桑葉多糖的分離純化及其抗凝血活性的研究

張入飛，蔡為榮，謝亮亮，楊 蕾，陳 俏

桑葉多糖的分離純化及其抗凝血活性的研究

張入飛，蔡為榮?，謝亮亮，楊 蕾，陳 俏

（安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖 241000）

為了研究桑葉多糖不同組分在體外的抗凝血活性，采用水提醇沉法提取桑葉粗多糖，聚酰胺進(jìn)行脫色和脫蛋白.用DEAE sepharose CL-6B和sepharose CL-6B對(duì)桑葉多糖進(jìn)行純化，得到5種水溶性多糖組分（MPS-1、MPS-2a、MPS-2b、MPS-2c和MPS-3）.單糖檢測(cè)結(jié)果表明：桑葉多糖主要是由半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖和甘露糖等組成.體外抗凝血活性檢測(cè)顯示5種桑葉多糖組分均能延長(zhǎng)活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）和凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）、而對(duì)凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）影響不顯著，說(shuō)明它們是通過(guò)影響內(nèi)源性途徑或共同途徑而發(fā)揮抗凝血作用；與對(duì)照相比，MPS-2b在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)APTT和TT的效果達(dá)到極顯著，表明MPS-2b有潛力開(kāi)發(fā)成抗凝血活性物質(zhì).

桑葉多糖；分離；純化；抗凝血活性

桑樹(shù)是?？粕俚穆淙~喬木，廣泛分布于亞洲、歐洲、北美洲、南美洲和非洲［1］.它的葉子是蠶的食物，因而對(duì)養(yǎng)蠶業(yè)具有重要的商業(yè)價(jià)值［2］.傳統(tǒng)的桑葉只用于養(yǎng)蠶，用途單一，易造成資源過(guò)剩現(xiàn)象.最近的研究表明，桑葉具有獨(dú)特的藥理作用，例如降血糖活性、抗氧化活性、降血壓、抗衰老活性、增強(qiáng)機(jī)體免疫力以及抗癌功效［3-5］.多糖是桑葉中的主要化學(xué)成分之一，糖生物學(xué)研究成果表明，植物多糖具有降血糖、抗腫瘤、抗氧化等多種功效，因此，開(kāi)發(fā)利用桑葉多糖具有理論價(jià)值和實(shí)際意義.彭延古［6］等發(fā)現(xiàn)桑葉提取物具有抗凝血活性，其抗凝作用主要是通過(guò)抑制凝血酶水解纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白而實(shí)現(xiàn)的.包立軍［7］等研究顯示桑葉中的抗凝血活性主要集中在桑葉的水提液中，能夠顯著延長(zhǎng)APTT值，雖然證明其抗凝血成分是一種多糖組分，但其并沒(méi)有將桑葉多糖純化和有針對(duì)性地進(jìn)行抗凝血活性研究.到目前為止，國(guó)內(nèi)外研究桑葉多糖的降血糖活性的報(bào)道較多，而對(duì)桑葉多糖的不同組分的抗凝血研究鮮有報(bào)道.

本研究是從桑葉中分離純化出不同的桑葉多糖組分，測(cè)定它們的分子量和單糖組成，研究它們?cè)隗w外的抗凝血活性，以期為桑葉多糖資源的開(kāi)發(fā)利用和新型抗凝血物質(zhì)的研究提供參考.

1　材料和方法

1.1材料與試劑

桑葉（安徽省亳州市蜀中中藥飲片廠）；正常人體血漿（安徽省蕪湖市中心血站）；聚酰胺80～100目（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；DEAE sepharose CL-6B和sepharose CL-6B（Pharmacia公司）；葡聚糖標(biāo)樣、單糖標(biāo)樣和肝素（Sigma公司）；活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、凝血酶時(shí)間（TT）和凝血酶原時(shí)間（PT）試劑盒（上海太陽(yáng)生物科技有限公司）；濃硫酸、苯酚、無(wú)水乙醇等試劑，均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.2儀器與設(shè)備

TH-1000梯度混合器、HL-1S恒流泵、BS-100A自動(dòng)部份收集器、RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；721分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；真空冷凍干燥機(jī)（美國(guó)SIM公司）；IRPretige-21傅里葉變換紅外光譜儀（日本島津）；Waters 1525高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；MTN-Ⅱ血凝儀（長(zhǎng)春市曼特諾醫(yī)療器械有限公司）.

1.3試驗(yàn)方法

（1）桑葉粗多糖的提取.桑葉經(jīng)粉碎機(jī)粉碎過(guò)80目篩，貯存在干燥環(huán)境中.取100 g桑葉粉末，按料液比1∶20在70℃的恒溫?zé)崴薪?0 min，間歇攪拌.提取液經(jīng)雙層紗布過(guò)濾除去雜質(zhì)，收集濾液，離心，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮（60℃，50 r/min，真空度700 mm Hg），向濃縮液中加入無(wú)水乙醇使乙醇濃度達(dá)到80%，于4℃冰箱中醇沉24 h，在6 000 r/min下離心30 min.收集沉淀，真空冷凍干燥得桑葉粗多糖（CMPS）.

（2）桑葉粗多糖的分離純化.脫色和脫蛋白：桑葉粗多糖（5 g）溶于蒸餾水，上聚酰胺吸附柱（600 mm× 26 mm），用蒸餾水以4 m L/min的流速洗脫.收集含糖洗脫液，用4倍體積無(wú)水乙醇醇沉，離心收集沉淀，真空冷凍干燥得到桑葉多糖（MPS）.

色譜柱純化：桑葉多糖（150 mg）用蒸餾水溶解，離心除去不溶物，取上清液上DEAE sepharose CL-6B柱（600 mm×16 mm）進(jìn)行分離.依次使用蒸餾水和0～2.0 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，自動(dòng)部份收集器收集（3 m L/min，10 m L/管），用苯酚硫酸法［8］在490 nm下逐管檢測(cè)多糖含量，按多糖含量檢測(cè)值分別收集各單一峰組分，透析脫鹽后，真空冷凍干燥.用高效凝膠過(guò)濾色譜法（HPGPC）［9］檢測(cè)純度，不純的組分進(jìn)一步使用sepharose CL-6B柱（500 mm×16 mm）進(jìn)行純化，用0.2 mol/L NaCl溶液洗脫，自動(dòng)部份收集器收集（0.3 m L/min，3 m L/管），逐管檢測(cè)多糖含量，收集單一峰組分，透析脫鹽后，真空冷凍干燥.所有的單一峰組分通過(guò)HPGPC檢測(cè)純度和分子量.

（3）桑葉多糖的紫外、紅外分析及單糖組成檢測(cè).桑葉多糖不同組分的溶液（100μg/m L）用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在200～700 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，檢測(cè)桑葉多糖組分是否含有核酸和蛋白質(zhì).取少量多糖與KBr混合研磨壓片，在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外掃描，觀察其紅外光譜特征［10］.

取10 mg多糖樣品加入2 m L 2 mol/L的三氟乙酸（TFA）溶液，抽真空封管，121℃水解1 h，減壓蒸發(fā)去除TFA，后冷凍干燥的水解樣品，將其溶于2 m L去離子水中，稀釋50倍進(jìn)樣.單糖組成檢測(cè)［11］條件：CarboPac TMPA1分析色譜柱（250 mm×4 mm）；流動(dòng)相0.15 mol/L NaOH-0.15 mol/L Na Ac；脈沖安培檢測(cè)器，金電極.

（4）桑葉多糖體外抗凝血活性檢測(cè).桑葉多糖的體外抗凝血活性檢測(cè)APTT、PT和TT 3個(gè)指標(biāo).在測(cè)定中，新鮮靜脈血與0.109 mol/L的檸檬酸三鈉按體積比9∶1混合均勻，以3 600 r/min離心6 min，收集上層液體血漿，得到乏血小板血漿，在2 h內(nèi)完成試驗(yàn).多糖樣品和血漿按1∶4的體積比混合，按照試劑盒和儀器的操作說(shuō)明來(lái)測(cè)定以上3個(gè)指標(biāo)的值，以肝素和生理鹽水作為待測(cè)樣品的陽(yáng)性和陰性對(duì)照.

2　結(jié)果和討論

2.1桑葉多糖的提取純化

桑葉粗多糖在1.3（1）的提取條件下，粗多糖的得率為3.35%.桑葉粗多糖上聚酰胺柱后，脫蛋白和脫色率分別是87.7%和38.7%，多糖保留率達(dá)到88.3%，多糖損失的部分可能是由于聚酰胺的吸附造成的.與Sevag法和三氯乙酸法［10］相比，脫蛋白效果好且損失少，有利于多糖生物活性的保持，避免了大量有機(jī)溶劑的使用.

桑葉多糖經(jīng)DEAE sepharose CL-6B柱分離出3種多糖組分，如圖1a所示.3種多糖組分分別占總多糖的比例為30.9%、29.1%和40.0%，總的多糖回收率為67.5%.

經(jīng)高效凝膠過(guò)濾色譜法檢測(cè)后，MPS-2出現(xiàn)了3個(gè)峰（數(shù)據(jù)未展示），說(shuō)明其為非均一組分；繼續(xù)用sepharose CL-6B柱進(jìn)行純化，得到了3個(gè)多糖組分，如圖1b所示.

5種桑葉多糖組分凝膠過(guò)濾色譜圖及桑葉多糖的紫外可見(jiàn)全波長(zhǎng)掃描光譜圖如圖2所示.MPS-2a、MPS-2b和MPS-2c占MPS-2的比例分別為13.4%、59.5%和27.1%，總的多糖回收率為71.4%.經(jīng)純化得到的5種多糖組分中，MPS-1是用蒸餾水洗脫出來(lái)的中性多糖；MPS-2a、MPS-2b、MPS-2c和MPS-3是用不同濃度的NaCl溶液洗脫出來(lái)的酸性多糖.所有的多糖組分都經(jīng)高效凝膠過(guò)濾色譜檢測(cè)，均觀察到單一的對(duì)稱(chēng)峰，證明它們是分子量均一的多糖組分（見(jiàn)圖2a）.根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線，它們的重均分子量分別為2.45×106Da、2.45×105Da、7.99×104Da、1.97×104Da和3.22×106Da.桑葉多糖各組分在200～700 nm下進(jìn)行紫外可見(jiàn)全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示5種桑葉多糖組分在260 nm和280 nm處沒(méi)有顯著地吸收峰，說(shuō)明純化后桑葉多糖組分不含核酸和蛋白質(zhì)（見(jiàn)圖2b）.

本次試驗(yàn)從桑葉中分離出5種桑葉多糖組分，分子量范圍為1.97×104～3.22×106Da，且其純度均在92%以上，有利于桑葉多糖生物活性的檢測(cè).應(yīng)芝［12］等從桑葉中分離出兩種桑葉多糖（MPS-1和MPS-2），分子量為24 898 Da和61 131 Da.本次試驗(yàn)得到的桑葉多糖組分沒(méi)有與其分子量相似的組分，可能與桑葉多糖的原料和提取方法不一致有關(guān).

2.2桑葉多糖的紅外分析

桑葉多糖組分的紅外光譜如圖3所示.由圖3可知，5種多糖在3 400 cm-1左右出現(xiàn)一寬峰，是O-H的伸縮振動(dòng)峰，表明其存在分子內(nèi)和分子間的氫鍵；2 928 cm-1左右是次甲基（-CH2-）中的C-H的伸縮振動(dòng)吸收峰，1 609 cm-1左右的吸收峰是羧基離子的非對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰；1 423 cm-1附近的吸收峰則是C-H的變角振動(dòng)峰，由這兩組峰可初步判斷該化合物為糖類(lèi)化合物.在1 200～850 cm-1范圍內(nèi)是“指紋區(qū)”［13］，1 000～1 200 cm-1間比較大的吸收峰是由兩種C-O伸縮振動(dòng)所引起的，其中一種是屬于C-O-H的，另一種是糖環(huán)的C-O-C.1 100～1 010 cm-1的兩個(gè)吸收峰表明桑葉多糖含有呋喃糖.

2.3單糖組成分析

單糖組成分析結(jié)果如表1所示.由表1可知，桑葉多糖MPS-1和MPS-2a組分相似，主要由半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖和甘露糖等組成.MPS-2b只含有4種單糖，半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖和鼠李糖的摩爾百分比接近5∶3∶2∶1.MPS-2c富含半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖和葡萄糖；相比之下，MPS-3還含有甘露糖.Hisato Katayama［14］等分離出的一種桑葉多糖（MP-3），該多糖由摩爾比為1∶0.2∶0.5∶2.3∶1.5的鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸構(gòu)成.應(yīng)芝［12］等得到兩種桑葉多糖，MPS-1包含山梨糖、阿拉伯糖、木糖和葡萄糖；MPS-2是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖和巖藻糖構(gòu)成.本次研究所得桑葉多糖的單糖組成與文獻(xiàn)報(bào)道的有一定差異，可能與桑葉多糖的提取方法和分析方法不一致有關(guān).

2.4體外抗凝血活性檢測(cè)

桑葉多糖的抗凝血活性檢測(cè)使用經(jīng)典的APTT、PT和TT方法.APTT是用來(lái)檢測(cè)內(nèi)源性凝血途徑中的Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅻ和激肽釋放酶原.PT是檢測(cè)外源性凝血途徑.TT是纖維蛋白聚合過(guò)程的簡(jiǎn)單篩選試驗(yàn)，它是在血漿中加入一定量的凝血酶后，測(cè)量從纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白的形成時(shí)間［15］.桑葉多糖抗凝血試驗(yàn)結(jié)果如表2所示.由表2可知，所有的多糖組分都能明顯延長(zhǎng)APTT，尤其是MPS-2b；在質(zhì)量濃度為1 mg/m L時(shí)，與生理鹽水相比，MPS-2b的凝血時(shí)間延長(zhǎng)了27.1%.此外，MPS-2a、MPS-2b和MPS-3能極顯著地延長(zhǎng)TT，但是所有多糖組分對(duì)PT影響不顯著.抗凝血試驗(yàn)結(jié)果表明，桑葉多糖是通過(guò)內(nèi)源性或共同途徑來(lái)影響凝血過(guò)程的［16］.

試驗(yàn)中得出在5種多糖組分中，MPS-2b在1 mg/m L的質(zhì)量濃度下具有最高的抗凝血活性，研究MPS-2b在不同質(zhì)量濃度（50～1 000μg/m L）下的抗凝血活性.研究結(jié)果表明，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著MPS-2b質(zhì)量濃度的增加，APTT和TT的值隨之增加，達(dá)到極顯著效果，表明MPS-2b具有開(kāi)發(fā)成抗凝血物質(zhì)的潛力.

3　結(jié)論

桑葉多糖通過(guò)DEAE sepharose CL-6B和sepharose CL-6B柱純化，得到5種水溶性多糖組分（MPS-1、MPS-2a、MPS-2b、MPS-2c和MPS-3），高效凝膠過(guò)濾色譜檢測(cè)到單一的對(duì)稱(chēng)峰，表明5種桑葉多糖組分均為單一組分；5種桑葉多糖組分的重均分子量分別為2.45×106Da、2.45×105Da、7.99×104Da、1.97×104Da和3.22×106Da.紅外光譜和全波長(zhǎng)掃描結(jié)果說(shuō)明它們是典型的多糖類(lèi)物質(zhì)，并且不含有核酸和蛋白質(zhì).單糖組成檢測(cè)表明桑葉多糖主要由半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖和甘露糖等組成.體外抗凝血活性檢測(cè)表明5種桑葉多糖組分均能延長(zhǎng)APTT和TT，但對(duì)PT影響不顯著，說(shuō)明它們是通過(guò)影響內(nèi)源性途徑或共同途徑而發(fā)揮抗凝血作用；MPS-2b在試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（1 mg/m L）對(duì)APTT和TT的效果達(dá)到極顯著，表明MPS-2b有潛力開(kāi)發(fā)成抗凝血活性物質(zhì).

［1］ J S Lee，A Synytsya，H B Kim.Purification，characterization and immunomodulating activity of a pectic polysaccharide isolated from Korean mulberry fruit Oddi（Morus alba L）［J］.Int Immunopharmacol，2013，17（3）：858-866.

［2］ M C L.Micropropagation of Morus latifolia Poilet using axillary buds from mature trees［J］.Scientia Horticulturae，2002，96：329-341.

［3］ J Sattayasai，S Tiamkao，P Puapairoj.Biphasic effects of Morus alba leaves green tea extract on mice in chronic forced swimming model［J］.Phytother Res，2008，22（4）：487-492.

［4］ 王小伙，郭金，王軍文.桑茶的營(yíng)養(yǎng)、藥理初探［J］.蠶桑茶葉通訊，2000，101：32-34.

［5］ K Doi，T Kojima，M Makino，et al.Studies on the constituents of the leaves of Morus alba L［J］.Chem Pharm Bull（Tokyo），2001，49（2）：151-153.

［6］ 彭延古，葛金文，付燦云，等.桑葉提取液對(duì)凝血機(jī)制的影響［J］.湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，22（4）：21-23.

［7］ 包立軍，張劍韻，黃龍全.桑葉中抗凝血活性成分的初步分離與純化［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2006，32（3）：418-421.

［8］ M Du Bois，K A Gilles，J K Hamilton，et al.Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances［J］.Analytical Chemistry，1956，28（3）：350-356.

［9］ X M Chen，J Jin，J Tang，et al.Extraction，purification，characterization and hypoglycemic activity of a polysaccharide isolated from the root of Ophiopogon japonicus［J］.Carbohydr Polym，2011，83（2）：749-754.

［10］江和源，陳小強(qiáng)，寇小紅，等.茶多糖的分級(jí)純化及組成分析［J］.茶葉科學(xué)，2007，27（3）：248-252.

［11］H Yokota，K Mori，H Yamaguchi，et al.Monosaccharide composition analysis of pamiteplase by anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection［J］.J Pharm Biomed Anal，1999，21（4）：767-774.

［12］Z Ying，X Han，J Li.Ultrasound-assisted extraction of polysaccharides from mulberry leaves［J］.Food Chemistry，2011，127（3）：1 273-1 279.

［13］J Gao，T Zhang，Z Y Jin，et al.Structural characterisation，physicochemical properties and antioxidant activity of polysaccharide from Lilium lancifolium Thunb［J］.Food Chemistry，2015，169：430-438.

［14］H Katayama，R Takano，Y Sugimura.Localization of mucilaginous polysaccharides in mulberry leaves［J］.Protoplasma，2008，233（1-2）：157-163.

［15］P Ekanayake，C Nikapitiya，M Zoysa，et al.Novel anticoagulant compound from fermented red alga Pachymeniopsis elliptica［J］.European Food Research and Technology，2008，227（3）：897-903.

［16］張虹，蔡為榮，湯超群，等.低分子殼聚糖的磺化及其抗凝血活性初步研究［J］.安徽工程大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2014，29（2）：38-41.

Isolation，purification and anticoagulant activity of the polysaccharide from the leaves of mulberry

ZHANG Ru-fei，CAI Wei-rong?，XIE Liang-liang，YANG Lei，CHEN Qiao
（College of Biological and Chemical Engineering，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China）

To study different components of mulberry polysaccharides and their anticoagulant activity，the crude mulberry polysaccharides were extracted by water and precipitated by alcohol.The crude polysaccharides were decolorized and deproteinized by polyamide.Five water-soluble polysaccharides（MPS-1，MPS-2a，MPS-2b，MPS-2c and MPS-3）were purified by DEAE sepharose CL-6B chromatograph column and sepharose CL-6B chromatograph column.The monosaccharide compostion of MPS was composed mainly of galactose，glucose，rhamnose，arabinose，xylose and mannose and so on.APTT，PT and TT in vitro tests showed that they prolonged APTT and TT，but had no significant effect on PT.The result confirmed these in the regulation of coagulation initiated via the intrinsic pathway or common pathway；MPS-2b significantly prolonged APTT and TT compared to saline in experiment concentrations.These results suggest that the mulberry polysaccharide MPS-2b can be explored as a kind of natural potential anticoagulant.

mulberry polysaccharides；isolation；purification；anticoagulant activity

Q53

A

1672-2477（2015）02-0027-05

2014-12-31

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31171753）；安徽省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（1408085MC52）；蕪湖市科技局資助項(xiàng)目（2013119）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練基金資助項(xiàng)目（201210363018）

張入飛（1989-），男，河北邢臺(tái)人，碩士研究生.

蔡為榮（1963-），男，安徽蕪湖人，教授，碩導(dǎo).