藏靈菇發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的影響因素及其應(yīng)用研究

王　輯，田　政，趙　笑，曹永強(qiáng)，楊貞耐，*（.北京工商大學(xué)，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京00048；.北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司，北京0300）

藏靈菇發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的影響因素及其應(yīng)用研究

王輯1，田政2，趙笑1，曹永強(qiáng)1，楊貞耐1，*
（1.北京工商大學(xué)，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京100048；2.北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司，北京101300）

利用苯酚-硫酸法從15個(gè)不同地區(qū)藏靈菇樣品中篩選出3個(gè)高產(chǎn)胞外多糖樣品（K4、K7、K12）。通過(guò)單因素分析確定K4、K7、K12高產(chǎn)胞外多糖的條件為：接種量K4為9%、K7和K12為7%；發(fā)酵時(shí)間K12為12 h、K4和K7為18 h；發(fā)酵溫度均為37℃；脫脂乳濃度均為11%。藏靈菇K4、K12分別與商業(yè)發(fā)酵劑搭配制備發(fā)酵乳，結(jié)果表明，K12發(fā)酵乳的凝乳時(shí)間最短（4.52 h），胞外多糖含量和活菌數(shù)分別保持在50 mg/L左右和8.20 log cfu/mL以上，且具有較高的持水力和黏度。

藏靈菇，胞外多糖，發(fā)酵乳，乳酸菌

藏靈菇（又稱開(kāi)菲爾粒）是由多種微生物共生形成的一種不規(guī)則的、含有黏性多糖的粒狀混合物，此混合物中棲息的多種乳酸菌、酵母菌、醋酸菌，形成一個(gè)穩(wěn)定的共生體系［1］。藏靈菇是一種天然的乳品發(fā)酵劑，具有良好的發(fā)酵特性，用它制作的酸奶與傳統(tǒng)的酸奶或用其他純種乳酸菌發(fā)酵劑制成的產(chǎn)品有很大的不同，最顯著的特征是除乳酸發(fā)酵外，還伴有輕微的由酵母菌引起的酒精發(fā)酵，是一種集酸、乙醇味于一體的新型發(fā)酵乳制品［2］。據(jù)報(bào)道，藏靈菇發(fā)酵乳中含有大量的乳酸菌胞外多糖（Exopolysaccharides，EPSs），該類多糖具有多種生理功能，如抑制有害菌生長(zhǎng)，抗腫瘤活性和調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)等［3］。此外，由于EPS還具有防止乳清析出、提高黏稠度、凝乳強(qiáng)度，防止凝乳斷裂等優(yōu)點(diǎn)［4-5］，已成為近年來(lái)應(yīng)用較為廣泛的食品級(jí)穩(wěn)定劑或增稠劑。

影響EPS合成的因素除了產(chǎn)生菌的遺傳特性外，還有環(huán)境因素，如培養(yǎng)基成分（碳源、氮源、碳氮比、刺激生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽等）、培養(yǎng)基初始pH、接種量、發(fā)酵溫度和時(shí)間等［6］。近年來(lái)，有關(guān)EPS產(chǎn)量的發(fā)酵條件優(yōu)化研究主要集中在單株菌上，藏靈菇作為多種微生物的混合體，其EPS產(chǎn)量（5～10 g/L）要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單株乳酸菌（50～425 mg/L）［7-8］，且具有更多的生理活性。本研究主要通過(guò)單因素（接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和脫脂乳濃度）實(shí)驗(yàn)分析藏靈菇高產(chǎn)EPS的條件，進(jìn)一步研究高產(chǎn)EPS藏靈菇在牛乳中的發(fā)酵特性（凝乳時(shí)間、pH、滴定酸度、持水力、黏度和活菌數(shù)），以期為深入研究藏靈菇EPS的理化特性及應(yīng)用提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

藏靈菇采自全國(guó)不同地區(qū)（表1），于4℃條件下冷藏備用；全脂乳北京三元食品股份有限公司；脫脂乳粉新西蘭恒天然乳業(yè)集團(tuán)；商業(yè)酸奶發(fā)酵劑（YO-MIX） 丹麥丹尼斯克公司；三氯乙酸（TCA）、氫氧化鈉、乙酸、濃硫酸、重蒸酚、乙醇分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

表1　藏靈菇樣品來(lái)源Table 1　Sources of Tibetan Kefir samples

MLS-3750型高壓蒸汽滅菌器日本三洋公司；CR21GⅢ型立式高速冷凍離心機(jī)號(hào)、U-3900型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)日本HITACHI公司；DV-Ⅲ型ULTRA黏度計(jì)美國(guó)BROOKFIELD公司；數(shù)顯pH計(jì)上海梅特利-托利多公司；恒溫培養(yǎng)箱上海一恒儀器科技有限公司。

表2　發(fā)酵劑組合情況Table 2　Combination of starter culture

1.2培養(yǎng)基的配制

1.2.1SDM液體培養(yǎng)基（1 L） 胰蛋白胨10 g、YNB（酵母氮源）6.7 g、K2HPO42 g、無(wú)水乙酸鈉5 g、檸檬酸鈉 5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·H2O 0.05 g、葡萄糖 20 g、吐溫80 1 mL，1 mol/L乙酸調(diào)pH為6.6，121℃滅菌15 min。

1.2.2還原脫脂乳培養(yǎng)基（Reconstituted skim milk，RSM） 將脫脂乳粉按照11%（w/v）用蒸餾水還原制成脫脂乳培養(yǎng)基，115℃滅菌15 min。

1.3藏靈菇EPS的分離提取

將藏靈菇用冷的無(wú)菌水清洗后接種至RSM培養(yǎng)基中，于25℃靜置培養(yǎng)16～20 h，至牛乳凝固，過(guò)濾，得到的藏靈菇繼續(xù)接種至RSM培養(yǎng)基中，連續(xù)活化幾代備用。將活化好的藏靈菇樣品按5 g/100 mL的比例分別接種于SDM及RSM培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)18 h。待發(fā)酵結(jié)束后，于100℃水浴加熱15 min，以滅活可能存在的降解多糖的酶類。EPS的分離提取參照Rimada等［9］的方法。向藏靈菇發(fā)酵液中加入80%（m/v）的三氯乙酸溶液至終濃度為4%（m/v），室溫下攪拌2 h，10000 r/min，4℃，離心45 min，去除細(xì)胞和蛋白。取上清液并加入兩倍體積的無(wú)水乙醇，4℃冷藏靜置12 h，10000 r/min，4℃，離心30 min。沉淀用蒸餾水溶解，裝入分子截流量為8000～14000 u的透析袋中透析24 h，每8 h換一次蒸餾水。

1.4藏靈菇產(chǎn)EPS單因素實(shí)驗(yàn)

選取高產(chǎn)EPS藏靈菇樣品，對(duì)其在還原脫脂乳培養(yǎng)基中產(chǎn)EPS的發(fā)酵條件進(jìn)行初步研究。以EPS產(chǎn)量為指標(biāo)，選擇接種量為3、5、7、9、11、13 g/100 mL（其他發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度37℃、發(fā)酵時(shí)間18 h、脫脂乳濃度11%）；發(fā)酵溫度為22、27、32、37、42℃（其他發(fā)酵條件：接種量7%、發(fā)酵時(shí)間18 h、脫脂乳濃度11%）；發(fā)酵時(shí)間為6、12、18、24、30 h（其他發(fā)酵條件：接種量7%、發(fā)酵溫度37℃、脫脂乳濃度為11%）；脫脂乳濃度為7、9、11、13、15 g/100 mL（其他發(fā)酵條件：接種量7%、發(fā)酵溫度37℃、發(fā)酵時(shí)間18 h）分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.5高產(chǎn)EPS藏靈菇在發(fā)酵乳中的應(yīng)用

在單因素實(shí)驗(yàn)所確定的條件下選用高產(chǎn)EPS藏靈菇制備發(fā)酵乳，研究其發(fā)酵特性。藏靈菇與商業(yè)發(fā)酵劑經(jīng)脫脂乳活化后，按表2組合分別接種于全脂牛奶中，于42℃下發(fā)酵至pH為4.5，迅速置于冷水中冷卻至4℃，轉(zhuǎn)移至4℃冷庫(kù)中冷藏。分別在冷藏期的第1、7、14、21 d取樣，測(cè)定發(fā)酵乳的EPS含量、活菌數(shù)、pH及滴定酸度、持水力及黏度。

1.6指標(biāo)的測(cè)定

1.6.1EPS含量測(cè)定取20 mL發(fā)酵乳，按照1.3中的方法提取EPS。采用苯酚—硫酸法測(cè)定EPS含量，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線［10］，測(cè)得的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為：y=0.0087x＋0.0232，R2=0.9994?？v坐標(biāo)為490 nm處的吸光度值，橫坐標(biāo)為溶液中EPS質(zhì)量濃度（mg/L）。EPS含量為樣品含糖量減去空白培養(yǎng)基的背景干擾值。

1.6.2活菌數(shù)測(cè)定采用平板涂布稀釋法測(cè)定發(fā)酵乳中乳酸菌的活菌數(shù)。稱取0.5 g發(fā)酵乳樣品加入到4.5 mL無(wú)菌生理鹽水中逐級(jí)稀釋［11］，選取合適的稀釋倍數(shù)涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。

1.6.3pH和滴定酸度的測(cè)定發(fā)酵乳pH用數(shù)顯pH計(jì)直接讀取。滴定酸度采用Purwandari等［12］的方法進(jìn)行測(cè)定。稱取發(fā)酵乳樣品10 g，加入10 mL蒸餾水，混勻后，加入0.5 mL 0.5%的酚酞指示劑，用0.1 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直到粉紅色出現(xiàn)，記錄消耗NaOH的體積。滴定酸度計(jì)算公式為：

1.6.4持水力的測(cè)定稱取5 g發(fā)酵乳樣品，5000 r/min，4℃，離心15 min。收集上清并稱重。持水力計(jì)算公式如下：

1.6.5黏度的測(cè)定將發(fā)酵乳樣品于室溫下放置1 h，用玻璃棒將其攪拌均勻，選用LV-3轉(zhuǎn)子，設(shè)定轉(zhuǎn)速50 r/min，每5 s取一個(gè)點(diǎn)，連續(xù)測(cè)定12個(gè)點(diǎn)，黏度為12個(gè)點(diǎn)的平均值。

1.7數(shù)據(jù)分析

每個(gè)樣品均設(shè)3次重復(fù)。數(shù)據(jù)以表示，采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行方差分析，p＞0.05表示差異不顯著，p＜0.05表示差異顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1藏靈菇EPS產(chǎn)量測(cè)定

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。來(lái)自不同地區(qū)的15個(gè)藏靈菇樣品在SDM和RSM培養(yǎng)基中產(chǎn)EPS情況如圖2所示。15個(gè)藏靈菇樣品在SDM和RSM培養(yǎng)基中均能產(chǎn)生EPS，但含量有所差異。在SDM培養(yǎng)基中EPS產(chǎn)量在130～1020 mg/L，其中編號(hào)為K4、K7、K8、K10、K12的藏靈菇樣品的EPS較高，分別為905.6、931.2、716.18、793.32、1016.9 mg/L，均超過(guò)700 mg/L。在RSM培養(yǎng)基中EPS產(chǎn)量在13～242 mg/L，其中編號(hào)為K4、K5、K7、K8、K10、K12、K15的藏靈菇樣品EPS產(chǎn)量較高，分別為175.6、104.4、241.40、143.22、113.90、 201.40、129.35 mg/L，均超過(guò)100 mg/L。由此可見(jiàn)，藏靈菇在SDM培養(yǎng)基的EPS產(chǎn)量要顯著高于在RSM培養(yǎng)基中的產(chǎn)量，表明碳源和氮源對(duì)EPS的產(chǎn)量影響較大。

圖1　以葡萄糖為基準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve with glucose as a benchmark substance

圖2　藏靈菇分別在SDM和RSM培養(yǎng)基中的EPS產(chǎn)量Fig.2　EPS yields of Tibetan Kefir samples in SDM and RSM mediums，respectively

2.2接種量對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

接種量的多少直接影響到微生物的生長(zhǎng)速度和菌體濃度，進(jìn)而影響EPS產(chǎn)量。由圖3可以看出，同一藏靈菇樣品在不同接種量下代謝產(chǎn)生的EPS的產(chǎn)量也不盡相同。K4、K7和K12的EPS產(chǎn)量隨接種量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。藏靈菇K4在接種量為9%時(shí)EPS產(chǎn)量達(dá)到最高，為288.35 mg/L，而藏靈菇K7和K12在接種量為7%時(shí)EPS產(chǎn)量達(dá)到最高，分別為241.44 mg/L和260.30 mg/L。過(guò)高的接種量，發(fā)酵前期會(huì)使菌體生長(zhǎng)過(guò)快，菌體濃度過(guò)高，中后期會(huì)因營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡而導(dǎo)致合成EPS的前體物質(zhì)的減少，從而降低EPS的產(chǎn)量。

圖3　接種量對(duì)藏靈菇EPS產(chǎn)量的影響Fig.3　Effect of inoculum dose on the yields of Tibetan Kefir EPS

2.3發(fā)酵溫度對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

溫度是影響微生物生長(zhǎng)繁殖和EPS合成的重要因素之一。發(fā)酵溫度不同，菌株的生長(zhǎng)速度及其EPS產(chǎn)量亦不相同。發(fā)酵溫度過(guò)低，藏靈菇中的微生物菌體生長(zhǎng)緩慢，菌體濃度不高，從而影響次生代謝產(chǎn)物EPS的產(chǎn)量；發(fā)酵溫度過(guò)高，菌體培養(yǎng)后期容易衰老而自溶，菌體濃度亦不高，也會(huì)影響EPS的合成［6］。由圖4可以看出，藏靈菇樣品在不同發(fā)酵溫度條件下其EPS產(chǎn)量不同，當(dāng)發(fā)酵溫度為37℃時(shí)，藏靈菇K4、K7和K12的EPS產(chǎn)量均達(dá)到最大值。而當(dāng)發(fā)酵溫度低于37℃時(shí)，可能是由于藏靈菇中的菌體生長(zhǎng)緩慢，菌液濃度較低，亦可能是低溫使類異戊二烯脂質(zhì)載體發(fā)生鈍化現(xiàn)象，使得EPS產(chǎn)量降低［13］。類異戊二烯脂質(zhì)載體在細(xì)胞內(nèi)除了被用于EPS的合成外，也參與細(xì)胞壁肽聚糖、磷壁酸的生物合成。此外，當(dāng)溫度高于37℃時(shí)，EPS產(chǎn)量開(kāi)始下降，這可能是由于藏靈菇中的菌體容易衰老而發(fā)生自溶現(xiàn)象，且溫度過(guò)高導(dǎo)致載體失活，從而降低EPS的產(chǎn)量。因此，藏靈菇K4、K7和K12的EPS合成的最適溫度均為37℃。

圖4　發(fā)酵溫度對(duì)藏靈菇EPS產(chǎn)量的影響Fig.4　Effect of fermentation temperature on the yields of Tibetan Kefir EPS

2.4發(fā)酵時(shí)間對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)EPS的產(chǎn)量影響較大。一般EPS在菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期和穩(wěn)定期產(chǎn)生。因此適當(dāng)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間有助于EPS的積累［14］。由圖5可以看出，藏靈菇EPS的產(chǎn)量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)不斷升高，K4和K7的EPS產(chǎn)量在18 h時(shí)達(dá)到最高值（288.35 mg/L和241.44 mg/L），而K12的EPS在12 h時(shí)達(dá)到最高值（366.90 mg/L），這表明K4和K7中產(chǎn)EPS的菌株在18 h左右達(dá)到生長(zhǎng)穩(wěn)定期，而K12中產(chǎn)EPS的菌株在12 h左右達(dá)到生長(zhǎng)穩(wěn)定期。穩(wěn)定期時(shí)活菌數(shù)保持相對(duì)穩(wěn)定、總菌數(shù)達(dá)到最高水平、細(xì)胞代謝產(chǎn)物積累達(dá)到最高峰，同時(shí)培養(yǎng)基中的碳源、氮源的消耗也達(dá)到最大。當(dāng)繼續(xù)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，藏靈菇K4、K7和K12的EPS產(chǎn)量均出現(xiàn)急劇下降趨勢(shì)，這可能是由于底物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值已被消耗盡，無(wú)法繼續(xù)提供菌株細(xì)胞生長(zhǎng)及EPS的分泌，從而造成EPS產(chǎn)量下降，也可能是微生物代謝產(chǎn)生了分解多糖的酶類將多糖重新分解［15］。

圖5　發(fā)酵時(shí)間對(duì)藏靈菇EPS產(chǎn)量的影響Fig.5　Effect of fermentation time on the yields of Tibetan Kefir EPS

2.5脫脂乳濃度對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

碳、氮源是微生物生長(zhǎng)最重要的能量和營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，對(duì)微生物EPS的合成有很大影響。牛乳中的碳源主要為乳糖，氮源主要為酪蛋白。由圖6可以看出，藏靈菇EPS的產(chǎn)量隨脫脂乳濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。K4、K7和K12的EPS均在脫脂乳濃度為11%時(shí)達(dá)到最高，當(dāng)大于11%時(shí)EPS的產(chǎn)量反而降低，表明高濃度的脫脂乳不利于EPS的合成。

圖6　脫脂乳濃度對(duì)藏靈菇EPS產(chǎn)量的影響Fig.6　Effect of skim milk concentration on the yields of Tibetan Kefir EPS

2.6高產(chǎn)EPS藏靈菇在發(fā)酵乳中的應(yīng)用

2.6.1發(fā)酵乳冷藏期間EPS含量的變化發(fā)酵乳冷藏期間EPS產(chǎn)量的變化見(jiàn)圖7。可以看出，同一組發(fā)酵乳的EPS含量隨冷藏天數(shù)延長(zhǎng)變化不大，但不同組發(fā)酵乳之間的EPS產(chǎn)量存在顯著差異。其中YO-MIX發(fā)酵乳在冷藏期間EPS含量始終保持在10 mg/L左右，K4和K12發(fā)酵乳的EPS含量在41～54 mg/L，YO-K4發(fā)酵乳EPS含量維持在40 mg/L左右，YO-K12發(fā)酵乳EPS含量維持在50 mg/L左右。

圖7　發(fā)酵乳4℃冷藏期間EPS的變化情況Fig.7　Change in EPS yields of fermented milk during 4℃cold storage

2.6.2發(fā)酵乳凝乳時(shí)間及冷藏期間活菌數(shù)的變化發(fā)酵乳凝乳時(shí)間及冷藏期間乳酸菌活菌數(shù)變化情況見(jiàn)表3。各組發(fā)酵乳的凝乳時(shí)間存在顯著差異，其中由高產(chǎn)EPS藏靈菇K12+商業(yè)發(fā)酵劑混合（YO-K12）制備的發(fā)酵乳的凝乳時(shí)間最短（4.52 h），其次為商業(yè)發(fā)酵劑YO-MIX（4.85 h）、K4和商業(yè)發(fā)酵劑混合YOK4（5.34 h）、K12（6.42 h）和K4（7.00 h），表明高濃度的EPS含量可加速牛乳的凝乳速度。Girard［16］研究了產(chǎn)EPS乳酸乳球菌NCC2771、NCC1971、NCC15在發(fā)酵乳中的酸化曲線，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)EPS菌種可以縮短凝乳時(shí)間。馬世敏等［17］研究發(fā)現(xiàn)在保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合發(fā)酵劑的基礎(chǔ)上添加產(chǎn)EPS的副干酪乳桿菌HCT制備發(fā)酵乳，凝乳時(shí)間可縮短0.5 h。此外，各組發(fā)酵乳的活菌數(shù)隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，在14 d達(dá)到最大，隨后由于發(fā)酵乳酸度逐漸升高，pH逐漸降低，乳酸菌對(duì)發(fā)酵乳內(nèi)部的偏酸性環(huán)境的耐受能力有所下降，從而導(dǎo)致其活菌數(shù)略有降低［18］。在21 d時(shí)各組發(fā)酵乳的活菌數(shù)均能達(dá)到8 log cfu/mL以上，表明各組中的乳酸菌存活能力較強(qiáng)。

表3　發(fā)酵乳凝乳時(shí)間及4℃冷藏期間的活菌數(shù)變化Table 3　Changes in the viable counts of fermented milk during 4℃cold storage

2.6.3發(fā)酵乳冷藏期間pH及滴定酸度的變化pH與酸度是發(fā)酵乳的一個(gè)重要指標(biāo)，它與產(chǎn)品的口味、質(zhì)地和風(fēng)味有著密切的聯(lián)系［19］。目前發(fā)酵乳發(fā)酵終點(diǎn)的判斷主要是根據(jù)產(chǎn)品所達(dá)到的pH與酸度來(lái)決定，以酸奶為例，當(dāng)pH達(dá)到4.5，滴定酸度達(dá)到70～90°T就結(jié)束發(fā)酵，開(kāi)始降溫在低溫下成熟。

圖8　發(fā)酵乳4℃冷藏期間pH的變化Fig.8　Changes in pH value of fermented milk during 4℃cold storage

圖9　發(fā)酵乳4℃冷藏期間滴定酸度的變化Fig.9　Changes in titratable acidity of fermented milk during 4℃cold storage

由圖8和圖9可以看出，5組發(fā)酵乳在4℃冷藏21 d期間，其pH隨天數(shù)增加而降低，滴定酸度隨天數(shù)增加而升高。YO-MIX組發(fā)酵乳pH要高于其他組，而滴定酸度低于其他組。K4和K12發(fā)酵乳在冷藏期間pH降低及滴定酸度升高的趨勢(shì)要大于其他組，這可能是由于藏靈菇中的乳酸菌種類相對(duì)復(fù)雜，乳酸菌生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生了較多的有機(jī)酸，從而加速了牛乳的酸化。21 d時(shí)，由藏靈菇和商業(yè)發(fā)酵劑混合制備的發(fā)酵乳YO-K4和YO-K12的pH和滴定酸度差異不顯著（p＞0.05），其pH高于K4和K12發(fā)酵乳，而滴定酸度低于K4和K12發(fā)酵乳。此外，在1 d時(shí)，K4和K12發(fā)酵乳的pH和滴定酸度存在顯著差異（p＜0.05），表明不同來(lái)源藏靈菇的發(fā)酵能力存在差異。

2.6.4發(fā)酵乳冷藏期間持水力的變化持水力是反映發(fā)酵乳組織狀態(tài)的重要指標(biāo)之一。由圖10可以看出，隨著冷藏天數(shù)的增加，各組發(fā)酵乳樣品的持水力均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在1～14 d的冷藏期間，K4、K12、YO-K4和YO-K12發(fā)酵乳樣品的持水力均顯著高于（p＜0.05）只添加商業(yè)發(fā)酵劑的YO-MIX發(fā)酵乳樣品。這可能是由于EPS和蛋白質(zhì)之間發(fā)生了相互作用，促使3D網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成，從而增加發(fā)酵乳的保水性，降低脫水收縮作用［20］。

圖10　發(fā)酵乳4℃冷藏期間持水力的變化Fig.10　Changes in WHC of fermented milk during 4℃cold storage

2.6.5發(fā)酵乳冷藏期間黏度的變化由圖11可以看出，K4、K12和YO-MIX組發(fā)酵乳的黏度隨冷藏天數(shù)增加而穩(wěn)定增長(zhǎng)，在14 d達(dá)到最大值，但隨后開(kāi)始降低。Ramchandran［21］研究同樣發(fā)現(xiàn)酸奶在冷藏后期的黏度有所下降，并推斷其可能是由于重組的蛋白質(zhì)基質(zhì)提高了膠體的硬度，從而降低了膠體黏度。此外，YO-K4和YO-K12發(fā)酵乳的黏度在整個(gè)冷藏期間相對(duì)穩(wěn)定，其黏度顯著高于YO-MIX組，表明EPS可提升發(fā)酵乳的黏度。Mende等［22］將由嗜熱鏈球菌ST-143代謝產(chǎn)生的EPS添加到酸奶中，發(fā)現(xiàn)該EPS可顯著提高酸奶的黏度，并分析其可能是由于帶負(fù)電的EPS可與乳中帶正電的酪蛋白顆粒產(chǎn)生靜電吸收作用，從而加強(qiáng)多糖—蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

圖11　發(fā)酵乳4℃冷藏期間黏度的變化Fig.11　Changes in viscosity of fermented milk during 4℃cold storage

3　結(jié)論

本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)分析，確定了藏靈菇樣品發(fā)酵高產(chǎn)EPS的條件為：接種量7%～9%；發(fā)酵溫度37℃；發(fā)酵時(shí)間12～18 h；脫脂乳濃度11%。利用高產(chǎn)EPS的藏靈菇K12與商業(yè)發(fā)酵劑YO-MIX混合發(fā)酵全脂乳制備發(fā)酵乳，凝乳時(shí)間為4.52 h，在4℃冷藏21 d期間，該發(fā)酵乳胞外多糖含量保持在50 mg/L左右，具有較高的持水力、黏度和活菌數(shù)。高產(chǎn)EPS藏靈菇發(fā)酵劑在發(fā)酵乳制品加工中具有重要的開(kāi)發(fā)前景。

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Study on the factors affecting exopolysaccharide production by fermentation with Tibetan Kefir and its application

WANG Ji1，TIAN Zheng2，ZHAO Xiao1，CAO Yong-qiang1，YANG Zhen-nai1，*
（1.Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China；2.Beijing Shunxin Agriculture Co.，Ltd.，Beijing 101300，China）

Exopolysaccharides（EPSs）production by 15 Tibetan Kefir samples collected from different regions were measured by phenol-sulfuric acid method，and three of them（K4，K7 and K12）with high EPS yields were selected.By single factor test，the fermentation conditions were obtained as follows：inoculation rate of 7%for K7 and K12，9%for K4，fermentation time of 12 h for K12，18 h for K4 and K7，fermentation temperature of 37℃，skim milk concentration of 11%.The use of the Kefir samples K4 or K12 together with a commercial starter as a mixed starter in fermentation of whole milk showed that the combination of K12 and commercial starter gave the shortest coagulating time（4.52 h）.During the 21 d of storage at 4℃，the fermented milk produced from this starter combination contained EPS of about 50 mg/L and viable bacterial counts of over 8.20 log cfu/mL，maintaining higher water holding capacity and viscosity.

Tibetan Kefir；exopolysaccharides；fermented milk；lactic acid bacteria

TS201.1

A

1002-0306（2015）18-0203-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.032

2014－10－31

王輯（1986-），男，博士研究生，研究方向：乳品加工，E-mail：wangji198644@163.com。

楊貞耐（1965-），男，博士，教授，研究方向：乳品加工及交叉學(xué)科的理論和應(yīng)用，E-mail：yangzhennai@th.btbu.edu.cn。

北京市教委科研計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（KZ201310011011）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371804）。