產(chǎn)β-葡萄糖苷酶釀酒酵母菌株紫外誘變選育及酶學(xué)性質(zhì)分析

張　莉，王　婧，楊　婷，馬騰臻，程　超，?！∠?，盛文軍，韓舜愈（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，甘肅蘭州730070）

產(chǎn)β-葡萄糖苷酶釀酒酵母菌株紫外誘變選育及酶學(xué)性質(zhì)分析

張莉，王婧，楊婷，馬騰臻，程超，祝霞，盛文軍，韓舜愈
（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，甘肅蘭州730070）

為了得到高產(chǎn)胞外β-葡萄糖苷酶的釀酒酵母（Saccharomycaes cerevisiae）菌株，采用紫外線誘變技術(shù)對菌株MQFSM-3進(jìn)行處理，研究了紫外誘變條件對菌株致死率的影響，并對突變菌株酶活及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行評價。結(jié)果表明，出發(fā)菌株在輻照劑量為3500 μJ/cm2的紫外燈下照射9 min，致死率為81.09%；通過初篩、復(fù)篩及多次傳代培養(yǎng)，突變菌株UV-45產(chǎn)酶穩(wěn)定，酶活提高41.64%，該酶最適溫度為50℃，在20～50℃熱穩(wěn)定性良好；最適pH為5.5，在pH4.0～6.5酶活力相對穩(wěn)定。

釀酒酵母，紫外誘變，篩選，突變體

葡萄漿果中存在游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩大類呈香物質(zhì)，游離態(tài)呈香物質(zhì)可以直接從葡萄酒中揮發(fā)出來，是典型葡萄酒風(fēng)味的主要來源。結(jié)合態(tài)呈香物質(zhì)是不具揮發(fā)性、沒有芳香氣味的糖苷鍵合態(tài)風(fēng)味前體物質(zhì)，其含量比游離態(tài)的要豐富得多［1］，如果得以釋放，對葡萄酒品種風(fēng)味的呈現(xiàn)具有積極意義。β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，BGL，EC 3.2.1.21）是結(jié)合態(tài)香氣釋放的關(guān)鍵酶，它可催化水解葡萄糖苷鍵，同時釋放出糖苷配基，能夠改善和增強(qiáng)葡萄酒的香氣［2］。該酶廣泛存在于植物和微生物中，然而，外加酶及果實(shí)內(nèi)源的β-葡萄糖苷酶在典型葡萄酒的低pH、高酒精度、葡萄糖存在和低氧環(huán)境中活性很低或受到抑制［3］。微生物來源的β-葡萄糖苷酶受抑制的程度與菌株的種類和特性有關(guān)［4］，有研究報道表明，利用釀酒酵母（Saccharomycaes cerevisiae）產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶是提高葡萄酒香氣的有效方法［5］。但在發(fā)酵中，釀酒酵母釋放的β-葡萄糖苷酶活性較低。因此提高酵母菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力是提高葡萄酒香氣的重要研究方向之一。

誘變育種是用人工誘變的方法誘發(fā)微生物基因突變，通過隨機(jī)篩選，篩選出產(chǎn)量高、性能優(yōu)良的突變體。其中紫外輻照作為物理誘變因子應(yīng)用于工業(yè)微生物菌種的誘變選育具有悠久的歷史，紫外輻照設(shè)備簡單，操作簡便，效果明顯，是微生物菌種誘變選育的首選誘變因子［6］。

據(jù)文獻(xiàn)報道，酵母菌株對紫外輻照處理敏感性較強(qiáng)，張陳云等［7］利用紫外誘變技術(shù)得到了一株發(fā)酵性能較好的釀酒酵母菌株。李楊等［8］利用紫外線與亞硝基胍復(fù)合誘變技術(shù)處理釀酒酵母原生質(zhì)體，得到一株高產(chǎn)酒精的突變菌株。Ruchi等［9］利用化學(xué)與物理復(fù)合誘變技術(shù)處理枯草芽孢桿菌，使其產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活性提高1.2倍。但是，系統(tǒng)研究紫外線輻照誘變技術(shù)在提高酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的應(yīng)用報道較少。

本研究以實(shí)驗(yàn)室保存的野生釀酒酵母菌株為出發(fā)菌，通過紫外誘變處理，分析其產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶的條件參數(shù)及酶學(xué)特性，旨在選育出高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的突變菌株，為葡萄酒釀造提供優(yōu)良的生產(chǎn)菌株。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

釀酒酵母菌株（Saccharomycescerevisiae）MQFSM-3由甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存［10］；對硝基苯-β-D-葡萄糖苷（p-NPG）

Sigma公司；對硝基苯酚（p-NP） 天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司；酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂等均為國產(chǎn)分析純。

CL-1000紫外交聯(lián)機(jī)美國UVP公司；湘儀高速冷凍離心機(jī)長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；紫外-可見分光光度計Thermo Fisher scientific公司；SWCJ-2FD型超凈工作臺蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SYQ-DSX-280B型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)基配制YPD液體培養(yǎng)基：酵母浸膏1.0%，蛋白胨2.0%，葡萄糖2.0%，自然pH，121℃滅菌20 min；YEPD固體培養(yǎng)基：酵母浸膏1.0%，蛋白胨2.0%，葡萄糖2.0%，瓊脂2.0%，自然pH，121℃滅菌20 min，溫度降至70℃左右，加入60 μg/mL鏈霉素；發(fā)酵培養(yǎng)基［11］：酵母浸膏1.0%，蛋白胨2.0%，葡萄糖2.0%，NH4NO30.3%，KH2PO40.4%；初篩培養(yǎng)基［10］：馬鈴薯20 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，自然pH，121℃滅菌20 min，在溫度降到60～70℃左右加入1 g/L p-NPG。

1.2.2原菌株活化培養(yǎng)將出發(fā)菌株MQFSM-3接種一環(huán)于YEPD斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24 h后，接入50 mL YPD液體培養(yǎng)基中28℃，160 r/min擴(kuò)增培養(yǎng)48 h。將活化好的酵母菌按5%的接種量轉(zhuǎn)入20 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28℃，160 r/min振蕩擴(kuò)增培養(yǎng)48 h。

1.2.3生長曲線繪制取17個50 mL三角瓶，分別裝入20 mL YPD液體培養(yǎng)基滅菌備用。將菌株MQFSM-3擴(kuò)增培養(yǎng)液按5%接種量分別接入，并于28℃，160 r/min培養(yǎng)，每隔4 h取樣。以不接菌的YPD液體培養(yǎng)基為空白對照，在OD600下測吸光度值，繪制菌株生長曲線［12］。

1.2.4菌株紫外線誘變及篩選取對數(shù)生長期的培養(yǎng)液，8000 r/min離心10 min收集酵母菌體，并以適量無菌生理鹽水洗滌2次。將酵母菌體懸浮于無菌生理鹽水中，并以無菌生理鹽水進(jìn)行10倍系列逐級稀釋，然后配成105～108cfu/mL的菌懸液。

1.2.4.1不同紫外照射劑量處理將菌懸液置于無菌培養(yǎng)皿中，放置在紫外交聯(lián)機(jī)中，于不同照射劑量（1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000 μJ/cm2）下照射7 min，取樣5 mL，冰浴30 min并暗處放置4 h，之后梯度稀釋取10-4、10-5、10-6稀釋度菌懸液涂布于YPD固體培養(yǎng)基上，30℃避光培養(yǎng)48 h，以上所有操作須在紅光下進(jìn)行［13］，以沒有做誘變處理的涂布平板作為對照，計算菌落數(shù)及紫外誘變致死率［9］。

致死率計算公式如下：

1.2.4.2不同紫外照射時間處理將菌懸液置于無菌培養(yǎng)皿中，放置在紫外誘變箱中，于3500 μJ/cm2的照射劑量下分別照射1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23 min后，取樣5 mL，其他操作同1.2.4.1，計算菌落數(shù)及紫外誘變致死率。

1.2.4.3突變菌株篩選初篩：將最佳誘變條件下的單菌落，挑入以p-NPG為底物的96孔板初篩培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3 d后，噴灑1 mol/L Na2CO3，觀察顯色情況，并挑選明顯呈黃色的菌落作為高產(chǎn)菌株進(jìn)行復(fù)篩［2］。復(fù)篩：將初篩顯色明顯的突變菌株接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)72 h，將發(fā)酵液于8000 r/min離心10 min后，收集上清液，即粗酶液，用于測定酶活力，篩選出酶活較高的菌株。

1.2.5酶活測定

1.2.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制稱取對硝基苯酚139.0 mg，蒸餾水定容至1000 mL，分別吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于100 mL容量瓶中，用1 mol/L Na2CO3溶液定容后混勻。以蒸餾水作為空白，于400 nm處測其吸光值。以對硝基苯酚濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［11］。

1.2.5.2酶活測定取0.1 mL粗酶液，加入0.2 mL 40 mmol/L p-NPG（pH5.5的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液配制）混勻，50℃保溫10 min后立即加入2 mL 1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)并顯色，室溫放置5 min，于400 nm下測定吸光值。以加熱滅活的酶液按照同樣處理做空白對照［14-15］。

酶活力計算公式如下：

式中：U為酶活力單位，U/mL；C為對硝基苯酚（p-NP）的濃度；V為反應(yīng)體系的體積；N為原酶液稀釋倍數(shù)；t為反應(yīng)時間；0.1為所取上清液或細(xì)胞液的體積。

β-葡萄糖苷酶酶活力力單位（U）定義為，在上述反應(yīng)條件下，1 min內(nèi)底物被釋放出1 μmol的p-NP所需要的酶量［15］。

1.2.6突變菌株產(chǎn)酶穩(wěn)定性驗(yàn)證對復(fù)篩獲得的高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶突變菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，連續(xù)傳代10次，測其β-葡萄糖苷酶酶活，觀察產(chǎn)酶穩(wěn)定性［9］。

1.2.7突變菌株生長曲線將篩選的產(chǎn)酶穩(wěn)定的突變菌株活化后接種至YPD培養(yǎng)基中，于28℃、160 r/min培養(yǎng)，每隔4 h取樣，在OD600下測吸光度值，繪制突變菌株生長曲線。

1.2.8突變菌株β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)

1.2.8.1β-葡萄糖苷酶最適溫度將粗酶液0.1 mL與0.2 mL pH5.5的p-NPG混合，分別在20、30、40、50、60、70、80℃環(huán)境下反應(yīng)10 min，并測定酶活力［16］。

1.2.8.2β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性將粗酶液分別置于20、30、40、50、60、70、80℃恒溫水浴鍋中保溫60 min，冷卻后測定酶活，計算相對酶活力（以4℃保存的原酶液酶活力為100%）［17］，評價β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.8.3β-葡萄糖苷酶最適pH將粗酶液0.1 mL分別與0.2 mL pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的p-NPG混和，在50℃下反應(yīng)10 min［16］，測定各組酶活力。

1.2.8.4β-葡萄糖苷酶的pH穩(wěn)定性在0.8 mL pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸緩沖液中，分別加入0.2 mL的粗酶液，4℃保溫24 h，分別測定剩余酶活力，計算相對酶活力（以加入0.8 mL雙蒸水的酶活力為100%）［17］，評價β-葡萄糖苷酶的pH穩(wěn)定性。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有平均值數(shù)據(jù)經(jīng)過IBM SPSS statistics 18.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以結(jié)果±標(biāo)準(zhǔn)差SD表示。

2　結(jié)果與分析

2.1對硝基苯酚溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

對硝基苯酚在堿性條件下顯黃色，在一定范圍內(nèi)，其濃度與吸光值成正比。如圖1所示，對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=19.957x－0.0087，相關(guān)系數(shù)R2=0.9970，吸光度與對硝基苯酚含量成線性關(guān)系。

圖1　對硝基苯酚溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of p-nitrophenol solution

2.2釀酒酵母MQFSM-3生長曲線

酵母MQFSM-3的生長曲線如圖2。由圖2可知，4～24 h為對數(shù)生長期，4 h以后酵母進(jìn)入對數(shù)生長期說明該野生釀酒酵母繁殖迅速。28 h后為穩(wěn)定期，菌體濃度基本保持不變。由于對數(shù)生長期的細(xì)胞為生理活性一致的活細(xì)胞，突變率高，重現(xiàn)性好［12］，因此本實(shí)驗(yàn)選擇對數(shù)生長中期的菌體進(jìn)行誘變，即選擇培養(yǎng)16 h的菌體進(jìn)行誘變處理。

圖2　酵母MQFSM-3生長曲線Fig.2　Growth curves of yeast MQFSC-3

2.3釀酒酵母MQFSM-3紫外誘變

2.3.1不同照射劑量下酵母致死率曲線出發(fā)菌株MQFSM-3在不同紫外劑量照射下與致死率的關(guān)系如圖3所示，MQFSM-3菌株細(xì)胞對紫外光非常敏感。隨著照射劑量增大，菌株致死率呈上升趨勢。據(jù)文獻(xiàn)報道，紫外誘變的致死率在75%～85%之間時，突變率相對較高［18］，獲得優(yōu)良性能菌株的可能性更大［19］。因此選擇80%左右的致死率，即誘變劑量為3500 μJ/cm2。

圖3　紫外輻照劑量對酵母致死率的影響Fig.3　Effect of radiation dose on lethality of yeast

2.3.2不同照射時間下酵母致死率曲線據(jù)文獻(xiàn)報道，紫外誘變照射時間不短于10～20 s，不長于10～20 min［20］。紫外輻照時間與致死率的關(guān)系如圖4所示，MQFSM-3隨著照射時間增長，菌株致死率呈上升趨勢，在照射9 min時致死率達(dá)到了81.09%。

2.4突變菌株篩選

由于p-NPG經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解后的產(chǎn)物p-NP在堿性條件下顯黃色［21］，因此將其作為反應(yīng)底物，利用96孔板培養(yǎng)進(jìn)行菌株初篩，根據(jù)顏色深淺來初步判斷酶活高低，顏色越深則酶活越高，以此篩選出顏色較深的12株菌株UV-11、UV-12、UV-22、UV-23、UV-24、UV-34、UV-35、UV-36、UV-44、UV-45、UV-46、UV-59。

圖4　紫外輻照時間對酵母致死率的影響Fig.4　Effect of radiation time on lethality of yeast

圖5　突變體β-葡萄糖苷酶酶活Fig.5　β-glucosidase activity of Mutant

通過對這12株菌搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，所得結(jié)果見圖5。對12株菌復(fù)篩所得的酶活力數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，根據(jù)顯著性分析，UV-11、UV-12、UV-23、UV-34、UV-45，這5株突變體與出發(fā)菌株MQFS M-3酶活力差異顯著（p＜0.05），分別比出發(fā)菌株提高了70.85%、57.54%、69.23%、56.47%、65.82%，說明菌株UV-11、UV-12、UV-23、UV-34、UV-45菌株所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力比原菌株有明顯提高。因此選擇這五株突變體進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

2.5突變菌株產(chǎn)酶穩(wěn)定性研究

將復(fù)篩得到的突變菌株UV-11、UV-12、UV-23、UV-34、UV-45經(jīng)過多次傳代后測酶活，結(jié)果如圖6所示，只有菌株UV-45傳代10次后β-葡萄糖苷酶酶活仍保持了85.14%，且傳代后比出發(fā)菌株MQFSM-3的酶活力提高了41.64%。因此選擇UV-45為目標(biāo)菌株做進(jìn)一步研究。

2.6MQFSM-3與突變體UV-45生長曲線

圖6　突變體產(chǎn)酶穩(wěn)定性Fig.6　Stability of Mutant enzyme production

圖7MQFSM-3與UV-45生長曲線Fig.7　Growth curves of MQFSM-3 and UV-45

突變菌株與出發(fā)菌株MQFSM-3生長曲線比較見圖7。由圖7可知，突變菌株UV-45生長曲線與出發(fā)菌株MQFSM-3基本一致，4～20 h為對數(shù)生長期，20 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體濃度基本保持不變，比出發(fā)菌株提前4 h進(jìn)入穩(wěn)定期。

2.7突變菌株U-45粗酶液的部分酶學(xué)性質(zhì)分析

2.7.1β-葡萄糖苷酶的最適溫度由圖8可知，β-葡萄糖苷酶的最適溫度約為50℃。溫度低于50℃時，酶活力隨溫度的升高而增大；溫度高于50℃時，酶活力隨溫度的升高而降低。溫度為80℃時酶幾乎失活。

圖8　β-葡萄糖苷酶最適溫度Fig.8　Optimal reaction temperatury of β-glucosidase

2.7.2β-葡萄糖苷酶熱穩(wěn)定性菌株UV-45 β-葡萄糖苷酶熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示，溫度在50℃以下時酶的穩(wěn)定性相對較好，能夠保持80%以上的酶活力，當(dāng)溫度超過50℃，酶活力急劇下降。當(dāng)溫度高于60℃時，基本不具備酶活。

2.7.3β-葡萄糖苷酶最適pH由圖10可知，β-葡萄糖苷酶的最適pH為5.5，酶活為75.34 U/mL。當(dāng)pH低于5.5時，酶活力隨著pH增高而增加；pH3.0環(huán)境下，β-葡萄糖苷酶活力為25.93 U/mL，是pH5.5時酶活的34.42%；當(dāng)pH高于5.5時，酶活力開始下降；pH8.0環(huán)境下酶活力為29.01 U/mL。

2.7.4β-葡萄糖苷酶pH穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖11所示，β-葡萄糖苷酶在pH4.0～6.5酶活力相對穩(wěn)定，均在80%以上。當(dāng)pH低于4時，相對酶活在60%以下；當(dāng)pH大于6.5時，酶活力急劇下降，并在pH7.5環(huán)境下，相對酶活僅為30%。

圖9　β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性Fig.9　Thermal stability of β-glucosidase

圖10　β-葡萄糖苷酶最適pHFig.10　Optimal pH of β-glucosidase

圖11　β-葡萄糖苷酶的pH穩(wěn)定性Fig.11　pH stability of β-glucosidase

3　結(jié)論

本文以本實(shí)驗(yàn)室保存的一株釀酒酵母MQFSM-3為出發(fā)菌株，以紫外照射其對數(shù)生長期菌體的方法進(jìn)行誘變，經(jīng)顯色反應(yīng)初篩和比色法復(fù)篩，得到了突變體UV-11、UV-12、UV-23、UV-34、UV-45，這5株突變體的β-葡萄糖苷酶的酶活較出發(fā)菌株有明顯提高，并根據(jù)產(chǎn)酶穩(wěn)定性確定UV-45為最優(yōu)突變體。

動態(tài)跟蹤了UV-45的生長規(guī)律，并研究其粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)，研究表明，該酶在20～50℃均具有較高的催化活力，其最適反應(yīng)溫度為50℃；β-葡萄糖苷酶在pH為4.0～6.5之間具有較高的酶活力，并且在pH為5.5時酶活力最高，即最適催化pH為5.5。

［1］王玉霞.阿氏絲孢酵母（Trichosporon asahii）β-葡萄糖苷酶及葡萄糖苷類風(fēng)味物質(zhì)水解機(jī)制的研究［D］.無錫：江南大學(xué)，2012.

［2］郭慧女.β-葡萄糖苷酶生產(chǎn)菌的選育及其對葡萄酒中結(jié)合態(tài)香氣的影響［D］.江蘇：江南大學(xué)，2010.

［3］李平，宛曉春.微生物發(fā)酵生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶［J］.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2000，27（2）：196-198.

［4］葛有輝，王德良，曹健.富含β-葡萄糖苷酶的酒香酵母在釀酒領(lǐng)域中的應(yīng)用［J］.釀酒科技，2011（2）：96-99.

［5］何芒芒.柑橘中糖苷香氣前體物質(zhì)及β-葡萄糖苷酶活性變化相關(guān)性研究［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

［6］趙杰祥，楊榮玲，肖更生.桑葚果酒酵母的誘變選育研究［J］.食品科技，2007，32（2）：33-37.

［7］張陳云，劉金福，何新益.冬棗果酒酵母的紫外誘變選育研究［J］.釀酒科技，2010（2）：31-34.

［8］李楊，李雷，任永利.耐酸酒精酵母的誘變選育研究［J］.釀酒科技，2013，40（6）：65-68.

［9］Ruchi Agrawal，Alok Satlewal，Ashok Kumar Verma. Development of a β-glucosidase hyperproducing mutant by combined chemical and UV mutagenesis［J］.Original Article 3 Biotech，2013，3：381-388.

［10］侯曉瑞，王婧，楊學(xué)山，等.甘肅河西走廊葡萄酒產(chǎn)區(qū)高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌株篩選［J］.食品科學(xué)，2014，35（23）：139-143.

［11］李慶華.高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶釀酒酵母的篩選及其發(fā)酵特性的研究［D］.西安：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2009.

［12］李新社，陸步詩，鄧孟橋，等.紫外誘變皮狀絲孢酵母選育高產(chǎn)油脂菌株［J］.中南大學(xué)學(xué)報，2011，42（3）：617-622.

［13］Xiaoru Hou，Shuo Yao.Improved inhibitor tolerance in xylose-fermenting yeast Spathaspora passalidarum by mutagenesis and protoplast fusion［J］.Applied microbial and cell physiology，2012，93：2591-2601.

［14］Gao Juan，Xuesong Zhao，Haibo Liu.A highly selective ginsenoside Rb1-hydrolyzing β-D-glucosidase from Cladosporium fulvum［J］.Process Biochemistry，2010，45（6）：897-903.

［15］馬騰臻，楊學(xué)山，張莉，等.紅佳釀酵母β-葡萄糖苷酶活性測定及產(chǎn)酶特性［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2014，40（10）：47-52.

［16］陳靜，郝偉偉，王春梅，等.產(chǎn)β-葡萄糖苷酶真菌的篩選鑒定、純化及酶學(xué)性質(zhì)分析［J］.食品科學(xué)，2013，34（5）：191-196.

［17］祝霞，盛文軍，楊學(xué)山，等.紅佳釀酵母β-葡萄糖苷酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)［J］.食品科學(xué)，2014，35（13）：147-150.

［18］涔沛林，蔡謹(jǐn).工業(yè)微生物［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：226-227.

［19］夏艷秋，朱強(qiáng)，汪志君，等.耐受性黃酒酵母YS6.2.5的選育及初步應(yīng)用［J］.食品科學(xué)，2010，31（23）：228-232.

［20］周德慶.微生物實(shí)驗(yàn)教程［M］.北京：高等教育出版社，2006：216.

［21］李慶華，劉樹文.產(chǎn)β-糖苷酶菌株的篩選及酶活的研究［J］.中國釀造，2009，27（6）：68-71.

UV mutation of production Saccharomyces cerevisiae strain of β-glucosidase and its enzyme characteristics

ZHANG Li，WANG Jing，YANG Ting，MA Teng-zhen，CHENG Chao，ZHU Xia，SHENG Wen-jun，HAN Shun-yu
（College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Gansu Key Lab of Viticulture and Enology，Research and Development Center of Wine Industry Technology in Gansu Province，Lanzhou 730070，China）

In order to screen a high extracellular β-glucosidase producing mutant strain of Saccharomycaes cerevisiae，the method of UV mutation was used on wild yeast of MQFSM-3.Death rate affected by UV mutagenesis conditions were determined，enzyme activity and enzymatic characteristics of mutant strain were also evaluated.The results showed that the dose of 3500 μJ/cm2，irradiation 9 min，mortality reached 81.09%. By preliminary screening，rescreening and subculturing for many times，a stable enzyme production of mutant UV-45 was obtained.Compared with the original strain，its enzyme activity was improved 41.64%.The enzymatic characteristics were analyzed that the optimum temperature of UV-45 was 50℃，and it had a good thermal stability between 20～50℃.The optimum pH was 5.5，and between pH4.0 to 6.5，the enzyme activity was relatively stable.

Saccharomycaes cerevisiae；UV mutagenesis；select；mutant

TS201.1

A

1002-0306（2015）20-0220-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.038

2015－03－16

張莉（1987-），女，碩士，研究方向：釀酒微生物，E-mail：15117115362@163.com。

韓舜愈（1963-），男，博士，教授，研究方向：果蔬加工及葡萄酒釀造，E-mail：gsndhsy@163.com。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31160310）；甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)專項(xiàng)（GNSW-2013-16）；甘肅省青年科學(xué)基金（1208RJYA082）。