丁苯酞對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的預(yù)防作用及機(jī)制研究

周 菲，張敬文，王 衛(wèi)

（海南省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，?？?570311）

丁苯酞對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的預(yù)防作用及機(jī)制研究

周 菲＊，張敬文，王 衛(wèi)

（海南省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，?？?570311）

目的：研究丁苯酞對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的預(yù)防作用及機(jī)制。方法：將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和丁苯酞低、中、高劑量組（50、75、100 mg/kg），每組10只，各組大鼠每天ig相應(yīng)藥物1次，假手術(shù)組及模型組大鼠ig等量生理鹽水，連續(xù)3 d。末次給藥后除假手術(shù)組外其余各組大鼠再灌注120 min后檢測(cè)各組大鼠心肌梗死面積比例、細(xì)胞凋亡率、凋亡相關(guān)蛋白[促凋亡蛋白（Caspase-3、Fas、Caspase-9）、抑制凋亡蛋白（Bcl-2）]表達(dá)、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和血清中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）含量。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡率均明顯升高，心肌細(xì)胞中Caspase-3、Fas、Caspase-9蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減弱，LVEF和血清VEGF含量明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，除丁苯酞低劑量組大鼠的LVEF無(wú)明顯變化（P＞0.05）外，其余各給藥組大鼠的上述指標(biāo)均明顯改善（P＜0.05）。與丁苯酞低劑量組比較，丁苯酞高劑量組大鼠的心肌梗死面積、細(xì)胞凋亡率均明顯降低（P＜0.05）；丁苯酞中、高劑量組大鼠心肌細(xì)胞中Caspase-3、Fas、Caspase-9蛋白表達(dá)明顯減弱，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.05）。結(jié)論：丁苯酞可有效減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷，保護(hù)心功能，其機(jī)制可能與上調(diào)VEGF有關(guān)。

丁苯酞；心肌缺血再灌注損傷；細(xì)胞凋亡；大鼠

ABSTRACTOBJECTIVE：To study the preventive effect and mechanism of butylphthalide on myocardial ischemia-reperfusion injury in rats.METHODS：SD rats were randomly divided into sham operation group，model group，butylphthalide low-dose，medium-dose，high-dose groups（50，75，100 mg/lg），10 in each group.All rats were intragastrically administrated related drugs once a day，sham operation group and model group were intragastrically administrated equal amount of normal saline，for 3 d.After last administration，except for sham operation group，120 min of repertusion was conducted.Ratio of myocardial infarction area，apoptosis rate of myocardial cells，expressions of apoptosis-related protein[proapoptotic proteins（Caspase-3，F(xiàn)as，Caspase-9），apoptotic protein（Bcl-2）]，left ventricular ejection fraction（LVEF），and content of vascular endothelial growth factor（VEGF）in serum of rats in other groups were detected.RESULTS：Compared with sham operation group，myocardial infarction area and apoptosis rate of myocardial cells in model group were obviously increased；expressions of Caspase-3，F(xiàn)as，Caspase-9 protein in myocardial cells were obviously enhanced，Bcl-2 protein expression was obviously weakened；LVEF and serum VEGF content were obviously reduced（P＜0.01）.Compared with model group，except that LVEF in butylphthalide low-dose group didn’t changed obviously（P＞0.05），above indexes in other administration groups improved obviously（P＜0.05）.Compared with butylphthalide low-dose group，myocardial infarction area and apoptosis rate of myocardial cells in butylphthalide high-dose group were obviously decreased（P＜0.05）；expressions of Caspase-3，F(xiàn)as，Caspase-9 protein in myocardial cells in butylphthalide medium-dose，high-dose groups were obviously weakened，and Bcl-2 protein expression was obviously enhanced（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Butylphthalide can effectively reduce myocardial ischemia-reperfusion injury in rats，protect cardiac functions，and its mechanism may be related with up-regulating VEGF.

KEYWORDSButylphthalide；Myocardial ischemia-reperfusion injury；Cell apoptosis；Rats

心血管疾病是中老年人群的常見(jiàn)病，每年因患該疾病致死人群數(shù)量在逐漸上升，其中包括心肌梗死在內(nèi)的缺血性心臟病是主要的死因[1]。一系列的研究結(jié)果表明，造成心肌組織損傷的主要原因，除了缺血所致?lián)p傷之外，在恢復(fù)血液再灌注后會(huì)對(duì)缺血心肌造成更嚴(yán)重的傷害，該現(xiàn)象稱(chēng)為缺血再灌注損傷（Ischemia-reperfusion，I/R），通過(guò)抑制心肌細(xì)胞凋亡保護(hù)I/R帶來(lái)的心肌損傷已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[2]。丁苯酞臨床上用于治療腦I/R，其作用廣泛，且口服同樣有效，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)丁苯酞也有保護(hù)心肌細(xì)胞的效果[3]。本研究用丁苯酞預(yù)處理大鼠，考察丁苯酞對(duì)大鼠心肌I/R的預(yù)防作用及機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

Cobas8000全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)羅氏制藥有限公司）；MK3酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；H-7650透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）；Z323K低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Hermle公司）；RM-6240B/C多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)（成都儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

丁苯酞對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：20160329，純度：≥98%）；原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記（TUNEL）試劑盒（美國(guó)Roche公司）；兔抗人細(xì)胞凋亡抑制因子（Fas）、B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶9（Caspase-9）、Caspase-3 Western blot試劑盒和辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（上海拜力生物科技有限公司）；牛血清蛋白（德國(guó)Merck Millipore公司）；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）試劑盒（上海信帆生物科技有限公司）。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，8周齡，♂，體質(zhì)量290～320 g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為：SCXK（豫）2016-0005。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)大鼠的處理已通過(guò)本院動(dòng)物倫理委員會(huì)同意。

2 方法

2.1 心肌I/R模型的建立

按照文獻(xiàn)[4]方法建立心肌I/R模型。大鼠術(shù)前禁食不禁水12 h后，以3%戊巴比妥鈉（70 mg/kg）ip麻醉3～5 min后仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)，氣管插管，連接呼吸機(jī)。胸骨正中切口，鈍性分離皮下組織及肌肉，于胸骨左緣3～4助間開(kāi)胸，打開(kāi)心包膜，分離脂肪，于左心耳下緣1 mm處以7號(hào)針線在冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD）下方穿縫合線，將充水（0.5 mL）的球囊置于血管與結(jié)扎線間。結(jié)扎造成心肌缺血，心電圖監(jiān)測(cè)顯示ST段抬高0.2 mV為心肌缺血建模成功。持續(xù)30 min后打開(kāi)結(jié)扎線，抽出球囊，關(guān)胸再灌注120 min。

2.2 分組與給藥

參照文獻(xiàn)[3]選擇丁苯酞的給藥劑量。將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和丁苯酞低、中、高劑量組（50、75、100 mg/kg），每組10只。將丁苯酞對(duì)照品溶于0.5%聚山梨酯80溶液中，質(zhì)量濃度為8 mg/mL，各組大鼠ig相應(yīng)劑量的藥物，假手術(shù)組和模型組大鼠ig等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)3 d。然后除假手術(shù)組外，其余各組大鼠按“2.1”項(xiàng)下方法建立心肌I/R模型。

2.3 心肌梗死面積的測(cè)定

按照文獻(xiàn)[5]方法測(cè)定。各組大鼠再灌注后用3.6%水合氯醛以0.15 mL/10 g麻醉后用肝素抗凝，取出心臟后用心臟灌流液經(jīng)冠狀動(dòng)脈灌流沖洗，結(jié)扎LAD，用1%Evans Blue生物染色劑灌注。灌注結(jié)束后分離心房和心室組織，將心室放入特制容器內(nèi)，加冷卻至4℃的瓊脂糖固定心臟。垂直心室長(zhǎng)軸橫行切片，每片1～2 mm，將切片放入培養(yǎng)皿中，加入含2%2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4），37℃閉關(guān)孵育30 min，置于10%甲醛溶液中過(guò)夜，封片。切片中藍(lán)色為非缺血區(qū)心肌，紅色和灰紅相間為缺血區(qū)心?。ˋAR），灰白色為梗死心?。↖S）。用掃描儀成像，Image Pro Plus 6.0圖片分析軟件計(jì)算各部分面積和梗死面積比例，梗死面積比例＝梗死面積/缺血面積×100%。

2.4 TUNEL法測(cè)定心肌細(xì)胞凋亡率

將各組大鼠心臟放入PBS中，剪下缺血區(qū)心肌，洗凈，用4%多聚甲醛于4℃固定24 h。將固定好的心肌組織用乙醇和二甲苯脫水及透明后，石蠟包埋，切片，按TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕黃色。根據(jù)凋亡細(xì)胞分布，每張切片拍攝5張圖片，每個(gè)標(biāo)本切片隨機(jī)選取5個(gè)400倍視野，計(jì)算平均每100個(gè)細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率＝凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

2.5 Western blot法測(cè)定凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

取各組大鼠缺血區(qū)心肌組織10 mg，按每10 mg組織加入200 μL的RIPA裂解液及PMSF蛋白抑制劑，研磨后將心肌細(xì)胞勻漿轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1.5 mL的EP管中，置于冰上15 min充分裂解，離心后棄上清液，－20℃保存。用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜，封閉，加入稀釋1 000倍的一抗液，封口，4℃孵育過(guò)夜，用PBS洗膜3次；再加入稀釋5 000倍的HRP標(biāo)記的二抗，封口，PBS洗膜3次；將膜浸泡于增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑中5 min，除去多余液體后壓片，在暗盒中于X-光底片上曝光5 min后顯影，檢測(cè)灰度值。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參β肌動(dòng)蛋白（β-actin）灰度值的比值表示Caspase-3（促凋亡蛋白）、Fas（外在途徑促凋亡蛋白）、Caspase-9（促凋亡蛋白）和Bcl-2（內(nèi)在途徑抑制凋亡蛋白）的相對(duì)表達(dá)水平。

2.6 心臟功能評(píng)估

將10%水合氯醛麻醉后的大鼠置于自制木板上，用超聲診斷儀進(jìn)行大鼠心臟超聲檢查，并讀取左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF），用以評(píng)估大鼠心臟功能。

2.7 血清中VEGF含量測(cè)定

各組大鼠再灌注后取眼眶內(nèi)眥動(dòng)脈血4 mL，常溫靜置30 min，3 000 r/min（離心半徑13.5 cm）離心20 min，取上清液按VEGF試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)血清中VEGF含量。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，細(xì)胞凋亡率采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 心肌梗死面積比例與細(xì)胞凋亡率

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的心肌梗死面積比例和細(xì)胞凋亡率均明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠的心肌梗死面積比例和細(xì)胞凋亡率均明顯降低（P＜0.05）。與丁苯酞低劑量組比較，丁苯酞高劑量組大鼠的心肌梗死面積比例和細(xì)胞凋亡率均明顯降低（P＜0.05）。各組大鼠心肌梗死面積比例和細(xì)胞凋亡率的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠心肌梗死面積比例和細(xì)胞凋亡率的測(cè)定結(jié)果（x±s，n＝10）Tab 1 Determination results of myocardial infarction area ratio and cell apoptosis rate of rats in each group（x±s，n＝10）

3.2 心肌細(xì)胞凋亡情況

在400倍光鏡下可見(jiàn)細(xì)胞核為棕黃色的凋亡細(xì)胞、細(xì)胞核為藍(lán)色的正常細(xì)胞。假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞中絕大部分細(xì)胞核為藍(lán)色；模型組大鼠心肌細(xì)胞中大部分細(xì)胞核為棕黃色；而丁苯酞低、中、高劑量組大鼠心肌細(xì)胞中均可觀察到細(xì)胞核為棕黃色的凋亡細(xì)胞，但凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯少于模型組，其凋亡細(xì)胞數(shù)目排序?yàn)槎”教邉┝拷M＜丁苯酞中劑量組＜丁苯酞低劑量組。各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡的顯微鏡圖見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡的顯微鏡圖（×400）Fig 1 Microscope figure of myocardial cell apoptosis of rats in each group（×400）

3.3 凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞中Caspase-3、Fas、Caspase-9蛋白表達(dá)均明顯增強(qiáng)，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減弱（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠心肌細(xì)胞中Caspase-3、Fas、Caspase-9蛋白表達(dá)均明顯減弱，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.05）；其中，丁苯酞中、高劑量組改善效果明顯強(qiáng)于丁苯酞低劑量組（P＜0.05）。各組大鼠心肌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖見(jiàn)圖2，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

圖2 各組大鼠心肌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖Fig 2 Electrophoresis chart of expressions of apoptosis-related proteins in myocardial cells in each group

表2 各組大鼠心肌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的測(cè)定結(jié)果（x±s，n＝10）Tab 2 Determination results of expressions of apoptosis-related proteins in myocardial cells in each group（x±s，n＝10）

3.4 心臟LVEF及血清中VEGF含量測(cè)定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心臟LVEF和血清中VEGF含量均明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，除丁苯酞低劑量組大鼠的LVEF無(wú)明顯變化外（P＞0.05），其余各給藥組大鼠心臟的LVEF和血清中VEGF含量均明顯升高（P＜0.05）。各組大鼠的LVEF和血清VEGF含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠的LVEF和血清VEGF含量的測(cè)定結(jié)果（x±s，n＝10）Tab 3 Determination results of LVEF，serum VEGF contents of rats in each group（x±s，n＝10）

4 討論

溶栓治療、冠狀動(dòng)脈介入手術(shù)和冠狀動(dòng)脈搭橋等是臨床治療急性心肌梗死的常用手段，可恢復(fù)心肌細(xì)胞血液灌注，但后來(lái)發(fā)現(xiàn)療效沒(méi)有達(dá)到預(yù)期值。經(jīng)過(guò)多位學(xué)者的研究提出了心肌I/R的概念[6]。心肌I/R是指心肌細(xì)胞發(fā)生缺血性損傷后，恢復(fù)血液灌注后反而更加重了原來(lái)受損細(xì)胞的功能和代謝障礙[7]。心肌細(xì)胞凋亡是心肌I/R發(fā)生的重要標(biāo)志，因此采取有效手段減少心肌I/R，抑制細(xì)胞凋亡，可達(dá)到保護(hù)心臟的目的。

關(guān)于心肌細(xì)胞凋亡的誘因有很多，主要通過(guò)兩條途徑實(shí)現(xiàn)：第一條稱(chēng)為外在途徑，主要利用細(xì)胞間的死亡配基活化相關(guān)受體實(shí)現(xiàn)。Fas配體屬于介導(dǎo)宿主防御和免疫反應(yīng)的腫瘤壞死因子（TNF）超家族，通過(guò)與配體FasL結(jié)合活化，進(jìn)一步與Caspase-8形成復(fù)合物，激活凋亡執(zhí)行因子Caspase-3、Caspase-5、Caspase-7，最終啟動(dòng)凋亡程序[8]。第二條稱(chēng)為內(nèi)在途徑或線粒體途徑，Bcl-2/Bax家族相關(guān)蛋白是此途徑研究最多的一系列蛋白。大量的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)包括各種應(yīng)激、DNA損失和異常的細(xì)胞信號(hào)都可以引起B(yǎng)cl-2家族促凋亡相關(guān)蛋白的活化，進(jìn)而誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素c、凋亡小體或促使Caspase-9活化，最終導(dǎo)致 Caspase-3、Caspase-5、Caspase-7活化，通過(guò)蛋白酶水解使細(xì)胞崩潰[9]。目前研究發(fā)現(xiàn)心肌I/R促細(xì)胞凋亡主要與激活Bcl-2通路有關(guān)[10]。

丁苯酞是從芹菜籽中提取的天然產(chǎn)物，起初由于其顯著的神經(jīng)保護(hù)作用被關(guān)注。有研究結(jié)果顯示，丁苯酞可抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、改善細(xì)胞功能、減少細(xì)胞梗死面積、改善線粒體功能和抑制氧化損傷等[11]。而丁苯酞對(duì)心臟的作用研究較少。丁苯酞主要的作用靶點(diǎn)在血管內(nèi)皮細(xì)胞，其作用范圍廣泛，可對(duì)多種器官起作用。近年對(duì)丁苯酞研究范圍逐漸擴(kuò)大，其對(duì)心臟的作用慢慢為人所知[12]。Moghadam MH等[13]最早發(fā)現(xiàn)了芹菜籽提取物對(duì)高血壓大鼠模型的作用，并指出丁苯酞是發(fā)揮療效的主要物質(zhì)；Wang W等[14]對(duì)上述現(xiàn)象的機(jī)制進(jìn)一步研究，提出丁苯酞通過(guò)雙孔鉀離子通道TREK-1作用于心肌細(xì)胞的機(jī)制；Wang YG等[15]應(yīng)用丁苯酞作用于心肌梗死再灌注損傷大鼠，觀察到丁苯酞抑制細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象，但未對(duì)其機(jī)制作進(jìn)一步解析。

在缺血缺氧等特定條件的刺激作用下可引發(fā)人體血管的新生。在血管新生的過(guò)程中，受到多種體內(nèi)外因素包括促進(jìn)與抑制VEGF、神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)等，其中，VEGF作為一類(lèi)對(duì)血管生長(zhǎng)調(diào)節(jié)具有重要作用的細(xì)胞因子，是血管的再生及形成過(guò)程中的重要信號(hào)關(guān)聯(lián)蛋白之一。本研究發(fā)現(xiàn)，丁苯酞可改善大鼠LVEF，提示其可改善心肌損傷大鼠心室收縮和舒張功能；還可通過(guò)上調(diào)血清VEGF的表達(dá)水平，從而對(duì)心肌缺血疾病起到一定的保護(hù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，丁苯酞可有效預(yù)防大鼠心肌I/R，保護(hù)心功能；其機(jī)制可能是同時(shí)通過(guò)細(xì)胞凋亡外在途經(jīng)及內(nèi)在途經(jīng)起作用，并與VEGF的表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果為急性缺血性心臟病的治療提供了新的研究思路。

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（編輯：鄒麗娟）

Study on the Preventive Effect and Mechanism of Butylphthalide on Myocardial Ischemia-reperfusion Injury in Rats

ZHOU Fei，ZHANG Jingwen，WANG Wei
（Dept.of Cardiovascular Medicine，Hainan Provincial People’s Hospital，Haikou 570311，China）

R965

A

1001-0408（2017）25-3518-04

2017-01-19

2017-06-07）

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.25.17

＊主治醫(yī)師，碩士。研究方向：冠心病介入治療。E-mail：13379950245@163.com