滁州綠茶兒茶素組成及其抗氧化活性

安曉婷，謝小花，陳　靜，肖陸飛（滁州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與環(huán)境工程系，安徽滁州239000）

滁州綠茶兒茶素組成及其抗氧化活性

安曉婷，謝小花，陳靜，肖陸飛*
（滁州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與環(huán)境工程系，安徽滁州239000）

采用超高液相色譜（Ultra high performance liquid chromatography，UPLC）分析了7種滁州綠茶的兒茶素組成，并采用總抗氧化能力法（Total antioxidant capacity assay，TEAC）評(píng)價(jià)了7種綠茶的抗氧化能力。結(jié)果表明，7種滁州綠茶的兒茶素含量均較豐富，其中陽春白雪一級(jí)兒茶素含量最高，為78.93 mg/g。7種綠茶的表沒食子兒茶素沒食子酸酯（（-）-epigallocatechin gallate，EGCG）含量在24.28～33.89 mg/g之間，是含量最豐富的兒茶素單體。除此之外，滁州綠茶中沒食子兒茶素（（-）-Gallocatechin，GC）、表沒食子兒茶素（（-）-Epigallocatechin，EGC）和表兒茶素沒食子酸酯（（-）-Epicatechin gallate，ECG）的含量也較高?？寡趸钚詫?shí)驗(yàn)證明，總兒茶素、EGCG和ECG的含量與滁州綠茶抗氧化能力具有顯著的相關(guān)性。

滁州綠茶，兒茶素，超高液相色譜（UPLC），抗氧化活性

綠茶是世界上消費(fèi)量最大的飲料之一，長期飲用綠茶可以降低心血管疾病和腫瘤的發(fā)病率［1］。大量研究表明，綠茶中的茶多酚尤其是兒茶素是綠茶中的主要功能活性成分［2-3］。兒茶素是天然抗氧化劑［4］，具有抗氧化清除自由基、降低腫瘤致死率、降低心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)、降血脂、抑制脂肪吸收、防治Ⅱ型糖尿病、延緩衰老、抗炎、延緩神經(jīng)組織退化和抗菌的作用［5-8］。綠茶中富含（-）-EGCG，（-）-EC，（-）-ECG，（-）-EGC，（+）-C等兒茶素，其中（-）-EGCG的含量最高且生理活性最強(qiáng)［9］。

作為安徽省的特色綠茶資源，滁州綠茶有悠久的歷史。滁州綠茶前身為南譙貢茶［10］，《安徽茶經(jīng)》中記載，“宋朝，池州九華和六安壽州的龍芽，休寧的白岳金芽，全椒南譙茶，都是名茶，馳名全國”。滁州綠茶年產(chǎn)近數(shù)十萬，其芽葉細(xì)嫩，葉底嫩綠明亮，湯色嫩黃綠清澈，有著廣泛的消費(fèi)人群。目前，我國綠茶品種中，關(guān)于如西湖龍井、信陽毛尖、黃山毛峰等研究較多，它們多酚組成和生物學(xué)活性均有大量報(bào)道［11-13］。而作為一種地方特色天然抗氧化資源，滁州綠茶的目前受到的關(guān)注較少。

本文選取7種具有代表性的滁州綠茶，通過超高效液相色譜（UPLC）研究其兒茶素組成，并通過TEAC法評(píng)價(jià)其自由基清除能力，綜合比較不同茶葉抗氧化能力差異及其與八種兒茶素之間的相關(guān)性，為更好的開發(fā)和利用滁州綠茶資源提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

7種滁州綠茶均于2014年采自滁州施集茶廠，其中施集烘青一級(jí)采摘時(shí)間為5月1日，施集烘青特級(jí)采摘時(shí)間為2014年4月25日，施集毛峰特級(jí)采摘時(shí)間為4月12日，施集毛峰一級(jí)采摘時(shí)間為4月18日，陽春白雪一級(jí)采摘時(shí)間為4月5日，陽春白雪特級(jí)采摘時(shí)間為4月1日，陽春白雪極品采摘時(shí)間為3月26日；沒食子兒茶素（GC）、表沒食子兒茶素（EGC）、兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG），表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和兒茶素沒食子酸酯（CG）等8種兒茶素單體均購自美國Sigma-Aldrich；2，2’-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS） 購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；6-羥基-2，5，7，8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸（Trolox） 購自百靈威科技（北京）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

Agilent 1290 Infinity LC超高液相色譜儀美國Agilent公司；52S紫外可見分光光度計(jì)上海棱光技術(shù)有限公司；THZ-Q臺(tái)式冷凍恒溫振蕩器太倉市華美生化儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1兒茶素提取取1 g綠茶樣品在液氮中磨碎，在50 mL 60%乙醇（含0.2%甲酸）中40℃下振蕩提取12 h，離心力5000×g下離心30 min，取上清液用60%的乙醇在50 mL容量瓶中定容［14］。

1.2.2UPLC條件色譜柱：Zorbax SB-C18反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），美國Agilent公司。以含0.1%甲酸的水溶液為流動(dòng)相A，含0.1%甲酸的乙腈溶液為流動(dòng)相B，流速0.4 mL/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為0.5 μL，按照如下梯度洗脫：0～5 min，2%～10%B；5～8 min，10%～15%B；8～15 min，15%～50%B；15～20 min，50%～70%B；20～25 min，70%～85%B；25～35 min，85%B；Post Run 5 min。采用DAD檢測器，檢測波長為278 nm。配制濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品溶液，繪制濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用峰面積歸一法計(jì)算綠茶中8種兒茶素含量。

1.2.3總抗氧化能力（TEAC）測定參照Miller等［15］的方法略作改動(dòng)。將5 mL 7 mmol/L ABTS+·和88 μL 140 mmol/L過硫酸鉀混合，形成ABTS+·自由基儲(chǔ)備液，避光保存，使用前用無水乙醇稀釋成工作液，要求其在30℃、734 nm波長下吸光度為0.700±0.02。取100 μL梯度濃度待測液（烘青一級(jí)、烘青特級(jí)、毛峰一級(jí)、毛峰特級(jí)、陽春白雪特級(jí)為500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000 μg/mL；陽春白雪一級(jí)和陽春白雪極品為200、400、600、800、1000、1200、1400、1600、2000 μg/mL），空白管加入100 μL 80%乙醇，最后加入3.9 mL ABTS+·工作液，振蕩30 s，室溫下靜置6 min后，在734 nm處測吸光值變化。按下式計(jì)算ABTS+自由基清除率：

式中：Ai為加入待測液的吸光值；Aj為待測液的本底值；A0為不加待測液的對(duì)照值。IC50為對(duì)ABTS+自由基清除率達(dá)到50%時(shí)的樣品濃度。另以不同濃度Trolox（50、10、150、200、250、300、800、1000 μg/mL）做清除ABTS+自由基的曲線，Trolox的IC50除以樣品的IC50作為樣品的總抗氧化力，單位為mg Trolox equivalent（TE）/g。

1.2.4數(shù)據(jù)分析使用SPASS 14.0軟件，采用ANOVA法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。選取p＜0.05為顯著水平。

2　結(jié)果與分析

2.1兒茶素組成分析

7種滁州綠茶中兒茶素的UPLC分析如圖1所示，8種兒茶素單體在UPLC中均得到了高效、快速的分離。通過兒茶素標(biāo)品峰面積歸一法測定滁州綠茶中每種兒茶素的含量，得到7種滁州產(chǎn)綠茶的兒茶素組成（表1）。7種綠茶的EGCG含量在24.28～33.89 mg/g之間，是滁州綠茶中含量最高的兒茶素，除此之外，綠茶中GC、EGC和ECG的含量也較豐富（圖2），而另外四種兒茶素C、EC、GCG和CG的含量較低。其中CG的含量最低，不足EGCG的1%，烘青特級(jí)和陽春白雪一級(jí)中甚至未能檢測到CG。Friedman等［16］綜合分析了24種美國商業(yè)綠茶中的兒茶素含量，發(fā)現(xiàn)其中EGCG和ECG的含量最高，不同綠茶品種的EGC含量差異很大，在0～14.2 mg/g之間。另外，該研究發(fā)現(xiàn)CG的平均含量最低，低于1 mg/g，與本文報(bào)道較為一致。

圖1　7種滁州綠茶兒茶素UPLC中分離及紫外檢測（278nm）Fig.1　UPLC separation and UV detection（278nm）of catechins of 7 green teas in Chuzhou

圖2　滁州綠茶中主要兒茶素單體Fig.2　Major catechin monomers in green teas in Chuzhou

表1　7種滁州綠茶中主要兒茶素含量（mg/g）Table 1　Content of major catechin individuals in 7 green teas in Chuzhou（mg/g）

由表1可知，陽春白雪的GC、C、ECG含量分別介于15.43～22.59、1.13～2.60、10.82～17.73 mg/g之間，顯著高于毛峰和烘青，而EGC含量完全呈相反趨勢，為烘青＞毛峰＞陽春白雪。另外，其他幾種兒茶素未表現(xiàn)出明顯的品種規(guī)律性。不同品種綠茶兒茶素含量差異較大，陽春白雪一級(jí)的兒茶素總量最高，為78.93 mg/g，其次為陽春白雪極品，總量為77.77 mg/g，而烘青特級(jí)的兒茶素總量最低，為57.59 mg/g。3種陽春白雪的兒茶素平均總量為73.82 mg/g，稍低于毛峰（74.36 mg/g），而烘青最低，為63.85 mg/g。陽春白雪和烘青品種內(nèi)兒茶素總量差異顯著（p＜0.05），而毛峰一級(jí)和二級(jí)的兒茶素總量無顯著性差異（p＞0.05）。由此可以推斷，茶葉的葉片種類、葉齡、采摘時(shí)間以及制作工藝都會(huì)對(duì)綠茶的兒茶素含量造成影響。

根據(jù)Friedman等的研究結(jié)果［16］，24種美國消費(fèi)量最大的商業(yè)綠茶中只有8種綠茶的兒茶素含量在50 mg/g以上，而7種滁州綠茶的兒茶素含量均高于57 mg/g。西湖龍井的EC、ECG、EGC和EGCG的含量分別為5.27、9.97、28.07、35.46 mg/g［11］，其中EGC的含量稍高于滁州綠茶，而其余3種兒茶素的含量與滁州綠茶差異不大。另有報(bào)道指出龍井茶中GC含量低于1 mg/g，顯著低于滁州綠茶［12］。云南大葉青茶中GC、EGC、EGCG、EC、ECG的含量分別為1.317、9.479、27.98、7.872、15.000 mg/g［17］，其中EC含量高于滁州綠茶，GC含量顯著低于滁州綠茶。四川峨眉綠茶與云南大葉清茶GC含量相近，顯著低于滁州綠茶，而四川峨眉綠茶中EGCG含量高達(dá)51.692 mg/g，顯著高于滁州綠茶［17］。在安徽省內(nèi)綠茶中，六安瓜片和黃山毛峰的EGCG含量分別為64.3、93.9 mg/g，顯著高于滁州綠茶，而兩者的GC含量分別為0.3 mg/g和1.4 mg/g，顯著低于滁州綠茶，其余6種兒茶素單體的含量差異不明顯［12］。綜上所述，滁州綠茶相對(duì)于其他綠茶的主要優(yōu)勢在于豐富的GC含量。GC是一種自然界中稀有的兒茶素單體，具有重要的生理功能。七種滁州綠茶中GC含量介于7.97～22.59 mg/g之間，可以用來分離、制備GC單體。

2.2總抗氧化能力分析

采用TEAC法評(píng)價(jià)綠茶的抗氧化能力。Trolox與陽春白雪一級(jí)、烘青特級(jí)的自由基清除能力如圖3所示。由圖3可知，在同等濃度下，陽性對(duì)照Trolox的ABTS+自由基清除能力顯著強(qiáng)于綠茶，Trolox在濃度為300 μg/mL時(shí)自由基清除率接近100%。與Trolox的清除曲線相似，綠茶“陽春白雪一級(jí)”和“烘青特級(jí)”的自由基清除率隨濃度增加先呈直線上升，達(dá)到最高值（接近100%）之后平穩(wěn)。兩種綠茶達(dá)到最高自由基清除率的濃度分別在1400 μg/mL和4000 μg/mL附近。通過方法1.2.3計(jì)算7種滁州綠茶的IC50和TEAC值，如表2所示，在7種綠茶中，陽春白雪一級(jí)的IC50值最低（712.34 μg/mL），TEAC值最高，為173.62 mg TE/g，它的自由基清除能力最強(qiáng)；而烘青特級(jí)的IC50值最高，為2021.17 μg/mL，因此它的自由基清除能力和TEAC值在7種綠茶中最低。

圖3　Trolox與兩種綠茶ABTS+自由基清除曲線Fig.3　ABTS free radical scavenging curves of Trolox and two green teas

表2　7種滁州綠茶IC50值和TEAC值Table 2　IC50value and TEAC value of seven green teas in Chuzhou

進(jìn)一步研究兒茶素含量與抗氧化能力的相關(guān)性，結(jié)果如圖4所示，7種滁州綠茶TEAC值與兒茶素總量、EGCG和ECG含量存在一定的線性關(guān)系。其中，兒茶素的總量與TEAC值的相關(guān)性最高，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.814，與綠茶抗氧化活性呈極顯著正相關(guān)（p＜0.01）（表3），證明兒茶素是綠茶中主要的抗氧化活性物質(zhì)，周金偉等研究同樣證明，茶多酚和兒茶素的含量是綠茶抗氧化能力強(qiáng)弱的主要因素［18］。與兒茶素總量相比，EGCG和ECG與綠茶抗氧化能力的相關(guān)系數(shù)低，分別為0.513和0.672，但均與綠茶抗氧化能力呈顯著正相關(guān)（p＜0.05）。其他6種兒茶素中，GC、C、EC、CG與TEAC值呈正相關(guān)，而EGC和GCG與TEAC值呈負(fù)相關(guān)，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。綜上所述，?；瘍翰杷谽GCG與ECG是滁州綠茶中抗氧化能力最強(qiáng)的兒茶素，這或許與它們C環(huán)3號(hào)位的沒食子酸殘基相關(guān)。相關(guān)研究表明，C環(huán)3號(hào)位的沒食子酸殘基對(duì)兒茶素生物學(xué)活性具有重要影響［19］。另有研究證明，相對(duì)于EGC和EC，沒食子酸?；腅GCG和ECG具有更強(qiáng)的抗腫瘤能力［20］。

圖4　兒茶素總量、EGCG含量、EGC含量與TEAC值的相關(guān)性Fig.4　Correlation between total catechin content，EGCG content，and EGC content with TEAC value

表3　兒茶素含量與綠茶TEAC值的相關(guān)系數(shù)Table 3　The correlation coefficients of TEAC value and catechin content of green tea

3　結(jié)論

采用UPLC快速準(zhǔn)確的測定了7種滁州產(chǎn)綠茶中兒茶素組成，結(jié)果表明，7種滁州綠茶均含有豐富的兒茶素，其中，陽春白雪一級(jí)中的兒茶素總量最高，為78.93 mg/g，而烘青特級(jí)的兒茶素總量最低，為57.59 mg/g。兒茶素單體中，EGCG的含量在24.28～33.89 mg/g之間，是滁州綠茶中含量最豐富的兒茶素單體，除此之外，GC、ECG和EGC的含量也較豐富。通過TEAC法評(píng)價(jià)滁州綠茶的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)兒茶素總量、EGCG和ECG含量與滁州綠茶抗氧化能力具有顯著的相關(guān)性，是滁州綠茶中主要的抗氧化活性物質(zhì)。滁州綠茶中兒茶素含量豐富，抗氧化能力強(qiáng)，具有廣闊的開發(fā)利用前景和較高的飲用價(jià)值。

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Catechin composition and antioxidant capacity of green teas in Chuzhou

AN Xiao-ting，XIE Xiao-hua，CHEN Jing，XIAO Lu-fei*
（Department of Food and Environmental Engineering，Chuzhou Vocational and Technical College，Chuzhou 239000，China）

UPLC was applied to analyze the catechin composition in seven varieties of green teas，and their antioxidant capacity was further evaluated by TEAC assay.Results showed that green teas in Chuzhou were rich in catechin and YangChunBaiXue first level tea possessed the highest content of catechin，which was 78.93 mg/g.The content of EGCG of green teas ranged from 24.28 to 33.89 mg/g and it was the most abundant catechin monomer in Chuzhou green teas.In addition，Chuzhou green teas also exhibited high levels of GC，EGC and ECG.Furthermore，the content of total catechin，EGCG，and ECG revealed high significant correlation with antioxidant activity of green teas.

Chuzhou green teas；catechin；ultra high performance liquid chromatography（UPLC）；antioxidant capactiy

TS207.3

A

1002-0306（2015）20-0137-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.020

2015－03－01

安曉婷（1986-），女，碩士，助教，研究方向：營養(yǎng)與功能因子，E-mail：anxiaotin@163.com。

肖陸飛（1976-），男，博士，副教授，研究方向：有機(jī)合成，E-mail：foodjys@126.com。

安徽省省級(jí)示范實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心建設(shè)項(xiàng)目（20101427）；安徽省卓越人才培養(yǎng)計(jì)劃（2013zjjh051）。