常FB及UVBSIPS-FB 2 h后予紅光照射，光照強度為25 J/cm2或50 J/cm2，兩種細(xì)胞差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；當(dāng)增至100 J/cm2，兩種細(xì)胞凋亡率均較50 J/cm2時上升（P＜0.05）。ALA孵育6 h后予紅光照射，隨著照光劑量增大，正常FB及UVB-SIPS-FB細(xì)胞凋亡率均上升；相同照光劑量下，正常FB組細(xì)胞凋亡率均高于UVB-SIPS-FB組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。同一照光劑量下，正常FB或UVB-SIPS細(xì)胞組內(nèi)，6 h ALA孵育組細(xì)胞細(xì)胞凋亡率均高于各自2 h孵育組（P＜0.05）。見表1。

表1 氨基酮戊酸（ALA）孵育2和6 h后成纖維細(xì)胞活性氧及線粒體膜電位平均熒光強度和成纖維細(xì)胞凋亡率（±s）

表1 氨基酮戊酸（ALA）孵育2和6 h后成纖維細(xì)胞活性氧及線粒體膜電位平均熒光強度和成纖維細(xì)胞凋亡率（±s）

注：n=3。FB：成纖維細(xì)胞；UVB-SIPS-FB：中波紫外線誘導(dǎo)的衰老成纖維細(xì)胞；ALA-PDT：氨基酮戊酸光動力療法。F值為25、50、100 J/cm2 ALA-PDT組、對照組比較的結(jié)果。a：與對照組相比，P＜0.05；b：與同一光照強度的UVB-SIPS-FB相比，P＜0.05；c：與50 J/cm2ALA-PDT組相比，P＜0.05

組別 活性氧 線粒體膜電位 成纖維細(xì)胞凋亡率（%）正常FB UVB-SIPS-FB 正常FB UVB-SIPS-FB 正常FB UVB-SIPS-FB孵育2 h對照組 0.42±0.44 0.71±0.57 0.18±0.12 ALA組 0.23±0.15 0.78±0.66 0.14±0.19 100 J/cm2照光組 0.16±0.20 0.85±0.52 0.09±0.15 25 J/cm2ALA-PDT組 6.58±1.52a 4.84±0.53a 6.16±0.78a 50 J/cm2ALA-PDT組 10.41±2.27ab 5.22±0.66a 6.62±1.26a 100 J/cm2ALA-PDT組 20.85±2.89ac 18.53±0.68ac 23.36±2.56ac NAC+50 J/cm2ALA-PDT組 0.20±0.13c 1.01±0.50c 0.31±0.25c F值 80.77 356.70 170.60 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05孵育6 h對照組 0.01±0.01 0.02±0.02 0.26±0.25 ALA組 0.02±0.02 0.02±0.03 0.56±0.93 100 J/cm2照光組 0.05±0.07 0.04±0.06 0.29±0.42 25 J/cm2ALA-PDT組 20.23±1.66ab 12.87±2.46a 18.41±1.14ab 50 J/cm2ALA-PDT組 35.75±2.17ab 23.41±2.12a 37.51±1.75ab 100 J/cm2ALA-PDT組 62.13±1.90ab 51.70±1.48a 50.44±1.82ab NAC+50 J/cm2ALA-PDT組 8.33±0.95c 6.25±1.66c 4.77±1.19bc F值 972.60 487.20 863.30 0.23±0.32 0.16±0.11 0.18±0.11 4.75±0.70a 4.42±1.06a 19.35±1.97ac 0.20±0.18c 181.70＜0.05 3.23±0.65 3.61±1.32 2.94±0.72 9.92±1.41a 10.20±1.36a 17.35±0.96a 6.29±1.02c 68.33＜0.05 3.81±0.59 4.07±0.58 4.41±0.78 7.34±0.87a 8.39±1.16a 17.03±1.29a 5.35±0.58c 102.70＜0.05 0.14±0.09 0.19±0.27 0.33±0.30 16.18±0.68a 25.17±0.90a 41.08±1.99a 5.14±1.31c 738.40 5.17±1.27 3.63±0.82 4.73±1.02 18.62±1.44ab 31.31±2.21ab 51.37±3.43ab 9.09±2.20c 249.50 5.09±1.64 4.50±1.08 3.63±2.72 13.85±1.71a 23.40±2.14a 41.02±2.73a 9.97±3.23c 106.00 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

圖1 Hoechst染色觀察氨基酮戊酸（ALA）孵育2 h或6 h后，成纖維細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化（× 100） 1A：對照組；1B：ALA組；1C：100 J/cm2照光組；1D ～1G：分別為ALA孵育2 h的25、50、100 J/cm2ALA光動力療法1I 1J 1K（ALA-PDT）組和NAC+50 J/cm2ALA-PDT組；1H～1K：分別為ALA孵育6 h的25、50、100 J/cm2ALA-PDT組和NAC+50 J/cm2ALA-PDT組。對照組與ALA組、100 J/cm2照光組Hoechst染色細(xì)胞核呈均勻淡染藍(lán)色，ALA-PDT組觀察到呈致密濃染的凋亡細(xì)胞核，且隨著ALA孵育時間延長、光照劑量增加，細(xì)胞凋亡比例越高，特征也越明顯；加入NAC后，可明顯抑制細(xì)胞凋亡。孵育6 h ALA-PDT組較2 h組凋亡細(xì)胞顯著增多，細(xì)胞核染色質(zhì)固縮明顯，呈致密濃染

討 論

皮膚衰老反映在細(xì)胞水平即為細(xì)胞衰老，而FB是皮膚真皮中最主要的細(xì)胞類型，光老化FB可發(fā)生線粒體DNA突變累積，細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶、GPx、抗壞血酸及谷胱甘肽等抗氧化成分顯著減少，清除氧自由基保護皮膚的能力下降［8］，這些特征性的結(jié)構(gòu)、功能改變是皮膚光老化形成的最重要基礎(chǔ)。呂婷等［9］認(rèn)為，光動力的選擇性剝脫作用使老化細(xì)胞發(fā)生不同程度的凋亡、壞死和剝脫，最終皮膚通過去除老化變性的組織而變得平滑；而Jang等［10］發(fā)現(xiàn)，低劑量 PDT（3～ 10 J/cm2）作用，可產(chǎn)生少量增多的ROS，引起光老化FB增生及活力增強，從而改善老化組織。立足以上兩點，本研究證實了ALAPDT的光動力損傷效應(yīng)，并初步探討其可能的氧化損傷機制。

正常細(xì)胞內(nèi)ALA合酶催化琥珀酰CoA和谷氨酸鹽合成ALA，經(jīng)代謝再合成PpIX，如不給予光照，PpIX會在24～48 h內(nèi)轉(zhuǎn)化成非光活性的亞鐵血紅素［11］，最終形成血紅素。若以外源性ALA孵育細(xì)胞，細(xì)胞可吸收ALA合成PpIX，此時再予合適波長激光照射，將發(fā)生一系列光化學(xué)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。人細(xì)胞吸收ALA的機制尚不明確，原卟啉合成在增生快速的細(xì)胞如癌變及癌前細(xì)胞里明顯增多，皮膚腫瘤細(xì)胞是周圍組織的10倍左右，慢性光損傷細(xì)胞對ALA也有很好的通透性［12］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，1 mmol/L ALA孵育成纖維細(xì)胞0～6 h，激光共聚焦顯微鏡觀察到正常及UVB-SIPS-FB細(xì)胞內(nèi)PpIX平均熒光強度逐漸增高，5 h內(nèi)，兩種細(xì)胞無明顯差別，6 h開始，正常FB胞內(nèi)PpIX平均熒光強度較UVB-SIPS-FB明顯增加（P＜0.05），故本實驗分別選擇ALA孵育2 h、6 h進行比較研究。

本研究證實，ALA-PDT可以誘導(dǎo)光老化細(xì)胞凋亡，且6 h ALA孵育組細(xì)胞凋亡程度明顯高于2 h組，為了探討ALA-PDT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機制，我們進一步研究了細(xì)胞內(nèi)ROS和MMP的變化，觀察到了與凋亡率一致的細(xì)胞內(nèi)ROS累積量，在各種腫瘤細(xì)胞內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)果［13-15］。因為ROS能破壞線粒體膜完整性，導(dǎo)致膜上通透性轉(zhuǎn)運孔開放，跨膜電位（ΔΨm）崩潰，線粒體滲透性改變，細(xì)胞色素C及其他前凋亡分子釋放入胞質(zhì)，激活細(xì)胞凋亡途徑［16］。我們也發(fā)現(xiàn)，MMP的升高與ROS變化一致，提示ALA-PDT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與ROS產(chǎn)生、線粒體功能破壞有關(guān)。NAC在細(xì)胞凋亡過程中作為一種ROS清除劑［17］，可以保護線粒體免受氧化應(yīng)激損害，減少細(xì)胞凋亡。我們的實驗證實，加入NAC對ALA-PDT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有抑制作用，并顯著減少了細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生及MMP改變，說明ALA-PDT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡確實與ROS的氧化損傷效應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，ALA-PDT可以誘導(dǎo)光老化人皮膚FB凋亡，且與ALA孵育時間、照光劑量呈依賴性關(guān)系，其機制與細(xì)胞氧化損傷有關(guān)，這可能是治療皮膚光老化的基礎(chǔ)。

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四川省醫(yī)學(xué)會第十二次皮膚性病學(xué)術(shù)會議紀(jì)要

四川省醫(yī)學(xué)會第十二次皮膚性病學(xué)術(shù)會議于2014年11月28-30日在成都市金河賓館召開。來自全省200余名皮膚性病科醫(yī)生參會。特邀黃俊銘、郝飛、黃柏翰、蔡昌霖、陳愛軍、林昭春、蘭長貴等教授做報告。冉玉平教授報告的“嬰幼兒血管瘤治療新療法”為國際首報，讓全省皮膚科醫(yī)生快速感受基礎(chǔ)和臨床研究的最新進展。本次會議收到投稿150篇，有61位皮膚科醫(yī)師演講，內(nèi)容涉及疑難病分享、激光、美容、色素疾病、兒童疾病、光動力、皮膚外科、感染、麻風(fēng)、梅毒、護理、新療法、皮膚鏡等。成立了四川省醫(yī)學(xué)會皮膚性病專委會青年委員會：主任委員冉玉平（兼），副主任委員陳濤、呂小巖、張浩，秘書何迅、鐘建橋。本次會議應(yīng)用新媒體、網(wǎng)絡(luò)會議直播及微信問卷調(diào)查、微信投票等形式，首次采用E-poster展示，評出特等獎1名，一等獎3名，二等獎5名，三等獎10名并頒獎。冉玉平匯報專委會獲四川省醫(yī)學(xué)會目標(biāo)管理工作單項類一等獎、中華醫(yī)學(xué)會皮膚性病學(xué)分會“基層大講堂”繼教項目組織獎三等獎，并希望全省皮膚科醫(yī)生不僅要準(zhǔn)確診斷疾病、力爭療效好，而且應(yīng)將原創(chuàng)性研究撰寫為論文發(fā)表，將病例資源轉(zhuǎn)變?yōu)閷W(xué)術(shù)優(yōu)勢，實現(xiàn)我省皮膚性病學(xué)跨越式發(fā)展。

Aminolevulinic acid-based photodynamic therapy induces apoptosis of prematurely senescent fibroblasts induced by ultraviolet B stress

Zhang Lichao,Zhang Hairong,Zhou Bingrong,Luo Dan,Ma Liwen,Zhang Jia′an,Wang Shen,Yi Fei,Maya Valeska Gozali,Liu Juan.Department of Dermatovenereology,First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China

s:Luo Dan,Email:daniluo2013@njmu.edu.cn;Zhou Bingrong,Email:bingrong.2002@163.com

ObjectiveTo study the effect of aminolevulinic acid-based photodynamic therapy（ALA-PDT）on oxidative damage to and apoptosis of prematurely senescent fibroblasts induced by ultraviolet B stress（UVB-SIPS-FB）.MethodsBoth normal fibroblasts and UVB-SIPS-FB were divided into 2-hour and 6-hour groups with the duration of incubation with ALA away from light being 2 and 6 hours respectively,and each group was divided into 7 subgroups:control subgroup receiving no treatment,ALA subgroup treated with ALA alone,red laser group treated with 100 J/cm2red laser alone,3 ALA-PDT subgroups pretreated with ALA followed by red laser radiation at 25,50 and 100 J/cm2respectively,NAC+ALA-PDT subgroup sequentially pretreated with ALA and NAC （5 mmol/L）followed by red laser radiation at 50 J/cm2.The wavelength and power density of red laser was 635 nm and 50 mW/cm2respectively in this study.Fluorescence microscopy and flow cytometry were performed to determine the levels of reactive oxygen species（ROS） and mitochondrial membrane potentials （MMPs）,and Hoechst staining and flow cytometry to detect cell apoptosis.Statistical analysis was carried out with the software SPSS 13.0 by one-way analysis of variance（ANOVA）and qtest.ResultsThe apoptosis rate of UVB-SIPS-FB was significantly higher in the 25-,50-,100-J/cm2ALA-PDT subgroups（2-hour group:7.34%±0.87%,8.39%±1.16%and 17.03%±1.29%vs.3.81%±0.59%,F=102.70,P＜0.05;6-hour group:13.85%±1.71%,23.40%±2.14%and 41.02%±2.73%vs.5.09%±1.64%,F=106.00,P＜0.05）than in the control subgroups,but lower in the NAC+ALA-PDT subgroups（2-hour group:5.35% ±0.58%,6-hour group:9.97% ±3.23%,bothP＜0.05）than in the 50-J/cm2ALA-PDT subgroups.There was no significant difference in the apoptosis rate of UVB-SIPS-FB between the ALA subgroups or red laser subgroups and control subgroups.ALA-PDT subgroups showed significantly increased ROS level and MMP,and the degree of increase was dependent on the durationof incubation with ALA and dose of red laser,while the pretreatment with the antioxidant NAC could reduce the ALA-PDT induced increase in ROS level and MMP,which was consistent with the changes of apoptosis rate following the treatment.ConclusionALA-PDT can induce marked apoptosis of UVB-SIPS-FB,likely through the oxidative damage to cells.

Aminolevulinic acid;Ultraviolet rays;Fibroblasts;Cell aging;Photochemotherapy;Oxidative stress;Apoptosis

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.04.010

國家自然科學(xué)基金（81371757、81301384）；中國醫(yī)師協(xié)會皮膚科醫(yī)師分會-復(fù)旦張江光動力基金研究項目（2013）

210029南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科

駱丹，Email：daniluo2013@njmu.edu.cn；周炳榮，Email：bingrong.2002@163.com

2014-06-13）

（本文編輯：顏艷）