金鈴子散抗炎有效部位篩選及質(zhì)譜表征

戴 一，賈曉益，王海菲

?

金鈴子散抗炎有效部位篩選及質(zhì)譜表征

*戴 一，賈曉益，王海菲

（安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽，合肥 230088）

目的篩選金鈴子散的抗炎有效部位并對(duì)有效部位進(jìn)行質(zhì)譜(MS)表征。方法 將金鈴子散采用梯度極性溶劑石油醚、四氯化碳、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇及水超聲提取，提取物通過(guò)二甲苯致小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)以確定抗炎有效部位，并對(duì)抗炎有效部位采用MS進(jìn)行初步表征。結(jié)果 金鈴子散石油醚提取物對(duì)小鼠耳廓腫脹有明顯的抑制作用，MS分析其特征離子峰為m/z102.1、149.2、205.3、279.4、301.5、366.4。結(jié)論 金鈴子散石油醚提取物具有明顯的抗炎作用，為金鈴子散的抗炎有效部位。

金鈴子散; 有效部位; 抗炎；質(zhì)譜

炎癥是常見(jiàn)且重要的病理過(guò)程，體表外傷感染及器官病變?nèi)绺窝?、腎炎、肺炎等都屬于炎癥性疾病，炎癥局部表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛。治療炎癥的藥物有糖皮質(zhì)激素類及非甾體抗炎藥物，盡管表現(xiàn)出了顯著的抗炎療效，但存在一定的副作用[1-2]，抗炎藥物有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。金鈴子散出自《素問(wèn)·病機(jī)氣宜保命集》，延胡索、金鈴子兩味藥為其組成成分，兩藥配伍比例為1:1，以延胡索活血行氣；川楝子泄肝火、疏肝行氣，二藥相配，一溫一寒，一血一氣，配伍后能活血散淤、行氣鎮(zhèn)痛，為治療胸痛、脘腹疼痛的常用藥方[3]。有研究報(bào)道延胡索乙素為延胡索的抗炎成分[4]，而金鈴子散藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究并不深入，對(duì)于金鈴子散的研究主要集中在延胡索和金鈴子二味藥材的配伍比例，且抗炎的研究對(duì)象主要為金鈴子散的水提物[5-7]，目前尚未見(jiàn)其抗炎有效部位的研究報(bào)告。二甲苯致小鼠耳廓腫脹模型不需要特殊設(shè)備且快速，它是天然藥物抗炎藥研究中最常用的炎癥模型[8]。為了提高金鈴子散在傳統(tǒng)用藥中的療效，本研究將金鈴子散分別用石油醚、四氯化碳、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇及水超聲提取，通過(guò)二甲苯致小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)，初步篩選抗炎有效部位；并對(duì)有效部位采用質(zhì)譜(MS)進(jìn)行分析，為科學(xué)開(kāi)發(fā)金鈴子散的藥理作用提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

健康昆明種小鼠，雄性，體重20 ± 2 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)：皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)字第01號(hào))。在恒溫(22℃)，光照周期12 h: 12 h環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑

金鈴子散自制（川楝子、延胡索購(gòu)于亳州藥材市場(chǎng)）；阿司匹林（湖北鴻運(yùn)隆生物科技有限公司）；石油醚、四氯化碳、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、二甲苯等均為分析純。

1.3 儀器

API3000質(zhì)譜儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），F(xiàn)A2004型電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司），8510E-DTH超聲提取器（美國(guó)必能信公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-3000(上海亞榮生化儀器廠)，DZF-6020型真空干燥箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司），打孔器。

2 方法

2.1 各極性段樣品的制備

稱取10 g金鈴子散，6份，分別用10倍量的石油醚、四氯化碳、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇及水超聲提取，每次提取30 min，每組溶劑提取3次，每組提取液合并，濃縮至干，稱重，以0.5%的CMC-Na及蒸餾水轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶備用。

2.2 分組及給藥

動(dòng)物隨機(jī)分為8組，依次為：模型組、石油醚、四氯化碳、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇及水超聲提取組、阿司匹林組。金鈴子散：各組給藥劑量按照臨床公斤體重用藥量折算，小鼠每10 g體重給藥0.2 mL/d，含藥量相當(dāng)于0.2 g生藥；阿司匹林對(duì)照組，小鼠給藥量(100 mg·kg-1)。

2.3 二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳腫脹模型的制備與檢測(cè)

取昆明種小鼠80 只，體重18~22 g，雌雄各半，隨機(jī)分為8 組，每組10 只，即生理鹽水組、阿司匹林組、石油醚提取物組、四氯化碳提取物組、三氯甲烷提取物組、乙酸乙酯提取物組、甲醇提取物組及水提取物組編號(hào)，稱重，灌胃給藥，1 次/d，連續(xù)給藥4 d，生理鹽水組給生理鹽水20 mL /kg，阿司匹林組給阿司匹林，給藥量0.1 g /kg，給藥組按20 g /kg 灌胃給藥。給藥后1.5 h，將二甲苯0.05 mL均勻涂于小鼠右耳，30 min 后處死，用7 mm打孔器分別打下左右耳片，以左右耳重量之差作為腫脹度，計(jì)算腫脹抑制率，腫脹抑制率( %) =(對(duì)照組平均腫脹度－給藥組平均腫脹度) /對(duì)照組平均腫脹度× 100%。比較給藥組與模型組之間小鼠耳片腫脹度的差異顯著性[7]。

2.4 統(tǒng)計(jì)處理

2.5 有效部位類別鑒定

對(duì)金鈴子散石油醚提取物進(jìn)行質(zhì)譜分析，質(zhì)譜條件為：ESI正離子掃描模式，全掃描范圍M/Z 50-1000，NEB: 7.00、CUR: 8.00、IS: 5500.00、TEM: 350.00、DP 30.00、FP 200.00。

3 結(jié)果

3.1 金鈴子散各提取組分對(duì)二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳腫脹的影響

將金鈴子散分別用石油醚、四氯化碳、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇及水超聲提取的組分進(jìn)行二甲苯致小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，金鈴子散石油醚、水、甲醇提取的組分均能抑制二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹，其中，石油醚超聲提取組與模型對(duì)照組相比，有顯著性差異（< 0.01），與阿司匹林陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，確定石油醚超聲提取組分為金鈴子散抗炎有效部位。

表1 金鈴子散各提取組對(duì)二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳腫脹的影響(± s, n = 10)

Table 1 The results of the model of pinna swilling resulted by dimethyl benzenel with different extract fractions of Jinlingzisan

表1 金鈴子散各提取組對(duì)二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳腫脹的影響(± s, n = 10)

分組劑量(g·kg-1)腫脹度(Δ mg)抑制率 (%) 模型組－9.77 ± 3.54－ 石油醚提取組202.12 ± 1.47**78.33 四氯化碳組206.43 ± 1.4631.13 三氯甲烷提取組207.32 ± 1.7725.09 乙酸乙酯提取組206.83 ± 3.6530.04 甲醇提取組204.78 ± 2.68*51.03 水提取組205.55 ± 2.96*43.14 阿司匹林組0.13.95 ± 2.51**59.56

與模型組比較*< 0.05,**< 0.01

3.2 有效部位質(zhì)譜MS分析結(jié)果

抗炎實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明金鈴子散石油醚組分具有較強(qiáng)的抗炎作用，ESI-MS分析結(jié)果表明其抗炎有效部位主要主要在m/z102.1、149.2、205.3、279.4、301.6、330.6、366.4具有較強(qiáng)的特征離子峰，參考文獻(xiàn)[9-11]，僅能對(duì)其中的4個(gè)峰進(jìn)行歸屬m/z279.4與亞油酸分子離子峰一致、m/z301.6與高北美圣草素分子離子峰一致、m/z330.6與豆甾烷-3,5-二烯分子離子峰一致、m/z366.4與去氫紫堇堿分子離子峰一致。另外在m/z400以下，離子峰比較密集且強(qiáng)度不大，可能所含成分類型較多且含量不高，結(jié)合提取溶劑為石油醚，因此成分應(yīng)屬于揮發(fā)油類[10]，其抗炎活性可能為多成分綜合作用結(jié)果，但其表現(xiàn)的質(zhì)譜特征可作為金鈴子散抗炎有效部位的判斷依據(jù)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 金鈴子散抗炎有效部位的質(zhì)譜分析

4 討論與小結(jié)

金鈴子散由川楝子、延胡索二藥等量組成。本研究首次采用部分抗炎藥理實(shí)驗(yàn)方法，將由石油醚、四氯化碳、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇及水超聲提取的金鈴子散不同組分通過(guò)二甲苯致小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)對(duì)金鈴子散的抗炎活性部位進(jìn)行了篩選。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，金鈴子散石油醚超聲提取物對(duì)二甲苯所致的耳廓腫脹有抑制作用。說(shuō)明抗炎活性部位主要在于極性較小的石油醚部位，該部分成分經(jīng)ESI-MS直接進(jìn)樣分析，在m/z102.1、149.2、205.3、279.4、301.5、366.4具有較強(qiáng)的特征離子峰，在m/z400以下離子峰較多，可見(jiàn)此類成分的復(fù)雜性，質(zhì)譜峰顯示該有效部位中可能含有亞油酸、高北美圣草素、豆甾烷-3,5-二烯、去氫紫堇堿等，主要為一些揮發(fā)油成分，對(duì)于單個(gè)成分抗炎活性的研究未見(jiàn)報(bào)道，該有效部位的抗炎活性可能為多成分綜合作用的結(jié)果，對(duì)于單個(gè)成分的抗炎活性及各成分之間是否存在協(xié)同作用有待進(jìn)一步研究。但質(zhì)譜離子峰的特征為金鈴子散有效部位的判斷提供了依據(jù)，也為最大限度的開(kāi)發(fā)金鈴子散的藥理作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 謝建翔,牛丹.非甾體抗炎藥不良反應(yīng)報(bào)告分析[J].中國(guó)藥業(yè),2013,22(23):47-49.

[2] 李建文,朱雁.淺談糖皮質(zhì)激素的不良反應(yīng)[J].北方藥學(xué),2014,11(1):87.

[3] 王緒前.金鈴子散使用沿革[J].湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1993,1(1):25-26.

[4] 羅筱葵,胡偉銘,楊志彬.胃得康膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].井岡山大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2013,34(4):84-89.

[5] 成龍,王嵐,王彥禮,等.基于吸收-代謝模型的金鈴子散復(fù)方配伍研究[J].中國(guó)中藥雜志,2012,37(20):3130- 3136.

[6] 朱愛(ài)江,方步武,吳咸中,等.金鈴子散的抗炎作用研究[J].中藥藥理與臨床,2008,24(3):1-3.

[7] 曹麗娟,韓超,王雙華.金鈴子散及單味藥鎮(zhèn)痛抗炎作用的比較[J].天津藥學(xué),2012,24(1):9-11.

[8] 魏偉,吳希美,李元建.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].4版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2010:749-50.

[9] 陳敏,胡芳,李豐,等.川楝子化學(xué)成分研究(Ⅲ)[J].中藥材,2011,34 (12):1879-1881.

[10] 孫毅坤,雷海民,魏寧漪,等.川楝子揮發(fā)油化學(xué)成分的GC-MS分析[J].中國(guó)中藥雜志，2004，29 (5)：475-476.

[11] 許翔鴻,王崢濤,余國(guó)奠，等.延胡索中生物堿成分的研究[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2002,33 (6):483-486.

ANTI-INFLAMMATORY ACTIVE FRACTION OF JINLINGZISAN AND ITS MS CHARACTERIZATION

*DAI Yi, JIA Xiao-yi, WANG Hai-fei

（School of Pharmaceutical Sciences of Anhui Xinhua College, Hefei, Anhui 230088,China）

Objective: To screen and characterize the anti-inflammatory effective fraction from Jinlingzisan. Methods: Jinlingzisan was ultrasonically extracted by petroleum ether, CCl4, CHCl3, ethyl acetate, methanol and water, respectively. The anti-inflammatory effective fraction was characterized by MS. Results: The petroleum ether extract of Jinlingzisan had the best anti-inflammatory effect and had ion peak of m/z 102.1, 149.2, 205.3, 279.4, 301.5 and 366.4.Conclusion: The effective fraction of anti-inflammatory from Jinlingzisan was petroleum ether extract.

Jinlingzisan; anti-inflammatory; effective fraction; MS

1674-8085(2015)01-0103-04

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2015.01.022

2014-08-17；修改日期：2014-12-12

安徽省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目（KJ2012Z136）

*戴 一(1979-)，男，安徽利辛人，講師，碩士，主要從事活性天然產(chǎn)物研究(E-mail:daiyiii@163.com);

賈曉益(1978-)，女，浙江金華人，講師，博士，主要從事抗炎藥物研究(E-mail:jiaxiaoyi78@126.com);

王海菲(1992-)，女，安徽安慶人，安徽新華學(xué)院藥學(xué)院2010級(jí)藥學(xué)專業(yè)本科生(E-mail:1476374614@qq.com).