杜仲子與杜仲皮的毒性比較研究

胡存華，黃玉珊，王 霞，孫朝越，羅 婷，楊賢建

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杜仲子與杜仲皮的毒性比較研究

*胡存華，黃玉珊，王 霞，孫朝越，羅 婷，楊賢建

（井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西，吉安 343009）

目的 研究杜仲子的毒性大小，及其與杜仲皮的毒性比較，為其進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。方法 通過小鼠的急性毒性實驗、骨髓微核實驗、精子畸形實驗、大鼠的慢性毒性實驗來研究杜仲子的毒性大小和與杜仲皮的毒性比較。結(jié)果 小鼠的急性毒性實驗中，給藥組都無小鼠死亡；小鼠骨髓微核實驗及精子畸形實驗中，杜仲子和杜仲皮與正常組對比在統(tǒng)計學(xué)中無差異。大鼠的慢性毒性實驗中，杜仲子及杜仲皮可以影響食物利用率、血常規(guī)和肝功能，還可以影響肝、脾、睪丸、卵巢的臟體系數(shù)；對大鼠臟器進行病理組織學(xué)檢查，未見明顯異常。杜仲子與杜仲皮的毒性比較無差異。結(jié)論 杜仲子和杜仲在急性毒性實驗、骨髓微核實驗、精子畸形實驗中顯示無毒性；在慢性毒性實驗中，杜仲子和杜仲會影響食物利用率、血常規(guī)和肝功能，也會影響肝、脾、睪丸、卵巢生長，有慢性毒性。但杜仲子與杜仲皮的毒性無差異。

杜仲子；杜仲皮；急性毒性；慢性毒性；毒性比較

杜仲自古以皮入藥而著稱。早在二千年前，我國第一部藥物學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》就記載了杜仲皮的神奇藥效，久服輕身耐老，稱“杜仲味辛平，補中、益精氣、堅筋骨”，主治“腰膝痛，除陰下癢濕、小便馀瀝”，并把杜仲列為中藥上品[1]。杜仲以皮入藥，資源受限，現(xiàn)為中藥二級保護品種，為此在不斷地開發(fā)替代品。杜仲子提取物富含α-亞麻酸，具有抗過敏、降血脂、降血壓，預(yù)防腦血管疾病和冠心病等作用，它是寶貴的藥用和食用新資源[2]，但其毒性尚不明確。為更好地開發(fā)和利用杜仲子，本研究將對其毒性和杜仲皮比較來展開研究。

1 材料

1.1 試劑和藥品

井岡山產(chǎn)杜仲子（帶種殼），杜仲皮（井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院生藥室鑒定），Giemsa染液，甲醇，HE染液，環(huán)磷酰胺（都為北京雷根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品）。

1.2 動物

SPF級昆明種小鼠、SD大鼠，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK（湘）2011-0003。

1.3 儀器

S-L250中藥材粉碎機，RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州亞榮儀器有限公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），生物顯微鏡（國華電器有限公司），分析天平（上海島韓實業(yè)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 杜仲子和杜仲皮水煎液的制備

取經(jīng)過初步粉碎后的藥物，加8倍的蒸餾水浸泡1 h后，煎煮30 min，倒出煎液；再加4倍的蒸餾水，煎煮20 min，重復(fù)后面步驟1次；合并3次煎液，四層紗布過濾后，用旋轉(zhuǎn)揮發(fā)儀蒸干成浸膏狀待用。用蒸餾水配成以下所需的藥物濃度（生藥濃度）[3]。

2.1.2 小鼠急性毒性實驗

昆明種小鼠40只，雌雄各半，體重18~22 g。動物購進后，先適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，然后分成兩組開始實驗，于實驗前禁食16 h，不限飲水。根據(jù)最大耐受劑量法[4-6]，杜仲子、杜仲皮水煎液劑量設(shè)置為20 g/kg，即取1 g/mL的杜仲子、杜仲水煎液灌胃容量均為20 mL/kg，累積劑量為20 g/kg。記錄動物的中毒表現(xiàn)及死亡情況，連續(xù)觀察14 d，實驗結(jié)束解剖動物進行大體觀察。按毒性分級標(biāo)準(zhǔn)評價受試物的急性毒性強弱。

2.1.3 小鼠骨髓微核試驗

昆明種小鼠60只，雌雄各半，體重25~30 g。按體重隨機分為6組，每組10只。第1組為正常組(陰性對照組)，第2組為陽性對照組，給環(huán)磷酰胺0.04 g/kg，第3組為杜仲皮組10 g/kg，第4~6組為杜仲子水煎液劑量組，劑量分別為10、5、2.5 g/kg。各藥物都用蒸餾水配制，杜仲子水煎液濃度分別為1、0.5、0.25 g/mL，杜仲皮水煎液濃度分別為1 g/mL，環(huán)磷酰胺濃度為40 mg/mL，灌胃劑量都為10 mL/kg[7]。根據(jù)30 h給受試物法[4-6]，各組分別間隔24 h給予兩次藥物，于第二次灌胃6 h后頸椎脫臼處死小鼠，取股骨，用1 mL生理鹽水沖出骨髓液，離心收集骨髓液，常規(guī)涂片。涂片干燥后放入甲醇中固定5~10 min。將固定好的涂片放入Giemsa染液應(yīng)用液中染色10~15 min。立即用pH = 6.8的磷酸鹽緩沖液（磷酸鹽緩沖液配制方法為：將磷酸二氫鉀4.5 g和磷酸二氫鈉11.81 g，加至1000 mL蒸餾水中。）沖洗、晾干、閱片。每鼠計數(shù)多個高倍視野下1000個左右的嗜多染紅細胞，記錄含微核細胞數(shù)、微核發(fā)生率（微核數(shù)與嗜多染紅細胞比值），每鼠記數(shù)至少10~20個高倍視野下的嗜多染紅細胞和成熟紅細胞，計算嗜多染紅細胞與成熟紅細胞的比值。

2.1.4 小鼠精子畸形實驗

雄性昆明種小鼠48只，體重25~35 g。隨機分為6組，每組8只。分組及給藥同小鼠骨髓微核實驗，每天灌胃給藥1次，連續(xù)5 d，于第35 d進行頸椎脫臼處死小鼠，解剖后取兩側(cè)副睪，放入有盛有l(wèi) mL生理鹽水的小燒杯中，用眼科剪將副睪縱向剪2~3刀，靜止1~2 min，輕輕搖動。用四層擦鏡紙過濾，吸取濾液涂片?？諝飧稍锖?，用甲醇固定5 min，干燥，用1.5%伊紅染色l h，用水輕沖，干燥，鏡檢[4-6]。每鼠計數(shù)多個高倍視野下1000條左右的精子，計數(shù)各組精子畸變數(shù)及畸變類型，計算精子畸變率(%)，畸變率為畸形精子與正常精子的比例。

2.1.5 大鼠慢性毒性實驗

選用SD大鼠100只，雌雄各半，體重120~140g，飼養(yǎng)室溫度：20~25 ℃。相對濕度：40%~70%。按體重隨機分為5組，每組20只，雌雄各半。根據(jù)中藥的人體推薦用量，杜仲子設(shè)15、7.5、3.75 g/kg三個劑量組，分別相當(dāng)于人用劑量的100、50、25倍，另設(shè)一個杜仲皮7.5 g/kg劑量組和一個正常組（陰性對照組，給予蒸餾水)。用蒸餾水將杜仲子水煎液配制成1.5、0.75、0.375 g/mL，杜仲皮水煎液配成0.75 g/mL按10 mL/kg的體積給大鼠灌胃，陰性對照組給等量的蒸餾水，每天灌胃1次。大鼠單籠飼養(yǎng)，自由飲水和進食。每周稱重1次，稱飼料剩余量2次。每天觀察動物的一般狀況、有無中毒表現(xiàn)和死亡。實驗結(jié)束處死大鼠，進行指標(biāo)檢測，觀察指標(biāo)如下[3,8]：

每周進食量、每周體量、計算總的食物利用率（每攝入100克飼料的體重增長克數(shù)）。

血常規(guī)指標(biāo)：白細胞計數(shù)、中性粒細胞百分比、淋巴細胞百分比、單核細胞百分比、嗜酸性性粒細胞百分比、嗜堿性粒細胞百分比、紅細胞數(shù)、平均紅細胞體積、血紅蛋白、血小板。

血液生化指標(biāo)：天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、總蛋白、球蛋白、總膽固醇、甘油三酯、尿素氮、肌酐、葡萄糖。

臟體系數(shù)：實驗結(jié)束前稱體量，處死動物后，取肝、腎、脾、睪丸、卵巢稱濕重，計算相應(yīng)的臟體系數(shù)。臟體系數(shù)的計算方法為臟器重量/體重×100。

病理組織學(xué)檢查：實驗結(jié)束處死動物，取心、肺、肝、腎、脾、胃、十二指腸、睪丸、卵巢等臟器進行病理組織學(xué)檢查。

2.1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

用統(tǒng)計軟件SPSS19.0進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計數(shù)據(jù)以±表示，先做正態(tài)性及方差齊性檢驗：> 0.05 時，滿足正態(tài)性和方差齊性，繼續(xù)做單因素方差分析。方差分析采用LSD 和Dunnett 法比較組間差異。< 0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。< 0.01表示差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性意義。

2.2 結(jié)果

2.2.1 小鼠急性毒性實驗

杜仲子水煎液20 g/kg劑量給小鼠灌胃給藥1次，觀察15 d，未出現(xiàn)中毒癥狀和死亡。根據(jù)毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，杜仲子屬于無毒級。對照品杜仲皮水煎液按照同樣的方法試驗，結(jié)果也是屬于無毒級。杜仲子和杜仲皮的急性毒性無差異。

2.2.2 小鼠骨髓微核試驗

杜仲子水煎液劑量分別為10、5、2.5 g/kg，給藥兩次后，微核發(fā)生率和嗜多染紅細胞與成熟紅細胞的比值，與正常組比較無差異，說明杜仲子水煎液在此劑量下無致骨髓細胞突變作用。杜仲皮水煎液按照劑量為10 g/kg，同樣也無致骨髓細胞突變作用。而陽性對照藥物環(huán)磷酰胺有明顯的致突變作用。杜仲子和杜仲皮的無致突變作用無差異。具體結(jié)果見表1。

表1 杜仲子及杜仲皮對骨髓微核發(fā)生率的影響(`x ± s, n =10)

注：**< 0.01，與正常組比較

2.2.3 小鼠精子畸形實驗

杜仲子水煎液劑量分別為10、5、2.5 g/kg，給藥5 d后，精子畸變率與正常組比較無差異，說明杜仲子水煎液在此劑量下無生殖細胞毒性。杜仲皮水煎液按照劑量為10 g/kg，同樣也無生殖細胞毒性。而陽性對照藥物環(huán)磷酰胺有明顯的至精子畸形作用。杜仲子和杜仲皮的無生殖細胞毒性無差異。具體結(jié)果見表2。

表2 杜仲子及杜仲皮對小鼠精子畸變率的影響(`x ± s, n = 8)

注：**< 0.01，與正常組比較?；冾愋桶ㄅ诸^，無鉤，香蕉形，尾折疊，雙尾，雙頭。其中以無鉤居多

2.2.4 大鼠慢性毒性實驗

2.2.4.1 食物利用率

杜仲子低劑量組第1周可以增加食物利用率，但杜仲子高劑量組第2周以后對于雌、雄鼠都可以降低食物利用率。杜仲皮組對食物利用率無影響。具體結(jié)果見表3和表4。

表3 杜仲子及杜仲皮對雄性大鼠食物利用率的影響(`x ± s, n =10，g/100 g飼料)

注：< 0.05，與正常組比較

表4 杜仲子及杜仲皮對雌性大鼠食物利用率的影響(`x ± s，n = 10，g/100 g飼料)

注：杜仲子高劑量組第三周有一只大鼠體重明顯下降。*< 0.05，與正常組比較

2. 2.4.2 血常規(guī)指標(biāo)

杜仲子高劑量組與正常組比較可以提高紅細胞平均體積，其它無差異。杜仲子中劑量組可以升高白細胞、淋巴細胞，降低嗜堿性粒細胞、血紅蛋白、紅細胞壓積。杜仲子低劑量組可以升高白細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞，降低嗜堿性粒細胞。杜仲皮組可以升高淋巴細胞。具體結(jié)果見表5。

表5 杜仲子及杜仲皮對大鼠血常規(guī)的影響(`x ± s，n = 20)

注：*< 0.05，與正常組比較

2. 2.4.3 血液生化指標(biāo)

杜仲子高劑量組有2例丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶明顯升高，杜仲子中劑量組普遍天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶升高，杜仲子低劑量組有1例天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶明顯升高，杜仲皮組普遍丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶升高，其它與正常組比較無差異。杜仲子各劑量組及杜仲皮組對血液中總蛋白、球蛋白、總膽固醇、甘油三酯、尿素氮、肌酐、葡萄糖無影響。具體結(jié)果見表6。

表6 杜仲子及杜仲皮對大鼠肝功能指標(biāo)的影響(`x ± s，n = 20)

注：&為每組中有幾例異常，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)差過大。*< 0.05，與正常組比較

2. 2.4.4 臟體系數(shù)

杜仲子高劑量組可以升高脾的臟體系數(shù)，降低卵巢的臟體系數(shù)。杜仲子中劑量組可以降低睪丸和腎的臟體系數(shù)。杜仲子低劑量組可以降低肝、卵巢、睪丸的臟體系數(shù)。杜仲皮組可以降低肝、腎、睪丸、卵巢的臟體系數(shù)，雌鼠有一例脾腫大。結(jié)果見表7。

表7 杜仲子及杜仲皮對大鼠臟體系數(shù)的影響(`x ± s，n =10，臟器重量/體重×100）

注：&杜仲皮組雌鼠有一例脾腫大。*< 0.05，**< 0.01，與正常組比較

2. 2.4.5 病理組織學(xué)檢查

對大鼠心、肺、肝、腎、脾、胃、十二指腸、睪丸、卵巢等臟器進行病理組織學(xué)檢查，未見明顯異常。

3 討論

我國傳統(tǒng)上對杜仲資源的利用，主要是杜仲皮的醫(yī)療保健方面的開發(fā)利用[9]。因其資源的減少，有研究者在不斷地尋找替代品。我們可以從藥效、毒性等各方面來研究杜仲子是否可以替代，對杜仲子的研究開發(fā)和利用，能使杜仲的整體價值得到更充分的體現(xiàn)。

對于藥物毒性的評價，我們主要從急性毒性、慢性毒性、骨髓毒性、生殖毒性等方面來進行。本研究正是通過以上幾個方面的典型實驗來研究杜仲子的毒性，并且與已經(jīng)入藥的杜仲皮的毒性進行比較。從研究的結(jié)果來看，杜仲子在急性毒性實驗、骨髓微核實驗和精子畸形實驗中都未顯示出毒性；在慢性毒性實驗中杜仲子會影響食物利用率、血常規(guī)和血生化，也會影響肝、脾、睪丸、卵巢生長以及臟器系數(shù)；但杜仲子和杜仲皮的毒性比較無差異。從毒性方面來評價，杜仲子可以代替杜仲皮入藥。

對于杜仲子是否可以代替杜仲皮入藥，或在某些方面代替杜仲皮入藥，這需要從藥效、毒性、藥動學(xué)等各方面全方位的評價。就毒性比較而言，我們也應(yīng)進一步地做更長期的毒性實驗，這些都有待于作進一步的研究。

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A TOXICITY COMPARATIVE STUDY OFSEED AND BARK

*HU Cun-hua, HUANG Yu-shan, WANG Xia, SUN Chao-yue, LUO Ting, YANG Xian-jian

(School of Medicine, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China)

Objective: To comparatively study the toxicity ofseed and bark, provide the basis for its further utilization. Methods: By acute toxicity test, bone marrow of mice micro nuclear test, sperm deformity and chronic toxicity experiments, the toxicity ofseed and bark was compared. Results: There were no dead mice in acute toxicity experiment and no significant difference betweenseed and bark in bone marrow micro nuclear test. In chronic toxicity experiments,seed and bark affectedthe utilization rate of food, the routine blood and liver function, and the organ coefficient of the liver, spleen, testis and ovary, but there were no obvious abnormalities in histologic examination.Conclusion: Three were no significant difference in toxicity betweenseed and bark.

seed;bark; acute toxicity; chronic toxicity; toxicity comparison

1674-8085(2015)01-0095-05

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2015.01.020

2014-11-17；修改日期：2014-12-27

國家科技支撐計劃項目子課題項目(2012BAC11B02-6)

*胡存華(1972-)，女，江西萬安人，副教授，碩士，主要從事中藥藥理及毒理研究(E-mail:602642563@qq.com);

黃玉珊(1976-)，女，江西吉安人，副教授，博士，主要從事病理學(xué)及循證醫(yī)學(xué)研究(E-mail:3218680@qq.com);

王 霞(1979-)，女，江西撫州人，講師，碩士，主要從事病理學(xué)研究(E-mail:18815828@qq.com);

孫朝越(1970-)，男，江西吉安人，講師，碩士，主要從事病理學(xué)研究(E-mail:532166213@qq.com);

羅 婷(1981-)，女，江西吉安人，講師，碩士，主要從事藥理學(xué)研究(E-mail:25263636@qq.com);

楊賢建(1990-)，男，江西南昌人，井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院2010級藥學(xué)專業(yè)本科生(E-mail:362473751@qq.com).