系統(tǒng)性紅斑狼瘡患兒Epstein-Barr病毒基因異常表達(dá)的研究

丁艷 何小解 廖旺 楊慧蘭 向偉 黨西強 易著文

系統(tǒng)性紅斑狼瘡患兒Epstein-Barr病毒基因異常表達(dá)的研究

丁艷 何小解 廖旺 楊慧蘭 向偉 黨西強 易著文

目的 探討Epstein-Barr病毒（EBV）基因在兒童系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）中的表達(dá)和意義。方法分離20例SLE患兒和12例健康對照外周血單一核細(xì)胞（PBMC），用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）鑒定出血清中編碼EBV衣殼抗原-IgG/IgM抗體陽性的SLE患兒，取其分泌EBV的細(xì)胞上清液與提取的PBMC共同培養(yǎng)12 d，提取培養(yǎng)前后的PBMC的RNA，用反轉(zhuǎn)錄實時定量PCR（RT-PCR）的方法檢測EBV基因的表達(dá)。結(jié)果10例患兒和1例健康對照檢測到LMP1表達(dá)，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。4例患兒和1例健康對照檢測到LMP2表達(dá)，13例患兒和3例健康對照檢測到EBNA1表達(dá)，3例患兒和1例健康對照檢測到BCRF1表達(dá)，5例患兒和2例健康對照檢測到BLLF1表達(dá)，但患兒和健康對照比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。用分泌EB病毒的細(xì)胞上清液培養(yǎng)PBMC后，發(fā)現(xiàn)患兒組和健康對照組潛伏期基因和裂解期基因表達(dá)均有不同程度的增加，潛伏期基因LMP1、LMP2、EBNA-1和裂解期基因BCRF1、BLLF1的表達(dá)與健康對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 兒童SLE患者存在EBV基因的異常表達(dá)，EBV基因可能參與了SLE的發(fā)病。

紅斑狼瘡，系統(tǒng)性；EB病毒感染；基因表達(dá)；兒童

對象和方法

一、對象

2012年1月至2013年11月，海南省婦幼保健院皮膚科與中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院兒童醫(yī)學(xué)中心小兒腎臟專科收治SLE患兒20例，男8例，女12例，年齡3～14歲，平均（8.2±2.9）歲。海南省婦幼保健院兒童保健科體檢健康兒童12例，男5例，女7例，年齡4～13歲，平均（8.7±2.4）歲，家族中無自身免疫性疾病史。SLE的診斷依據(jù)1982年美國風(fēng)濕病協(xié)會修正的診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。經(jīng)方差分析和χ2檢驗，各組之間年齡和性別分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。本文研究通過海南省婦幼保健院倫理會的批準(zhǔn)，每例患兒家長均簽署了知情同意書。

二、方法

1.細(xì)胞分離：抽取SLE患兒及健康對照組肝素抗凝靜脈血10 ml。用淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離PBMC。

2．細(xì)胞培養(yǎng)：用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）鑒定出血清中編碼EBV衣殼抗原（VCA）-IgG/IgM抗體陽性的患兒，取其分泌EBV的細(xì)胞上清液與提取的PBMC共同培養(yǎng)12 d。

3.RNA提?。河肨rizol誖試劑（美國Invitrogen公司），依據(jù)說明書操作分別提取培養(yǎng)前及培養(yǎng)后SLE患兒組及健康對照組PBMC RNA。

4.實時定量RT-PCR法檢測EBV基因的表達(dá)：cDNA的合成用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Fermentans公司），反應(yīng)體系：18 μl（1～5 μg）RNA，5 × 反應(yīng)緩沖液 5 μl，2.5 U/μl Poly A 聚合酶 1 μl，RT 混合1 μl，總體積 25 μl混勻，短暫離心，37 ℃反應(yīng) 1 h，然后85℃5 min使反轉(zhuǎn)錄酶失活，取出置－20℃冰箱保存。

實時PCR：在Icycler IQ實時熒光定量PCR儀（美國Bio-rad公司）進行PCR技術(shù)檢測EBV基因EBV 核抗原 1（EBNA1），潛伏膜蛋白 1（LMP1），潛伏膜蛋白 2（LMP2），即刻裂解基因（BZLF1），晚期裂解基因（BcRF1），晚期裂解基因（BLLF1）。引物序列由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成：EBNA1：上游引物 5′-TGCCCCCTCGTCAGACATGATT-3′和下游引物 5′-AGCGTGCGCTACCGGAT-3′；LMP1:上游引物 5′-TTGGTGTACTCCTACTGATGATCACC-3′和下游引物5′-AGTAGATCCAGATACCTAAGACAA GT-3′；LMP2：上游引物 5′-ATGACTCATCTCAACA CATA-3′和下游引物 5′-CATGTTAGGCAAATTGCA AA-3′；BZLF1：上游引物 5′-CGCCTGGGCATTCGTG TTAGTATAT-3′和下游引物 5′-AAGAATCGGGTGG CTTCCAGAA-3′；BcRF1：上游引物 5′-AGGGCCTGT TTGATTTCTCCAAGAG-3′和下游引物5′-TTTGTCA CGTTCGCCGAATGTC-3′；BLLF1：上游引物 5′-CAT TGGTAGCCGTTCGTGTGATAAT-3′和下游引物 5′-GCGAGCAATCGGACATTTGACAT-3′。PCR 反應(yīng)體積為20 μl，反應(yīng)體系為2×SYBR Green qPCR混合 10 μl，（10 μmol/L）上下游引物各 1 μl，cDNA 1 μl，水 7 μl。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性，3 min，之后每一步95℃變性，10 s，58℃退火延伸30 s，共進行35個循環(huán)，每次在延伸階段讀取熒光值。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線相對定量法進行結(jié)果分析。

5.統(tǒng)計方法：本研究用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗或使用Fisher精確概率法；兩組間比較用t檢驗。。

結(jié) 果

一、兒童SLE血液中異常潛伏和裂解基因表達(dá)

用RT-PCR檢測了SLE患兒及健康對照PBMC EBV基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)10例患兒和1例健康對照檢測到潛伏期基因LMP1表達(dá)，兩者有統(tǒng)計學(xué)意義差異（P<0.05）。4例患兒和1例對照檢測到潛伏期基因LMP2表達(dá)，13例患兒和3例對照檢測到潛伏期基因EBNA1表達(dá)，3例患兒和1例對照檢測到裂解期基因BCRF1表達(dá)，5例患兒和1例對照檢測到裂解期基因BLLF1表達(dá)，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見表1。

表1 SLE患兒組及健康對照組PBMC EBV基因的陽性表達(dá)

二、培養(yǎng)后兒童SLE血液中異常潛伏和裂解基因的表達(dá)

用分泌EBV的細(xì)胞上清液培養(yǎng)SLE患兒和健康對照PBMC后，RT-PCR檢測EBV基因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患兒組和健康對照組潛伏期基因和裂解期基因表達(dá)均有不同程度的增加，潛伏期基因LMP1、LMP2、EBNA-1 和裂解期基因 BCRF1、BLLF1 的表達(dá)與健康對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見表2。

表2 培養(yǎng)后SLE患兒組及健康對照組PBMC EBV基因的表達(dá)（±s）

表2 培養(yǎng)后SLE患兒組及健康對照組PBMC EBV基因的表達(dá)（±s）

注：P值為SLE患兒組與健康對照組比較

組別 例數(shù)SLE患兒組 20健康對照組 12 t值P值LMP1 LMP2 EBNA1 BZLF1 BCRF1 BLLF1 1.011±0.141 1.001±0.093 1.012±0.163 0.889±0.191 1.015±0.167 1.038±0.264 0.383±0.171 0.208±0.082 0.188±0.129 0.713±0.278 0.344±0.161 0.117±0.081 10.680 25.109 14.591 1.935 11.268 14.513 0.000 0.000 0.000 0.069 0.000 0.000

討 論

在健康人血液中，EBV感染的細(xì)胞保持較低的頻率，但穩(wěn)定較長時間。而在SLE患者中，EBV受SLE免疫功能障礙影響，它可能導(dǎo)致血液中不合適的病毒基因的表達(dá)［5］。本實驗用RT-PCR方法分別檢測了SLE患兒組和健康對照組PBMC中EBV基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SLE患兒組和健康對照組均有EBV潛伏期基因LMP1、LMP2、EBNA-1的表達(dá)和裂解期基因BCRF1、BLLF1的表達(dá)，但SLE患兒組潛伏基因和裂解期基因表達(dá)的陽性率均高于健康對照組，其中SLE患兒組潛伏期基因LMP1的表達(dá)顯著高于健康對照（P<0.05），與國外對于成人SLE中EBV的研究一致［5］，提示LMP1可能在兒童SLE的發(fā)病中起到一定的致病作用。本研究結(jié)果表明，SLE患兒及部分健康對照均有EBV基因的表達(dá)，但SLE患兒本身存在異常的B細(xì)胞亞群、活化標(biāo)記物的表達(dá)以及細(xì)胞內(nèi)信號的紊亂等免疫功能障礙，導(dǎo)致EBV基因的異常表達(dá)，可能是兒童SLE致病的原因之一。為進一步驗證實驗結(jié)果，本研究用分泌EBV的細(xì)胞上清液培養(yǎng)SLE患兒組和健康對照組PBMC共12 d，用RT-PCR方法檢測6種不同基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)后潛伏期基因和裂解期基因表達(dá)均有不同程度的增加，其中除BZLF1外，潛伏期基因 LMP1、LMP2、EBNA-1 和裂解期基因 BCRF1、BLLF1的表達(dá)與健康對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），提示它們可能參與了兒童SLE發(fā)病的過程。

LMP1和LMP2提供替代B細(xì)胞的存活和分化的信號（分別為CD40和BCR）［3］。國外的研究表明，LMP-1能夠通過多種機制加重SLE的自身反應(yīng)性，包括直接激活B細(xì)胞，增強B細(xì)胞活化的協(xié)同刺激信號［6-7］，刺激 B細(xì)胞活化因子（BAFF）的產(chǎn)生，能夠協(xié)助打破自我耐受等［8］。本研究中，20例SLE患兒中有10例LMP1陽性，培養(yǎng)后患者的LMP1表達(dá)顯著增加，提示LMP1在兒童SLE的發(fā)病中可能起著重要作用。

EBNA-1基因編碼的EBNA-l是病毒復(fù)制所需的唯一的病毒編碼蛋白，能被病毒特異性CTL識別，引起免疫應(yīng)答［1］。EBNA-l與Sm B自身免疫抗體靶向的開始序列有很大的同源性［9］，通過分子模擬機制，打破自身免疫耐受，產(chǎn)生大量抗Sm B抗體。此外，EBNA-1的部分序列與Ro開始序列也存在交叉反應(yīng)，產(chǎn)生抗Ro抗體［9］。裂解期基因BCRF1主要編碼VIL-10，VIL-10與人IL-10有83%的同源性，具有與人IL-10類似調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞增殖和分化的功能［10］。晚期裂解基因BLLF1，其編碼產(chǎn)物gp350/220作為膜抗原結(jié)合B細(xì)胞上表達(dá)CD21分子，進人細(xì)胞內(nèi),感染B淋巴細(xì)胞［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，SLE患兒組中BCRF1與BLLF1表達(dá)較健康對照組增加，且用分泌EBV的細(xì)胞上清液培養(yǎng)后SLE患兒組較健康對照組表達(dá)有顯著增加，與國外Cross對于成人SLE的研究一致［5］，提示SLE患兒中亦可能存在更多的裂解期EBV感染。BZLF1是EBV的早期即刻基因，是病毒從潛伏狀態(tài)活化進入裂解期后最早表達(dá)的基因。本研究SLE患兒及培養(yǎng)后的PBMC的BZLF1表達(dá)均為陰性，與陳官芝等［12］研究結(jié)果相似，提示EBV增殖復(fù)制的激活可能通過其他途徑。

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Aberrant expression of Epstein-Barr virus genes in children with systemic lupus erythematosus

Ding Yan*,He Xiaojie,Liao Wang,Yang Huilan,Xiang Wei,Dang Xiqiang,Yi Zhuwen.*Graduate School of Southern Medical University,Guangzhou 510015,China

s:Yang Huilan,Email:huilany88@hotmail.com;Xiang Wei,Email:xiangwei@163.com

Objective To investigate the expression and significance of Epstein-Barr virus（EBV）genes in children with systemic lupus erythematosus （SLE）.Methods Peripheral blood mononuclear cells （PBMCs）were isolated from 20 children with SLE and 12 healthy human controls.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was conducted to detect anti-EBV viral capsid antigen（VCA）IgG/IgM antibodies.The culture supernatants of cells from patients with anti-EBV VCA IgG/IgM antibodies were collected,and PBMCs from the patients and controls were co-cultured with the supernatants respectively for 12 days.RNA was extracted from PBMCs before and after the coculture,and reverse transcription-PCR was performed to detect the expression of EBV genes,including LMP1,LMP2,EBNA1,BCRF1,BLLF1 and BILF1 genes.Results LMP1 gene was detected in fresh PBMCs from 10 out of 20 patients and 1 out of 12 controls （P<0.05）.No significant differences were observed between the patients and controls in the detection rate of LMP2 gene（4/20 vs.1/12）,EBNA1 gene（13/20 vs.3/12）,BCRF1 gene（3/20 vs.1/12）or BLLF1 gene （5/20 vs.2/12）in fresh PBMCs.After co-culture with the supernatants of cells from patients with anti-EBV VCA IgG/IgM antibodies,the expressions of EBV genes in these PBMCs were increased to different degrees,and there was a significant difference in the expressions of EBV latent genes LMP1,LMP2 and EBNA-1 as well as EBV replicative genes BCRF1 and BLLF1 between the patient-derived and control-derived PBMCs（allP<0.05）.Conclusions There is an aberrant expression of EBV genes in children with SLE,and EBV genes may contribute to the development of SLE.

Lupus erythematosus,systemic;Epstein-Barr virus infections;Gene expression;Child

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是累及全身多系統(tǒng)的自身免疫性疾病，表現(xiàn)為T、B淋巴細(xì)胞異?；罨痛罅孔陨砜贵w產(chǎn)生［1］。兒童SLE通常臨床表現(xiàn)較嚴(yán)重，起病時急而重，是兒童時期預(yù)后較差的一種疾病。近年來SLE的病毒病因?qū)W研究受到高度重視，Epstein-Barr病毒（EBV）感染與SLE發(fā)生發(fā)展的關(guān)系已成為研究的熱點［2-3］。EBV具有嗜B淋巴細(xì)胞的特性，對機體免疫系統(tǒng)造成持續(xù)和慢性刺激，EBV在體內(nèi)存在潛伏感染和裂解感染兩種形式［3］。潛伏感染只表達(dá)潛伏基因：包括EBV核抗原（EBNA），潛伏膜蛋白（LMP）；裂解感染主要表達(dá)即刻裂解基因（BZLF1）、晚期裂解基因（BCRF1、BLLF1）等。本研究通過研究兒童SLE患者中外周血單一核細(xì)胞（PBMC）及用分泌EBV的細(xì)胞上清液培養(yǎng)PBMC后EBV的表達(dá)，探討EBV在兒童SLE中的發(fā)病機制。

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.01.006

海南省自然科學(xué)基金（814314，309079）

510015廣州，南方醫(yī)科大學(xué)研究生院［丁艷（現(xiàn)在海南省婦幼保健院，570206?？冢?；中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院兒童醫(yī)學(xué)中心小兒腎臟?？疲ê涡〗?、黨西強、易著文）；海南省人民醫(yī)院心內(nèi)科（廖旺）；廣州軍區(qū)總醫(yī)院皮膚科（楊慧蘭）；海南省婦幼保健院皮膚科（向偉）

楊慧蘭，Email：huilany88@hotmail.com；向偉，Email：xiangwei@163.com

2014-08-05）

（本文編輯：吳曉初）