固定化共生發(fā)酵紅茶菌飲料工藝的研究

任二芳，牛德寶，郭海蓉，劉功德

（1.廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西南寧530001；2.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧530004）

固定化共生發(fā)酵紅茶菌飲料工藝的研究

任二芳1，牛德寶1，郭海蓉2，*，劉功德1

（1.廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西南寧530001；2.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧530004）

采用固定化細(xì)胞技術(shù)實(shí)現(xiàn)紅茶菌飲料的固定化共生發(fā)酵，對(duì)其工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)以發(fā)酵液中的總酸含量、總糖利用率以及對(duì)發(fā)酵液的感官評(píng)價(jià)分值為考查指標(biāo)，探討了蔗糖添加量、接種量、菌種比例以及發(fā)酵時(shí)間等因素對(duì)固定化細(xì)胞共生發(fā)酵紅茶菌飲料的影響，并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了固定化共生發(fā)酵紅茶菌飲料的最佳工藝條件。結(jié)果表明：當(dāng)蔗糖添加量為70g/L，接種量為7.5%，菌種比例（酵母菌J∶醋酸菌C）為6∶4，發(fā)酵時(shí)間為6d時(shí)，制得的紅茶菌飲料色澤均勻，香味怡人，酸甜可口，具有紅茶菌發(fā)酵液特有的風(fēng)味。

固定化，共生發(fā)酵，紅茶菌飲料

紅茶菌是一種傳統(tǒng)的酸性保健飲料，它是由酵母菌、醋酸菌和乳酸菌等多種微生物共同對(duì)糖茶水進(jìn)行發(fā)酵而成。紅茶菌在我國(guó)民間有“海寶”、“胃寶”之稱(chēng)。紅茶菌含有多種有益成分，例如茶多酚、氨基酸、生物堿、茶多糖、乙酸、乳酸、葡萄糖醛酸、D-葡萄糖二酸-1，4-內(nèi)酯、乙醇、蛋白質(zhì)、維生素、微量元素等。紅茶菌的保健作用主要包括：提高人體免疫力，清理腸胃，促進(jìn)消化，降低血壓、血糖，防治心血管疾病和糖尿病，減少各種結(jié)石的發(fā)生，消毒解毒，防癌、抗癌等［1-5］。

近些年來(lái)，除了一些東南亞國(guó)家，紅茶菌飲料在歐洲中部和東部各國(guó)，以及在德國(guó)、美國(guó)和加拿大等西方國(guó)家頗受歡迎。目前，在國(guó)內(nèi)，紅茶菌都是采用游離菌混合靜置的傳統(tǒng)方式培養(yǎng)，然而這種傳統(tǒng)的方式存在多種弊端：易受到雜菌污染，受季節(jié)影響大，菌種不宜保藏等。固定化技術(shù)是采用物理或化學(xué)手段將酶或細(xì)胞束縛于一定的范圍內(nèi)，使它們既保持原有的活性，又可以在連續(xù)反應(yīng)后回收并實(shí)現(xiàn)重復(fù)利用的一項(xiàng)技術(shù)［6］。同游離細(xì)胞相比，細(xì)胞經(jīng)固定化后在單位體積內(nèi)細(xì)胞濃度大幅度增加，提高發(fā)酵速率；其次，固定化細(xì)胞發(fā)酵性能穩(wěn)定；再者，細(xì)胞固定后可以重復(fù)利用，對(duì)于生產(chǎn)胞外產(chǎn)品的發(fā)酵簡(jiǎn)化了細(xì)胞分離的步驟，這些優(yōu)點(diǎn)節(jié)約了發(fā)酵過(guò)程的生產(chǎn)成本［7］。近幾十年來(lái)對(duì)固定化細(xì)胞的研究越來(lái)越多，目前該技術(shù)已經(jīng)較為成熟，其應(yīng)用涉及到醫(yī)療保健、食品發(fā)酵工業(yè)、環(huán)境保護(hù)、能源開(kāi)發(fā)以及生物傳感器等各個(gè)領(lǐng)域［8-11］。

固定化細(xì)胞技術(shù)共生發(fā)酵紅茶菌飲料，不僅可有效解決游離菌混合靜置發(fā)酵生產(chǎn)紅茶菌時(shí)存在的弊端，而且這種發(fā)酵方式有助于控制產(chǎn)品的質(zhì)量，對(duì)紅茶菌飲料的開(kāi)發(fā)和利用有一定的指導(dǎo)意義。因此本文通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定固定化共生發(fā)酵紅茶菌飲料的最佳工藝，從而為紅茶菌飲料實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)提供一定的參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌種山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室純化保存的紅茶菌中的酵母菌菌株和醋酸菌菌株；鐵觀音原香綠茶由福建省安溪新美茶業(yè)有限公司生產(chǎn)；白砂糖為市購(gòu)；海藻酸鈉、明膠均為化學(xué)純，購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；其他試劑均為分析純，購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

手提式壓力蒸汽滅菌器貴州省開(kāi)陽(yáng)醫(yī)療器械廠；SP-752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上海光譜儀器有限公司；LRH-250-Z全溫振蕩培養(yǎng)箱廣東省醫(yī)療器械廠；L550低速自動(dòng)平衡離心機(jī)長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1工藝流程

1.2.2操作要點(diǎn)

1.2.2.1培養(yǎng)基的配制酵母菌活化培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，蔗糖（或葡萄糖）20g，瓊脂15～20g，蒸餾水1000mL，自然pH，121℃滅菌20min；醋酸菌活化培養(yǎng)基：酵母浸膏10g，葡萄糖10g，碳酸鈣15g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，pH6.8，121℃滅菌20min，培養(yǎng)基冷卻至50℃左右，加入4%的無(wú)水乙醇；紅茶菌發(fā)酵培養(yǎng)基：將7g綠茶添加到1000mL沸水中，浸提20min，再將一定量的蔗糖加入到茶液中，混勻溶解后進(jìn)行分裝，250mL三角瓶的裝液量為120mL，用八層紗布封口，并用牛皮紙包扎，進(jìn)行巴氏滅菌，冷卻至室溫后備用。

1.2.2.2固定化細(xì)胞的制備將5.5%的海藻酸鈉和1.5%的明膠充分溶解，滅菌后待其溫度降至室溫時(shí)，將細(xì)胞濃度均約為3×107cell/mL的酵母菌菌懸液和醋酸菌菌懸液分別與等體積的固定化載體溶液充分混勻，混勻后的酵母菌混合液和醋酸菌混合液再分別用注射器滴入到0.51%的氯化鈣溶液中，固定1h后用無(wú)菌水沖洗，重新加入0.51%的氯化鈣溶液，4℃平衡過(guò)夜，即可制得固定化酵母菌顆粒、固定化醋酸菌顆粒［12］。

1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)紅茶菌固定化后轉(zhuǎn)入紅茶菌發(fā)酵培養(yǎng)基，在30℃、150r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定發(fā)酵液中的總酸含量、總糖利用率并對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，以此為參考指標(biāo)，探討蔗糖添加量、接種量、菌種比例以及發(fā)酵時(shí)間等因素對(duì)固定化細(xì)胞共生發(fā)酵紅茶菌飲料的影響，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.1蔗糖添加量固定接種量7.5%，菌種比例5∶5，發(fā)酵時(shí)間6d，考察不同蔗糖添加量50、60、70、80、90、100g/L對(duì)固定化細(xì)胞共生發(fā)酵紅茶菌飲料的影響。

1.2.3.2接種量固定蔗糖添加量80g/L，菌種比例5∶5，發(fā)酵時(shí)間6d，考察不同接種量2.5%、5.0%、7.5%、10%、12.5%、15%對(duì)固定化細(xì)胞共生發(fā)酵紅茶菌飲料的影響。

1.2.3.3菌種比例固定蔗糖添加量80g/L，接種量7.5%，發(fā)酵時(shí)間為6d，考察不同菌種比例3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2（酵母菌J∶醋酸菌C，v/v）對(duì)固定化細(xì)胞共生發(fā)酵紅茶菌飲料的影響。

1.2.3.4發(fā)酵時(shí)間固定蔗糖添加量80g/L，接種量7.5%，菌種比例5∶5，考察不同發(fā)酵時(shí)間2、4、6、8、10d對(duì)固定化細(xì)胞共生發(fā)酵紅茶菌飲料的影響。

1.2.4正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，研究影響固定化細(xì)胞共生發(fā)酵紅茶菌飲料的四個(gè)因素：蔗糖添加量（A）、接種量（B）、菌種比例（C）和發(fā)酵時(shí)間（D），每個(gè)因素選取三個(gè)水平，按L9（34）正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，因素水平表如表1所示。

表1　正交實(shí)驗(yàn)因素與水平表Table 1　Factors and levels of orthogonal design experiment

1.3分析方法

1.3.1總酸的測(cè)定采用GB/T 12456-2008《食品中總酸的測(cè)定》中的酸堿滴定法。

1.3.2總糖利用率的測(cè)定采用3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定蔗糖含量［13］。

1.3.3感官評(píng)價(jià)指標(biāo)組織8人為感官評(píng)價(jià)小組，根據(jù)表2的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)不同產(chǎn)品的色澤、香味、滋味、組織狀態(tài)進(jìn)行鑒定并打分，多人感官評(píng)價(jià)打分的平均值作為最終的感官評(píng)價(jià)結(jié)果［14］。

1.3.4數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理并繪制圖表，利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素條件對(duì)固定化共生發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

2.1.1蔗糖添加量對(duì)發(fā)酵液的影響從圖1可以看出，隨著蔗糖添加量的增加，發(fā)酵液的總糖利用率總體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，當(dāng)蔗糖添加量為50g/L時(shí)，發(fā)酵液的總糖利用率最大，蔗糖添加量為100g/L時(shí)，發(fā)酵液的總糖利用率最小，而隨著蔗糖添加量的增加，發(fā)酵液中的總酸含量呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)蔗糖添加量為60～80g/L時(shí)，發(fā)酵液的總酸含量和總糖利用率變化均很微小。由此可見(jiàn)蔗糖濃度越大，對(duì)微生物的抑制作用越強(qiáng)，總糖利用率越低，由于發(fā)酵液中總酸含量和總糖含量在一定程度上反映了發(fā)酵液的品質(zhì)，因此，初步確定蔗糖添加量為60～80g/L。

表2　感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2　Sensory evaluation standard

圖1　蔗糖添加量對(duì)發(fā)酵液總酸含量和總糖利用率的影響Fig.1　The effect of the amount of sucrose added on the total acid content and total sugar utilization of the fermentation broth

由表3可知，隨著蔗糖添加量的增加，感官評(píng)價(jià)分值呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，這是因?yàn)檎崽翘砑恿窟^(guò)低或過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液偏酸或偏甜，而當(dāng)蔗糖添加量為80g/L時(shí)，發(fā)酵液酸甜可口，品質(zhì)最佳，感官評(píng)價(jià)分值最高。

表3　感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 3　Sensory evaluation results

所以，綜合考慮蔗糖添加量對(duì)固定化共生發(fā)酵效果的影響，確定蔗糖添加量為80g/L。

2.1.2接種量對(duì)發(fā)酵液的影響發(fā)酵液中總酸含量是判斷紅茶菌成熟的主要指標(biāo)之一，當(dāng)總酸含量達(dá)到6～10g/L時(shí)即認(rèn)為發(fā)酵成熟［15］。由圖2分析可得，隨著接種量的增加，發(fā)酵液的總酸含量和總糖利用率均不斷增加，但接種量在10%～15%時(shí)發(fā)酵液的總酸含量差別不大，這是由于接種量過(guò)大時(shí)，酵母菌J和醋酸菌C會(huì)大量消耗發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用于它們自身的繁殖，同時(shí)伴隨著大量代謝廢物的產(chǎn)生，從而不利于獲得所需的發(fā)酵產(chǎn)物［16］。同時(shí)，接種量大于10%時(shí)，發(fā)酵液中總酸含量過(guò)大，影響發(fā)酵液品質(zhì)；而接種量為2.5%時(shí)，發(fā)酵不徹底，發(fā)酵液的總酸含量?jī)H為4.73g/L，達(dá)不到紅茶菌成熟時(shí)要求的標(biāo)準(zhǔn)，這說(shuō)明接種量過(guò)高或過(guò)低，都不利于紅茶菌的發(fā)酵，因此，初步確定接種量為5%～7.5%。

圖2　接種量對(duì)發(fā)酵液總酸含量和總糖利用率的影響Fig.2　The effect of the inoculum rate on the total acid content and total sugar utilization of the fermentation broth

由表4可知，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著接種量的增加，感官評(píng)價(jià)分值呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)接種量為7.5%時(shí)，感官評(píng)價(jià)分值最高，這說(shuō)明采用7.5%的接種量制得的紅茶菌液品質(zhì)最好。

表4　感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 4　Sensory evaluation results

因此，綜合考慮接種量對(duì)固定化共生發(fā)酵效果的影響，確定接種量為7.5%。

2.1.3菌種比例對(duì)發(fā)酵液的影響從圖3可以看出，隨著醋酸菌C的比例不斷減小，發(fā)酵液的總酸含量呈遞減趨勢(shì)，這是因?yàn)榇姿峋鶦的作用是氧化乙醇產(chǎn)生乙酸，乙酸又是構(gòu)成發(fā)酵液中總酸的主要組成成分。菌種比例為8∶2時(shí)發(fā)酵液的總糖利用率較低，其他五種菌種比例的發(fā)酵液的總糖利用率變化不大。當(dāng)酵母菌J與醋酸菌C比例大于6∶4時(shí)，發(fā)酵液的總酸含量低于6g/L，達(dá)不到紅茶菌成熟標(biāo)準(zhǔn)，而當(dāng)酵母菌J與醋酸菌C比例為4∶6、3∶7時(shí)，總酸含量過(guò)大，發(fā)酵液過(guò)酸。因此，初步確定菌種比例為5∶5、6∶4。

由表5可知，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著醋酸菌C的比例不斷下降，發(fā)酵液的感官評(píng)價(jià)分值，呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)酵母菌J∶醋酸菌C為5∶5時(shí)，感官評(píng)價(jià)分值最高。

所以，綜合考慮菌種比例對(duì)固定化共生發(fā)酵效果的影響，確定酵母菌與醋酸菌比例為5∶5。

2.1.4發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液的影響從圖4可以看出，發(fā)酵時(shí)間從2～10d時(shí)，發(fā)酵液中總酸含量和總糖利用率隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，總糖利用率的增長(zhǎng)趨勢(shì)快于總酸含量，這是因?yàn)榧t茶菌中的酵母菌和醋酸菌生長(zhǎng)繁殖不僅需要消耗糖類(lèi)物質(zhì)，而且乙酸、乙醇等產(chǎn)物的生成也需要通過(guò)糖類(lèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。而發(fā)酵時(shí)間為6d時(shí)，發(fā)酵液中總酸含量為10.45g/L，可達(dá)到紅茶菌發(fā)酵成熟的標(biāo)準(zhǔn)。

表5　感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 5　Sensory evaluation results

表6　感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 6　Sensory evaluation results

圖3　菌種比例對(duì)發(fā)酵液總酸含量和總糖利用率的影響Fig.3　The effect of the ratio of strain inoculum on the total acid content and total sugar utilization of the fermentation broth

圖4　發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液總酸含量和總糖利用率的影響Fig.4　The effect of fermentation time on the total acid content and total sugar utilization of the fermentation broth

由表6可知，發(fā)酵時(shí)間過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)時(shí)，感官評(píng)價(jià)分值偏低，發(fā)酵液品質(zhì)不佳，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為6d時(shí)，感官評(píng)價(jià)分值最高，發(fā)酵液品質(zhì)較好。

因此，綜合考慮發(fā)酵時(shí)間對(duì)固定化共生發(fā)酵效果的影響，確定發(fā)酵時(shí)間為6d。

2.2正交實(shí)驗(yàn)

為確定固定化共生發(fā)酵紅茶菌飲料的最優(yōu)工藝，在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及方差分析分別如表7、表8所示。

表7　正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 7　Orthogonal experiment design and its result

表8　實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 8　Experimental results and analysis of variance

由表7得知，選擇的四個(gè)因素對(duì)固定化菌發(fā)酵的影響程度由大到小依次為B＞D＞A＞C，即接種量＞發(fā)酵時(shí)間＞蔗糖添加量＞菌種比例。直接比較表7中的9組實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，A1B2C2D2組合發(fā)酵所得紅茶菌飲料的評(píng)分最高，而比較各因素的k值可得，最優(yōu)工藝組合為A1B2C3D2。另外，從表8可知，各因素對(duì)紅茶菌飲料感官評(píng)價(jià)的影響均不顯著。

所以，將組合A1B2C2D2和組合A1B2C3D2再次分別進(jìn)行多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到發(fā)酵液的感官評(píng)價(jià)分值的均值分別為84.50、87.00分，從而確定固定化共生發(fā)酵紅茶菌飲料的最優(yōu)工藝為A1B2C3D2，即蔗糖添加量為70g/L，接種量為7.5%，菌種比例為6∶4，發(fā)酵時(shí)間為6d。在此條件下，制得的紅茶菌飲料色澤均勻，香味怡人，酸甜可口，具有紅茶菌發(fā)酵液特有的風(fēng)味。

3　結(jié)論

利用固定化細(xì)胞技術(shù)實(shí)現(xiàn)了紅茶菌飲料的固定化共生發(fā)酵，通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)最終得出固定化菌發(fā)酵紅茶菌飲料的最佳工藝條件為：蔗糖添加量為70g/L，接種量為7.5%，菌種比例（酵母菌J∶醋酸菌C）為6∶4，發(fā)酵時(shí)間為6d；四個(gè)因素對(duì)固定化菌發(fā)酵效果的影響程度由大到小依次為接種量＞發(fā)酵時(shí)間＞蔗糖添加量＞菌種比例。在此條件下進(jìn)行紅茶菌飲料的發(fā)酵，得到的紅茶菌飲料色澤均勻，香味怡人，酸甜可口。

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Study on the preparation process of Kombucha beverage of symbiosis fermentation by immobilized cell technology

REN Er-fang1，NIU De-bao1，GUO Hai-rong2，*，LIU Gong-de1
（1.Guangxi Subtropical Crops Research Institute，Nanning 530001，China；2.Light Industry and Food Engineering Institute，Guangxi University，Nanning 530004，China）

Kombucha beverage of symbiosis fermentation by immobilized cell technology had an important significance for its industrial production.In this experiment，the total acid content，total sugar utilization and sensory evaluation results of the fermentation broth was used as index.In the first，the study discussed the effects of fermentation conditions including the amount of sucrose added，the inoculum rate，the ratio of strain inoculum and the fermentation time on symbiosis fermentation of Kombucha beverage by immobilized cell technology.And then orthogonal experiment was used to optimize the preparation process of Kombucha beverage of symbiosis fermentation by immobilized cell technology.The results showed that the optimal condition of symbiosis fermentation of Kombucha beverage by immobilized cell technology for：the amount of sucrose added was 70g/L，the inoculum rate was 7.5%，the ratio of strain inoculum was 6∶4，fermentation lasted 6 days. The Kombucha beverage produced according to this preparation technology remained uniform color，pleasant aroma，the distinctive flavor of mellow sweet and sour.

immobilization；mixed culture fermentation；Kombucha beverage

TS275.4

A

1002-0306（2015）12-0193-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.032

2014－08－29

任二芳（1986-），女，碩士研究生，研究方向：功能食品開(kāi)發(fā)與生物發(fā)酵制品研究。

郭海蓉（1962-），女，教授，研究方向：糖料資源功能與綜合利用研究。

廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目（桂熱研201409）。