特應(yīng)性皮炎患者外周血T細(xì)胞磷酸肌醇3激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)

魏明 涂玲 梁穎紅 劉佳 龔艷杰 張俊華 張宜花

特應(yīng)性皮炎患者外周血T細(xì)胞磷酸肌醇3激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)

魏明 涂玲 梁穎紅 劉佳 龔艷杰 張俊華 張宜花

目的 探討特應(yīng)性皮炎（AD）患者外周血T細(xì)胞磷酸肌醇3激酶（PI3K）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化情況及其臨床意義。方法 檢測(cè)38例AD患者的T細(xì)胞PI3K通路活性，健康對(duì)照組38例。外周血T淋巴細(xì)胞分離采用Rosettsep T細(xì)胞提取試劑盒提取，PI3K活性采用免疫沉淀和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），Akt及其磷酸化蛋白采用免疫印跡法，T細(xì)胞增殖采用噻唑藍(lán)（MTT），白細(xì)胞介素（IL）6和IL-10水平采用ELISA檢測(cè)。結(jié)果 新鮮分離的AD患者外周血T細(xì)胞PI3K和Akt活性均顯著高于健康對(duì)照組（P<0.05）。AD患者T細(xì)胞在體外培養(yǎng)24 h后PI3K和Akt活性與健康對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），健康對(duì)照組T細(xì)胞用AD患者血清孵育24 h后PI3K和Akt活性顯著增高（P<0.05）。PI3K特異性抑制劑LY294002顯著抑制AD患者T細(xì)胞增殖［（123±25）%和（195±28）%，P<0.05］及分泌IL-6和IL-10分別為［（431±64）ng/L和（823 ± 128）ng/L，P<0.05］，［（120 ± 21）ng/L和（213 ± 35）ng/L，P<0.05］。新鮮分離的 AD 患者外周血T細(xì)胞PI3K和Akt活性與疾病嚴(yán)重程度指數(shù)（EASI）無(wú)相關(guān)。結(jié)論 AD患者外周血T細(xì)胞存在磷酸肌醇3激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化異常，并與T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌有關(guān)，提示AD患者外周血中可能存在激活該通路的血清因子。

皮炎，特應(yīng)性；T淋巴細(xì)胞；信號(hào)傳導(dǎo)

特應(yīng)性皮炎（AD）是一個(gè)慢性多因素的疾病［1］，病因尚不清楚，其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確。在AD的發(fā)病機(jī)制中，T細(xì)胞可能起著關(guān)鍵作用［2-5］。磷酸肌醇3激酶（PI3K）是調(diào)控T細(xì)胞增殖、活化和遷移的關(guān)鍵信號(hào)蛋白，正常靜止的T細(xì)胞PI3K活性處于低水平狀態(tài)，只有在T細(xì)胞活化時(shí)PI3K活性才顯著升高。為此，我們通過(guò)檢測(cè)AD患者外周血T細(xì)胞PI3K信號(hào)通路活性情況，探討其在AD發(fā)病機(jī)制中的作用。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

2010年7月至2013年11月就診于我院門診的AD患者38例（兒童34例，成人4例自幼患?。?，全部符合Williams特應(yīng)性皮炎診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］。其中男8例，女30例，年齡2～60歲，平均22.5歲，按照濕疹面積及嚴(yán)重程度指數(shù)（EASI）評(píng)分法［7］對(duì)AD患者病情嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分，患者EASI評(píng)分為3.5～14.1分，平均（6.23±2.71）分。所有患者無(wú)其他明顯皮膚病變、自身免疫性疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、肝病和腫瘤等病史。停用抗組胺藥2周以上，停用系統(tǒng)及局部糖皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑1個(gè)月以上。健康對(duì)照組38例，來(lái)自我院健康體檢中心體檢健康者，其中男8例，女30例，年齡3～60歲，平均23.5歲。無(wú)家族過(guò)敏史，無(wú)明顯皮膚病變或內(nèi)臟疾病史。兩組受試者性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

二、方法

1．外周血T細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：抽取患者和對(duì)照組外周靜脈血6～8 ml，按Rosettsep T細(xì)胞提取試劑盒（加拿大StemCell Technologies公司）說(shuō)明書分離T細(xì)胞。用抗CD3單抗（美國(guó)BD Pharmingen公司）在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)T細(xì)胞純度，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞純度均在95%以上。把分離到的T細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)基和10%胎牛血清（FBS，均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司）培養(yǎng)，并按實(shí)驗(yàn)要求部分細(xì)胞用CD3單抗（5 ml/L，購(gòu)自美國(guó)Biosciences公司）和 CD28單抗（5 mg/L）或 PI3K 抑制劑 LY294002（10 μmol/L，購(gòu)自美國(guó)Chemicon公司）處理細(xì)胞。同時(shí)，用錐蟲藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞活性，細(xì)胞活性均超過(guò)95%。

2．血清的制備和處理：常規(guī)收集血清后儲(chǔ)存于－80℃待用。為了解AD患者血清是否影響健康對(duì)照組，使用前把AD患者血清在56℃滅活30 min，然后離心除去沉淀物，備用。

3．提取細(xì)胞總蛋白：用冷1×PBS洗滌T細(xì)胞1次，加入50 μl SDS樣本裂解緩沖液A，勻漿后置冰上，超聲粉碎10～15 s，于95～100℃煮5 min，然后置冰上；850×g離心5 min，吸取上清，分裝儲(chǔ)存于－20℃。

4．PI3K活性檢測(cè)：2×106T細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌后置于冰上，加2 ml冰緩沖液A（137 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L正釩酸鹽溶液），洗滌3次后加入0.5 ml裂解液，繼續(xù)置冰上20 min；裂解細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至1 ml離心管離心10 min以沉淀未溶解物質(zhì)，把離心后的上清轉(zhuǎn)至另一離心管；加入5 μl抗PI3K抗體，于4℃孵育1 h；然后加60 μl 50%蛋白A微珠（溶于PBS），混合后再于4℃孵育1 h；離心后所得沉淀物用50 mmol/L Tris-HC（lpH7.4）洗滌3次；然后按美國(guó)Echolon公司提供的試劑盒說(shuō)明書操作，用ELISA法檢測(cè)PI3K活性。

5．免疫印跡法：把樣品蛋白于95～100℃煮5min，然后等量上樣于15%SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳，用轉(zhuǎn)移緩沖液把凝膠上蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至醋酸纖維膜上，然后膜與不同濃度一抗于4℃孵育過(guò)夜，接著膜在室溫下與二抗孵育1 h，TBST洗膜后用ECL液顯影，最后將結(jié)果進(jìn)行圖像分析，計(jì)算吸光度（A）值，Akt活性以磷酸化AktA值/總AktA值之比表示。

6．噻唑藍(lán)（MTT）測(cè)定：為檢測(cè)T細(xì)胞增殖情況，將實(shí)驗(yàn)分為3組，即單獨(dú)血清培養(yǎng)、CD3/CD28單抗刺激、CD3/CD28單抗刺激 +LY294002，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。把1×105T細(xì)胞在含100 μl RPMI 1640培養(yǎng)液的96孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)48 h。MTT比色法具體步驟見(jiàn)文獻(xiàn)［8］。

7．細(xì)胞因子水平檢測(cè)：按說(shuō)明書步驟操作。

結(jié) 果

1．T細(xì)胞PBK信號(hào)通路活性情況：AD患者外周血T細(xì)胞PI3K活性（1.00%±0.81%）顯著高于健康對(duì)照組（0.50% ± 0.25%），t=2.417，P<0.05。AD患者外周血T細(xì)胞PI3K下游關(guān)鍵蛋白Akt活性（1.05%±0.78%）顯著高于健康對(duì)照組（0.49%±0.26%），t=2.435，P<0.05。

2．AD患者T細(xì)胞在含10%胎牛血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后PI3K通路活化情況：AD患者T細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)24 h后其PI3K和Akt活性為0.67%±0.36%和0.56%±0.32%，與健康對(duì)照組0.50%±0.25%和0.49%±0.26%比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，t值分別為 1.028，1.061，均P＞ 0.05。

3．AD患者血清對(duì)健康對(duì)照組T細(xì)胞PI3K信號(hào)通路活性的影響：AD患者T細(xì)胞與其自身血清培養(yǎng)后，PI3K活性和Akt活性高于用健康對(duì)照組血清培養(yǎng)，均P＜0.05，見(jiàn)表1。健康對(duì)照組T細(xì)胞與AD血清培養(yǎng)后，PI3K活性和Akt活性亦明顯高于與其自身血清培養(yǎng)，均P＜0.05，見(jiàn)表1，提示AD患者血清中可能存在影響其T細(xì)胞PI3K通路異?；罨囊蛩?。

4．抑制PI3K通路活性對(duì)AD患者T細(xì)胞增殖的影響：PI3K特異性抑制劑LY294002+AD患者單獨(dú)血清培養(yǎng)T細(xì)胞增值率為63%±11%與單獨(dú)血清培養(yǎng)T細(xì)胞增值率123%±25%相比，t=2.687，P<0.05。PI3K特異性抑制劑LY294002+CD3/CD28單抗刺激的AD患者T細(xì)胞增殖率為125%±22%與CD3/CD28單抗刺激的AD患者T細(xì)胞增殖率195% ±28%，t=2.219，P<0.05。提示PI3K特異性抑制劑LY294002對(duì)單獨(dú)血清和CD3/CD28單抗刺激的AD患者T細(xì)胞增殖均有顯著地抑制作用。

5．抑制PI3K通路活性對(duì)AD患者T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響：PI3K特異性抑制劑LY294002+AD患者T細(xì)胞體外自發(fā)分泌IL-6和IL-10與無(wú)抑制劑體外培養(yǎng)相比，均P<0.05，見(jiàn)表2。PI3K特異性抑制劑LY294002+CD3/CD28單抗誘導(dǎo)的IL-6和IL-10與CD3/CD28單抗誘導(dǎo)相比，均P<0.05，見(jiàn)表2。提示PI3K特異性抑制劑LY294002對(duì)AD患者T細(xì)胞體外自發(fā)分泌和CD3/CD28單抗誘導(dǎo)的IL-6和IL-10均有顯著抑制作用。

6．AD患者T細(xì)胞PI3K通路活性與AD疾病嚴(yán)重程度積分的相關(guān)性：AD患者T細(xì)胞PI3K活性和Akt活性與AD疾病嚴(yán)重程度指數(shù)（EASI）均無(wú)相關(guān)關(guān)系，r值分別為0.25和0.29，P值分別為0.08和0.13。

表1 特應(yīng)性皮炎（AD）患者和健康對(duì)照血清對(duì)T細(xì)胞PI3K信號(hào)通路活性的影響（%，±s）

表1 特應(yīng)性皮炎（AD）患者和健康對(duì)照血清對(duì)T細(xì)胞PI3K信號(hào)通路活性的影響（%，±s）

注：a：與T細(xì)胞 +對(duì)照血清培養(yǎng)比較，t=2.032，P＜0.05；b：與T細(xì)胞+對(duì)照血清培養(yǎng)比較，t=2.472，P＜0.05；c：與T細(xì)胞 +自身血清培養(yǎng)比較，t=2.015，P＜0.05；d：與T細(xì)胞 +自身血清培養(yǎng)比較，t=2.496，P ＜ 0.05

組別 例數(shù)PI3K活性 AKt活性AD患者T細(xì)胞+自身血清培養(yǎng) 381.02±0.63a 1.12±0.59b T細(xì)胞+對(duì)照血清培養(yǎng) 380.62±0.27 0.53±0.26健康對(duì)照T細(xì)胞+AD患者血清培養(yǎng) 380.89±0.33c 1.03±0.56d 0.50±0.25 0.49±0.26 T細(xì)胞+自身血清培養(yǎng) 38

表2 抑制PI3K通路活性和CD3/CD28單抗對(duì)特應(yīng)性皮炎（AD）患者T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響（±s）

表2 抑制PI3K通路活性和CD3/CD28單抗對(duì)特應(yīng)性皮炎（AD）患者T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響（±s）

注：a：與無(wú)抑制劑AD患者T細(xì)胞培養(yǎng)比較，t=2.242，P＜0.05；b：與無(wú)抑制劑AD患者T細(xì)胞培養(yǎng)比較，t=2.013，P＜0.05；c：與CD3/CD28單抗誘導(dǎo)培養(yǎng)比較，t=2.429，P＜0.05；d：與CD3/CD28單抗誘導(dǎo)培養(yǎng)比較，t=2.143，P＜0.05

IL-6（ng/L） IL-10（ng/L）168±33a 56±14b 265±46 98±25 431±64c 120±21d 823±128 213±35組別 例數(shù)LY294002+AD患者T細(xì)胞培養(yǎng) 38無(wú)抑制劑AD患者T細(xì)胞培養(yǎng) 38 LY294002+CD3/CD28單抗誘導(dǎo) 38 CD3/CD28單抗誘導(dǎo)培養(yǎng) 38

討 論

PI3K是由調(diào)節(jié)亞基和催化亞基組成的異源二聚體，在靜息細(xì)胞中以無(wú)活性的P85-P110復(fù)合物存在于胞質(zhì)中，當(dāng)被激活后在細(xì)胞膜上生成（3，4，5）-磷酸化磷脂酰肌醇（PIP3），然后以此作為第二信使激活下游蛋白如Akt，從而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)蛋白變化，參與調(diào)控蛋白合成、肌動(dòng)蛋白聚合、細(xì)胞生存和增殖等細(xì)胞生化過(guò)程［9］。Akt是PBK下游最為關(guān)鍵的信號(hào)蛋白。近年研究表明，PI3K信號(hào)通路不僅參與T細(xì)胞遷移，而且在CD3和（或）CD28介導(dǎo)的T細(xì)胞活化、增殖和存活中起著關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用［10-11］。

本文結(jié)果顯示，AD患者新鮮分離的外周血T細(xì)胞PI3K和Akt活性顯著高于健康對(duì)照組。AD患者T細(xì)胞經(jīng)體外用胎牛血清孵育24 h后，原來(lái)增高的PI3K通路活性能夠被逆轉(zhuǎn)至正常水平；AD患者T細(xì)胞與健康對(duì)照組血清培養(yǎng)后，PI3K通路活性也顯著下降，而健康對(duì)照組T細(xì)胞與AD患者血清培養(yǎng)后其PI3K通路活性則明顯增高。提示AD患者外周血T細(xì)胞中異常增高的PI3K通路活性可能是繼發(fā)性的，可能與其血清中存在某種致病因子有關(guān)。有研究［12］發(fā)現(xiàn)，特應(yīng)性皮炎患者急性皮損中Th17細(xì)胞可能通過(guò)增強(qiáng)Th2記憶細(xì)胞功能、促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞免疫活性，誘導(dǎo)TGF-1、IL-11、IL-6等炎癥因子表達(dá)，推測(cè)當(dāng)PI3K被炎性因子激活后，可以將P2轉(zhuǎn)變成第二信使P3（也稱PIP3），PIP3可以和PKB的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使PKB磷酸化，引起細(xì)胞核內(nèi)靶基因的變化，從而參與特應(yīng)性皮炎炎癥反應(yīng)和組織重塑等生理病理過(guò)程。

為進(jìn)一步探討AD患者外周血T細(xì)胞中PI3K通路活化的臨床意義，我們研究了PI3K通路與T細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌和AD疾病活動(dòng)性的關(guān)系。結(jié)果顯示，通過(guò)特異抑制異常增高的PI3K活性可顯著抑制AD T細(xì)胞增殖和分泌IL-6和IL-10等細(xì)胞因子，提示AD患者外周血T細(xì)胞中PI3K通路異?；罨赡芘c其體內(nèi)T細(xì)胞的內(nèi)在活化有關(guān)。因此推測(cè)T細(xì)胞的病理性活化可能是AD發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，PI3K通路很可能是調(diào)節(jié)AD T細(xì)胞活性的重要靶點(diǎn)，通過(guò)抑制該通路活性可能有利于AD的治療。本研究未發(fā)現(xiàn)PI3K活性與AD活動(dòng)指數(shù)存在相關(guān)性，或許與病例數(shù)偏少還是與其他原因有關(guān)，尚待進(jìn)一步研究。

［1］曾美,高謙,何定陽(yáng),等.特應(yīng)性皮炎患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的檢測(cè)［J］．中華皮膚科雜志,2010,43（9）:610-613．

［2］Ou LS,Goleva E,Hall C,et al.T regulatory cells in atopic dermatitis anti subversion of their activity by superantigens［J］．J Allergy Clin Immunol,2004,113（4）:756-763．

［3］Verhagen J,Akdis M,Traidl-Hoffmann C,et al.Absence of T-regulatory cell expression and function in atopic dermatitis skin［J］．J Allergy Clin Immunol,2006,117（1）:176-183．

［4］Szegedi A,Barath S,Nagy G,et al.Regulatory T cells in atopic dermatitis:epidermal dendritic cell clusters may contribute to their local expansion［J］．Br J Dermatol,2009,160（5）:984-993．

［5］Nakatani T,Kaburagi Y,Shimada Y,et al.CCR4+memory CD4+T lymphocytes are increased in peripheral blood and lesional skin from patients with atopic dermatitis［J］.J Allergy Clin Immunol,2001,107（2）:353-358.

［6］Williams HC,Burney PE,Hay RJ,et al.The UK working party′s diagnostic criteria for atopic dermatitisI.Derivation ofa minimum set of discriminators for atopic dermatitis［J］．Br J Dermatol,1994,131（3）:383-396.

［7］趙辨．濕疹面積及嚴(yán)重度指數(shù)評(píng)分法［J］.中華皮膚科雜志,2004,37（1）:3-4．

［8］Xu H,He Y,Yang Y,et al．Anti-malarial agent artesunate inhibits TNF-a induced production of proinflammatory cytokine via inhibition of NF-KB and PI3 kinaseAkt signal pathway in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes［J］．Rheumatology,2007,46（6）:920-926．

［9］Okkenhaug K,Vanhaesebroeck B.PI3K in lymphocyte development differentiation and activation［J］．Nat Rev Immunol,2003,3（4）:317-330．

［10］Yang J,Liu X,Nyland SB,et al.Platelet-derived growth factor mediates survival of leukemic large granular lymphocytes via an autocrine regulatory pathway［J］.Blood,2010,115（1）:51-60．

［11］Alcazar I,Marques M,Kumar A,et al.Phosphositide 3 kinase γ participates in T cell receptor-induced T cell activation ［J］．J Exp Med．2007,204（12）:2977-2987．

［12］沈斌,屠巧峰,冷建杭,等.特應(yīng)性皮炎患者外周血輔助性T細(xì)胞17與白介素17的檢測(cè)［J］.中華皮膚科雜志,2012,45（2）:106-109.

Expression of the phosphatidylinositol 3-kinase signaling pathway in peripheral blood T cells from patients with atopic dermatitis

Wei Ming*,Tu Ling,Liang Yinghong,Liu Jia,Gong Yanjie,Zhang Junhua,Zhang Yihua.*Department of Clinical Laboratory,Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China

Wei Ming,Email:gushiweiming@126.com

Objective To estimate the activity of the phosphatidylinositol3-kinase（PI3K）signaling pathway in peripheral blood T cells from patients with atopic dermatitis （AD）,and to investigate its clinical significance.Methods T cells were isolated by using the Rosettsep T cell purification kit from the peripheral blood of 38 patients with AD and 38 healthy human controls,and classified into several groups to be treated with anti-CD3 monoclonal antibody,anti-CD28 monoclonal antibody,and LY294002 （an inhibitor of PI3K）respectively.The activity of PI3K signaling pathway in T cells was estimated by immunoprecipitation and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）.Western blot was performed to measure the expressions of total Akt and phosphorylated Akt in T cells,methyl thiazolyl tetrazolium （MTT）assay to examine the proliferation of T cells,and ELISA to determine the levels of interleukin 6 （IL-6）and IL-10.Results The activity of PI3K and Akt was significantly higher in freshly isolated patient-derived T cells than in control-derived T cells （bothP<0.05）.However,the difference in the activity of PI3K and Akt between patient-derived and control-derived T cells disappeared （bothP>0.05）after 24-hourin vitroculture.The activity of PI3K and Akt in control-derived T cells was significantly increased after 24-hour incubation with sera from the patients with AD （bothP<0.05）.In addition,compared with patient-derived T cells treated with patients′sera or anti-CD3/CD28 monoclonal antibody alone,those treated with the combination of LY294002 and patients′sera or anti-CD3/CD28 monoclonal antibody showed a significant decrease in the proliferative activity（63%±11%vs.123%±25%,125%±22%vs.195%±28%,bothP<0.05）,supernatant levels of IL-6（（168 ± 33）vs.（265 ± 46）ng/L,（431 ± 64）vs.（823 ± 128）ng/L,bothP<0.05）and IL-10（（56 ± 14）vs.（98 ± 25）ng/L,（120 ± 21）vs.（213 ± 35）ng/L,bothP<0.05）.Eczema area and severity index （EASI）was unassociated with the activity of PI3K or Akt in fresh T cells from patients with AD （bothP>0.05）.Conclusions The PI3K signaling pathway is abnormally activated in peripheral blood T cells from patients with AD,which is associated with the proliferation of,as well as secretion of cytokines by,T cells,suggesting that there exist serum factors activating this pathway in peripheral blood of patients with AD.

Dermatitis,atopic;T-Lymphocytes;Signal transduction

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.01.009

450052鄭州大學(xué)附屬第五醫(yī)院檢驗(yàn)科（魏明、涂玲、梁穎紅、龔艷杰、張俊華、張宜花），皮膚科（劉佳）

魏明，Email：gushiweiming@126.com

2014-02-26）

（本文編輯：吳曉初）