cbh1重組菌的構(gòu)建、產(chǎn)酶條件及酶特性分析

謝志皓，張慶慶，2，*，湯　　斌，2，李　　松，黨同學(xué)（.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖24000；2.微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽蕪湖24000）

cbh1重組菌的構(gòu)建、產(chǎn)酶條件及酶特性分析

謝志皓1，張慶慶1，2，*，湯斌1，2，李松1，黨同學(xué)1
（1.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖241000；2.微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽蕪湖241000）

從匍枝根霉TP-02中克隆得到cbh1的cDNA，序列測定分析表明，該基因編碼526個氨基酸的蛋白質(zhì)。通過DS2.5同源模擬分析，CBHI酶的活性部位是一個“桶狀”的隧道結(jié)構(gòu)。將cbh1基因的cDNA序列克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET22b（+）中，在大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。采用兩步層析法對重組的CBHI蛋白進(jìn)行純化，對純酶的特性進(jìn)行分析。結(jié)果表明：在異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷誘導(dǎo)終濃度為0.5 mmol/L，誘導(dǎo)溫度為20℃，誘導(dǎo)時間為14 h，經(jīng)過純化后獲得比活力為3.57 IU/mg。重組酶的最適反應(yīng)溫度和pH分別為55℃和5.5，在pH4.5～6.5的范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，F(xiàn)e3+和Co2+對其具有較強(qiáng)的激活作用；以微晶纖維素為底物，Km值為6.1 mg·mL-1。

匍枝根霉，cbh1，克隆和表達(dá)，純化，酶學(xué)性質(zhì)

纖維素是地球上最廣泛的可再生利用資源，由纖維素酶作用纖維素鏈上β-1，4糖苷鍵降解成單糖［1］。纖維素酶是復(fù)合酶，由內(nèi)切葡聚糖酶（EG）、外切葡聚糖酶（CBH）和β-葡萄糖苷酶（BG）3個組分組成［2］。通過分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，研究者根據(jù)不同來源的物種以及碳水化合物酶類（CAZy）分成不同的蛋白質(zhì)家族［3］，纖維素酶是GH（Glycoside Hydrolase）家族中分布最多的酶類之一。纖維素酶廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，如纖維素酶能有效改善米糠膳食纖維中酚類物質(zhì)的溶出，提高抗氧化性［4］；采用纖維素酶水解液中的纖維二糖發(fā)酵制備丁二酸［5］等。

微生物是纖維素酶來源最廣的群落之一，CBH在天然纖維素的降解過程中具有主導(dǎo)作用，目前對cbh1（外切葡聚糖酶）的研究主要在曲霉屬、木霉屬、青霉屬［6-8］，任大明等［9］將綠色木霉cbh1和黃時海等［10］將康寧木霉cbh1在大腸桿菌中成功進(jìn)行表達(dá)。cbh1在根霉屬的研究較少，而匍枝根霉發(fā)酵纖維素酶具有發(fā)酵周期短的優(yōu)點［11］，能分泌EG、CBH和BG。對匍枝根霉降解木質(zhì)素的研究主要在纖維素酶［11］和木聚糖酶［12］。本研究以Rhizopus stolonifer TP-02為出發(fā)菌株［13］，通過克隆技術(shù)擴(kuò)增出cbh1，分析cbh1的作用機(jī)制，構(gòu)建的重組菌具有生產(chǎn)周期短，但較酵母真菌表達(dá)的酶活低，可能的原因是大腸桿菌缺乏協(xié)助蛋白折疊的系統(tǒng)［14］，通過低溫誘導(dǎo)發(fā)酵減少包涵體的形成，使蛋白可溶性表達(dá)，純化后獲得較高活力的纖維二糖水解酶，以期在米糠膳食纖維、丁二酸的發(fā)酵等食品行業(yè)中應(yīng)用。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

匍枝根霉TP-02（Rhizopus stolonifer TP-02）由本實驗室從中國黃山生態(tài)林腐木上分離得到；E.coli DH5α和E.coli BL21（DE3）、pET22-b（+）Vector為本實驗室保藏；Taq酶、dNTP、T4 DNA Ligase、NdeI、NotI、克隆質(zhì)粒pMD18-T低分子量蛋白Takara；胰蛋白胨、酵母粉、UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒、IPTG、氨芐硫酸鹽試劑、引物設(shè)計、微晶纖維素、Tris堿、考馬斯亮藍(lán)R-250、BSA、Acrylamide、Bisacrylamide、AP、TEMED上海Sangon公司；HisTrapTMFF，HiTrap DEAE FF為GE公司產(chǎn)品；其他藥品為國藥分析純；誘導(dǎo)培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基配制方法參見文獻(xiàn)［15］；緩沖液A20 mmol/L Tris-HCl+0.5 mol/L NaCl+20 mmol/L C3H4N2，pH=7.5；緩沖液B20 mmol/L Tris-HCl+0.5 mol/L NaCl+200-500 mmol/L C3H4N2，pH= 7.5；緩沖液C20 mmol/L Tris-HCl，pH=7.5；緩沖液D20 mmol/L Tris-HCl+0-0.5 mol/L NaCl，pH=7.5。

QHZ-123B型組合式全溫度振蕩培養(yǎng)箱太倉市華美生化儀器廠；Q/YXLZ82型紫外可見分光光度計上海儀電分析儀器有限公司；Allg64R型高速冷凍離心機(jī)美國貝克曼公司；SC1000型PCR儀美國Bio-Red公司；GDS8000型UVP凝膠成像系統(tǒng)美國UVP公司；DYY-6C型電泳儀北京六一儀器廠；?KTA prime plusGE Healthcare公司；FD8型冷凍干燥機(jī)美國西盟公司。

1.2cbh1基因的克隆

將Rhizopus stolonifer TP-02接種至PDA培養(yǎng)基中30℃、180 r/min條件下進(jìn)行活化24 h，以10%的接種量轉(zhuǎn)接到CMC誘導(dǎo)培養(yǎng)基中于上述條件下培養(yǎng)56 h，收集菌體并干燥；用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取Rhizopus stolonifer的總RNA，以提取的總RNA為模板，Oligo dT-Adaptor為引物，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈，以所合成的鏈為模板，（Forward primer：5’-GGAATTCCATATGGAATTCCATGCAGCA GGTCGGCACTTAC-3’；Reverse primer：5’-ATAAGA ATGCGGCCGCATGGTGATGGTGATGATGCAAGCAC TGCGAGTA-3’）為引物擴(kuò)增cbh1的cDNA。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測、膠回收與pMD18-T載體連接，通過熱激法轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α中，藍(lán)白斑篩選陽性克隆子，并提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗證，正確的克隆子送測序。

1.3cbh1的生物信息學(xué)分析

根據(jù)獲得的DNA序列，在GenBank上用Blast程序與數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對分析，并利用DNASTAR、 Discovery Stodio 2.5軟件，完成對cbh1的生物信息學(xué)分析。

1.4cbh1的克隆表達(dá)

1.4.1表達(dá)載體的構(gòu)建pET22b（+）質(zhì)粒和目的基因都用NdeI/NotI進(jìn)行雙酶切，經(jīng)切膠回收后用T4DNA連接酶16℃過夜連接，然后轉(zhuǎn)化到E.coli BL21（DE3）中，在含氨芐抗性的LB平板上進(jìn)行篩選陽性克隆子，并進(jìn)行質(zhì)粒抽提和雙酶切驗證，鑒定正確的克隆子送測序。

1.4.2重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)將含有pET22b-cbh1的重組菌接種在LB培養(yǎng)基中在37℃中培養(yǎng)，在OD600為0.8～1.0時，加入終濃度為0～0.8 mmol/L IPTG，于25℃誘導(dǎo)8 h后測定酶活；以最佳的IPTG濃度為條件，將誘導(dǎo)溫度變?yōu)?8、20、22、25、30、37℃，誘導(dǎo)8 h后測定酶活；以最佳的IPTG濃度和誘導(dǎo)溫度為條件，將誘導(dǎo)時間變?yōu)?、6、8、12、14、16 h測定酶活，考察IPTG終濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間對產(chǎn)酶的影響。

1.5重組蛋白的純化

1.5.1重組菌的發(fā)酵及粗酶液的制備按照優(yōu)化的條件進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵，冷凍離心收集細(xì)胞，用適量緩沖液A懸浮，在冰浴中超聲破碎（250 W，超聲2 s，間歇5 s，共15 min）收集上清為粗酶液。

1.5.2CBHI蛋白的純化采用GE Healthcare的?KTA prime plus純化系統(tǒng)，HisTrapTMFF親和柱用緩沖液A平衡后，將樣品吸附在柱上并平衡，用緩沖液B進(jìn)行線性洗脫，收集洗脫峰并測酶活。收集酶活樣品，使用HiTrap Desalting脫鹽后上樣于經(jīng)過緩沖液C平衡的HiTrap DEAE FF離子交換柱，用緩沖液D進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫峰并測酶活；合并酶活樣品使用HiTrap Desalting脫鹽并通過SDS-PAGE分析。

1.5.3CBHI酶活的測定［16］在反應(yīng)體系中，以微晶纖維素為底物，將0.5 mL適當(dāng)稀釋的酶液加入試管中，混勻后與50℃水浴中反應(yīng)30 min，終止反應(yīng)，離心，加入DNS在沸水浴中顯色，測定上清液中的還原糖，每分鐘水解生成1 μmol葡萄糖所需的酶量為1個酶活國際單位（IU）。

1.6酶學(xué)性質(zhì)研究

1.6.1最適反應(yīng)溫度、pH及其穩(wěn)定性的研究根據(jù)趙梅等［17］的方法，以40～80℃之間（每5℃作為1個梯度）來研究酶的最適反應(yīng)溫度，以pH為2～8之間研究其最適反應(yīng)pH，并在不同溫度下處理酶液，以未處理（0℃），計相對酶活為100%來研究酶的熱穩(wěn)定性，以將酶液放置在pH為2～8之間的緩沖液（pH3.0～6.0、50 mmol/L HAc-NaAc；pH6.1～8.0、50 mmol/L PBS）中放置相同時間，研究pH的穩(wěn)定性。

1.6.2Km的測定［18］在最適反應(yīng)溫度和pH的條件下，用50 mmol/L、pH為5.5的HAc-NaAc緩沖液配制不同質(zhì)量濃度的微晶纖維素底物，按照酶活測定的方法測定酶活，以1/V和1/［S］雙倒數(shù)作圖，計算出CBHI酶的Km。

1.6.3金屬離子對酶活的影響［19］以不加金屬離子的樣品為對照，計100%，在酶的反應(yīng)體系中加入Fe3+、Cu2+、Ca2+、Co2+、Ba2+、Mn2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+、Ag+和Hg2+使其在反應(yīng)體系中終濃度為1 mmol/L和5 mmol/L，計算不同金屬離子存在時的相對酶活性，研究金屬離子對CBHI酶活力的影響。

2　結(jié)果和分析

2.1Rhizopus stolonifer cbh1基因的克隆和分析

按照1.2的方法從Rhizopus stolonifer提取總RNA并合成cDNA鏈，利用引物擴(kuò)增cbh1的cDNA，結(jié)果如圖1所示；通過膠回收后與pUCm-T載體連接，獲得重組質(zhì)粒pUCm-T-cbh1，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和質(zhì)粒驗證后并測序，獲得1578 bp的序列，獲得GenBank登陸號：KF916015.1。根據(jù)DNAMAN 6.0進(jìn)行開放閱讀框分析，該序列編碼526個氨基酸的蛋白質(zhì)，CDD數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果顯示，cbh1編碼的蛋白質(zhì)歸屬于GH7家族，PROTPARAM預(yù)測其編碼蛋白的理化性質(zhì)，CBHI的分子式為C2393H3641N649O829S28，目的蛋白大小預(yù)計為56 ku，理論pI為4.7，酸性氨基酸殘基總數(shù)（Asp+Glu）為49，堿性氨基酸（Arg+Lys）為29，表明其為酸性蛋白質(zhì)，親水性平均系數(shù)（GRAVY）為-0.402，結(jié)合ProtScale的分析結(jié)果，推斷CBHI蛋白為可溶性蛋白。利用DS 2.5進(jìn)行CBHI的同源建模，其1～442為催化區(qū)域（CD），443～495為連接區(qū)域（Linker），496～526為結(jié)合區(qū)域（CBM），通過同源建模分析，在催化區(qū)域內(nèi)，CBHI的活性部位被loop覆蓋，形成一個“桶狀”的隧道結(jié)構(gòu)，與Zhong等［20］的研究結(jié)果相一致，具有典型的GH7家族特征。

圖1　匍枝根霉cbh1 cDNA的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1　Electrophoresis of PCR products of cDNA encoding cbh1 from Rhizopus stolonifer

2.2cbh1基因的克隆表達(dá)

將克隆載體pUCm-T-cbh1和與表達(dá)載體pET22b（+）分別進(jìn)行雙酶切，膠回收cbh1和線性化的pET22b（+）進(jìn)行連接，重組質(zhì)粒圖譜如圖2所示，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21（DE3）中，獲得命名為E.coli BL21（DE3）/pET22b-cbh1的重組菌。抽提重組菌質(zhì)粒并用雙酶切驗證，正確的質(zhì)粒送生工測序。

圖2　重組質(zhì)粒Pet22（b）/cbh1質(zhì)粒圖譜Fig.2　Construction of the plasmid of pET22（b）/cbh1

2.3表達(dá)條件的優(yōu)化

重組菌經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)后，在菌體破碎液的上清中檢測到其含有CBHI活性，通過SDS-PAGE分析誘導(dǎo)表達(dá)前后的表達(dá)量，結(jié)果如圖3所示，在誘導(dǎo)后有一條56 ku的蛋白條帶出現(xiàn)，結(jié)果表明構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET22b-cbhI在E.coli BL21（DE3）中得到了表達(dá)。

圖3　SDS-PAGE分析CBHI在載體中的表達(dá)Fig.3　SDS-PAGE analysis of recombinant expression of CBHI

按照1.4.2的方法，培養(yǎng)E.coli BL21（DE3）/pET22bcbh1，加入不同濃度的IPTG，結(jié)果如圖4所示，當(dāng)IPTG濃度在0～0.5 mmol/L時，隨著濃度的增加酶活逐漸增高，0.5～0.8 mmol/L時，隨著濃度的增加酶活逐漸降低，在IPTG終濃度為0.5 mmol/L時誘導(dǎo)效果最佳，原因是低濃度的IPTG對重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)有促進(jìn)作用，而高濃度則對菌體有一定的毒害作用，使表達(dá)量低；重組菌在18～37℃進(jìn)行誘導(dǎo)研究，結(jié)果如圖5所示，低于20℃時，其酶活較低，高于20℃時，隨著溫度的增加酶活下降，出現(xiàn)這種原因可能是在高溫的條件下，宿主菌表達(dá)較快，CBHI以包涵體的形式存在，可溶性表達(dá)較少，在20℃下誘導(dǎo)酶活最佳；在此基礎(chǔ)上，在4～16 h內(nèi)研究重組菌誘導(dǎo)時間對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖6所示，在4～14 h時，隨著誘導(dǎo)時間的增加，CBHI的可溶性表達(dá)增加，在14 h酶活達(dá)到最高，原因可能是在發(fā)酵的后期，營養(yǎng)物質(zhì)被消耗，產(chǎn)酸增加，重組菌出現(xiàn)自溶。最終確定最佳的誘導(dǎo)條件為IPTG終濃度為0.5 mmol/L，誘導(dǎo)溫度為20℃，誘導(dǎo)時間為14 h。

圖4　IPTG濃度對CBHI表達(dá)的影響Fig.4　Effect of IPTG concentration on CBHI activity

圖5 誘導(dǎo)溫度對CBHI表達(dá)的影響Fig.5　Effect of inducing temperature on CBHI activity

圖6 誘導(dǎo)時間對CBHI表達(dá)的影響Fig.6　Effect of inducing time on CBHI activity

2.4CBHI蛋白的純化

由于目的蛋白上帶有His標(biāo)簽，采用HisTrapTMFF親和柱對重組的CBHI進(jìn)行純化可以迅速獲得大量的目的蛋白，結(jié)果如圖7的泳道1～2，在目的蛋白下面還含有一條雜帶，為了得到高純度的CBHI蛋白和比活力，進(jìn)一步采用HiTrap DEAE FF離子交換柱對目的蛋白進(jìn)行純化，經(jīng)過SDS-PAGE分析如圖7的泳道3、4所示，蛋白分子量與預(yù)測的大小相符合，進(jìn)一步證明Rhizopus stolonifer的cbh1基因在宿主E.coli BL21（DE3）中正確表達(dá)，純化后目的蛋白的酶活力為3.57 IU/mg，蛋白純化倍數(shù)為5.82。

圖7　CBHI分離純化SDS-PAGE凝膠電泳分析Fig.7　Purification and SDS-PAGE analysis of CBHI from E.coli BL21（DE3）/Pet-22b-cbh1

2.5CBHI酶學(xué)性質(zhì)

2.5.1最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性按照1.6.1的方法，溫度對CBHI的影響的結(jié)果如圖8所示，從結(jié)果中可以看出，在40～55℃下隨溫度的升高，酶活力逐步增加，當(dāng)溫度高于55℃時，其活力開始下降，所以CBHI的最適反應(yīng)溫度為55℃，同時，該酶在50～60℃時都能保持90%以上的活力。此外，將該酶在30～80℃下保溫不同時間后，在0℃中冷卻，與未處理的酶液進(jìn)行對比，結(jié)果如圖9所示，當(dāng)處理溫度大于60℃時，CBHI酶蛋白發(fā)生不可逆的變性，CBHI的酶活急劇下降。

圖8　溫度對CBHI活性的影響Fig.8　Effect of temperature of CBHI

圖9　CBHI在不同溫度下的穩(wěn)定性Fig.9　Thermal stability of CBHI

2.5.2最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性根據(jù)1.6.2的方法，pH對CBHI酶活的影響結(jié)果由圖10可以看出，CBHI酶活隨著pH的升高，酶活逐漸增加，在pH為5.5時，CBHI酶活達(dá)到最高，pH大于5.5時，隨著pH的升高，酶活逐漸下降，當(dāng)pH為8時，酶活力僅有30%。此外，從圖10的pH穩(wěn)定性研究結(jié)果可以得出，該CBHI酶在pH4.5～6.5條件下，殘余酶活能保持在80%以上。

圖10　CBHI的最適pH和pH穩(wěn)定性Fig.10　The optimum pH and pH stability of CBHI

2.5.3Km的測定按照1.6.3的方法，CBHI酶液與不同濃度的底物反應(yīng)，在標(biāo)準(zhǔn)的條件下測定CBHI酶活力，根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法計算出1/V和1/［S］，結(jié)果如圖11所示，得到CBHI的Km值為6.1 mg·mL-1。

圖11　CBHI的Lineweaver-Burk圖Fig.11　Lineweaver-Burk of CBHI

2.5.4金屬離子對CBHI酶活力的影響按照1.6.4的方法，金屬離子對CBHI酶活力的影響結(jié)果如表1所示，與對照組相比Fe3+和Co2+對CBHI具有較強(qiáng)的激活作用，5 mmol/L較1 mmol/L的Co2+對CBHI的激活作用不明顯；Cu2+、Ca2+和Mn2+對CBHI的水解作用具有一定的促進(jìn)作用；相反，Ag+和Hg2+會抑制CBHI的活性，這可能是纖維素酶與半胱氨酸、組氨酸和羧基殘基共價鍵形成鹽，使纖維素酶失活。

表1　金屬離子對CBHI酶活力的影響Table 1　Effect of metal ions on the activity of purified recombinant CBHI

3　結(jié)論

從Rhizopus stolonifer TP-02中成功克隆了cbh1的編碼基因，并分析cbh1屬于GH7家族，該cbh1的活性中心位于一個長Loop所形成的“桶狀”隧道。cbh1編碼526個氨基酸，具有外切酶的完整結(jié)構(gòu)，即結(jié)合域、催化域和連接區(qū)域。通過在E.coli BL21（DE3）原核表達(dá)和發(fā)酵條件優(yōu)化，在IPTG終濃度為0.5 mmol/L，誘導(dǎo)溫度為20℃，誘導(dǎo)時間為14 h獲得較高的酶活。利用兩步層析法獲得純度較高的CBHI蛋白，純化后目的蛋白的酶活力為3.57 IU/mg，純化倍數(shù)提高了5.82倍。通過研究CBHI的酶學(xué)性質(zhì)表明，CBHI的最適反應(yīng)溫度為55℃，最適反應(yīng)pH為5.5，在pH4.5～6.5的范圍內(nèi)較為穩(wěn)定；以微晶纖維素為底物，Km值為6.1 mg·mL-1；Fe3+和Co2+對CBHI具有較強(qiáng)的激活作用。

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Recombinant construction，optimization and enzymatic properties analysis of cellobiohydrolase 1

XIE Zhi-hao1，ZHANG Qing-qing1，2，*，TANG Bin1，2，LI Song1，DANG Tong-xue1
（1.College of Biochemical Engineering，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China；2.Engineering Technology Research Center of Anhui Microbial Fermentation，Wuhu 241000，China）

In this study，the cDNA sequence was cloned from the total RNA of the strain Rhizopus stolonifer TP-02. Sequence analysis showed that this gene encoded a polypeptide with 526 amino acids.Homology modeling was established by DS2.5 software to study cbh1 catalytic hydrolysis and the active site of CBHI was a tunnel structure of“barrel.The cbh1 cDNA sequence of the gene was inserted into expression vector pET22b（+）and expressed in E.coli BL21（DE3）.Using two-step chromatography column to purification of CBHI.Enzymatic properties of the recombinant CBHI were also investigated.Results showed that the recombinant CBHI activity could reach 3.57 IU/mg at the IPTG concentration of 0.5 mmol/L at 20℃ for induction 14 h.The optimum reaction temperature and pH were 55℃and 5.5，and it was stable over a range of pH 4.5~6.5.Fe3+and Co2+were promoted to CBHI activity and the Kmwas 6.1 mg·mL-1with avicel.

Rhizopus stolonifer；cbh1；cloning and expression；purification；enzymatic properties

TS201.3

A

1002-0306（2015）18-0224-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.036

2015－01－06

謝志皓（1988-），男，在讀碩士研究生，研究方向：微生物資源利用與開發(fā)，E-mail：xiezhihao1008@163.com。

張慶慶（1954-），女，教授，研究方向：現(xiàn)代微生物發(fā)酵技術(shù)，E-mail：zhangqq@ahpu.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金項目（31270135）；安徽省自然科學(xué)青年基金資助項目（1408085QC61）。