豬β2腎上腺素受體基因克隆及重組酵母表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

王　　健，李永飛，佘永新，金茂俊，王　　靜，*（.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，北京0008；2.河北北方學(xué)院食品科學(xué)系，河北張家口075000）

豬β2腎上腺素受體基因克隆及重組酵母表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

王健1，2，李永飛1，佘永新1，金茂俊1，王靜1，*
（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，北京100081；2.河北北方學(xué)院食品科學(xué)系，河北張家口075000）

克隆豬β2AR基因并進(jìn)行序列分析，構(gòu)建其重組酵母表達(dá)質(zhì)粒。采集新鮮豬肝組織，提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴增、克隆及鑒定，獲得豬β2AR的cDNA序列，并對該序列及編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析。同時將目的基因插入pPICZα A酵母表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒?？寺～@得豬β2AR基因cDNA序列1257 bp，Genbank登錄號為KF023571.1，編碼418個氨基酸，蛋白分子質(zhì)量46.73 ku。生物信息學(xué)分析表明，該基因與其他物種的β2AR基因相似性較高，均在83%以上，具有較高的同源性。經(jīng)PCR和雙酶切鑒定以及測序分析，證明成功構(gòu)建了重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-β2AR。本研究為豬β2AR基因在畢赤酵母系統(tǒng)的表達(dá)及建立基于受體的β激動劑多殘留檢測方法奠定了基礎(chǔ)。

β2腎上腺素受體，克隆，酵母表達(dá)質(zhì)粒，豬

目前，β激動劑的違禁添加是影響我國動物源食品安全和畜牧業(yè)健康發(fā)展的焦點問題之一。特別是多種β激動劑的混合添加及新型結(jié)構(gòu)類似物的的不斷涌現(xiàn)，給此類違禁物的有效監(jiān)管帶來巨大挑戰(zhàn)。主要原因是現(xiàn)行的快速檢測技術(shù)如ELISA［1-3］、膠體金試紙條［4］和生物傳感器［5-7］等均不能很好的解決β激動劑的多殘留檢測和未知物篩查。基于重組受體的β激動劑檢測方法，是利用β2AR受體與β激動劑的類特異性吸附原理建立檢測體系，開辟了一條針對該類違禁物的多殘留檢測及未知物篩查的新途徑。

獲得大量高純度、活性好的β2AR蛋白是建立β激動劑受體分析法的基礎(chǔ)，也是該技術(shù)在研發(fā)應(yīng)用方面遇到的最大瓶頸之一。β2腎上腺素受體（β2adrenergic receptor，β2AR）是能夠被腎上腺素激活的一類G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR），具有7次跨膜α螺旋結(jié)構(gòu)［8］，給它的體外表達(dá)和純化帶來很大麻煩。1986年，Dixon等［9］采用HPLC及親和層析的方法首次純化得到β2AR，即倉鼠肺β2AR。Liang W等［10］于1997年首次克隆得到了完整的豬β2AR基因，并對其基因及氨基酸序列進(jìn)行了分析。目前，β2AR已在大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物等多種表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)出了有活性的受體蛋白。但國外主要側(cè)重研究該受體的晶體結(jié)構(gòu)和功能［11-12］、受體配體間的相互作用［13-14］等方面，將其用于β激動劑檢測方面的報道還十分罕見。國內(nèi)仍處于對該受體的表達(dá)、純化等的初步研究階段。宋榮［15］克隆得到大倉鼠β2AR基因，并進(jìn)行了原核表達(dá)和畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建；王迪［16］利用大腸桿菌和哺乳動物細(xì)胞上表達(dá)的β2AR蛋白進(jìn)行了酶受體分析法的初步嘗試。到目前為止，還未有利用克隆得到的豬β2AR基因構(gòu)建重組酵母表達(dá)質(zhì)粒的相關(guān)報道，本研究旨為豬β2AR基因在畢赤酵母的體外表達(dá)及在β激動劑快速檢測中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

DH5α感受態(tài)大腸桿菌北京全式金生物技術(shù)有限公司；TA克隆載體pMD-18TTaKaRa；pPICZα A酵母表達(dá)載體由北京勤邦生物技術(shù)有限公司惠贈；總RNA提取試劑盒、Access RT-PCR系統(tǒng)和T4連接酶美國Promega公司；凝膠產(chǎn)物回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒Axygen公司；NcoI、XhoI、EcoRI和NotI限制性內(nèi)切酶美國NEB公司；Premix Taq TaKaRa；gelred核酸染料Biotium公司；DNA marker（DL 5000） 北京全式金生物技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)marker（pageruler） Fermentas公司；其他所用試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純試劑。

紫外/可見分光光度計NanoVueGE-healthcare公司；Powerpac Universal電泳儀Bio-Rad公司；PCR儀Applied Biosystems公司；凝膠成像儀（Imaging G3） 北京昊諾斯科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1總RNA的提取按照總RNA提取試劑盒操作步驟分離純化豬肝細(xì)胞總RNA。利用分光光度計測定所提RNA濃度的OD值，以O(shè)D260nm/OD280nm判定RNA純度。取5 μL所提RNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA完整性。將檢測后符合要求的RNA在-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物的設(shè)計合成參照NCBI上已知的豬（Sus scrofa）β2AR序列（GenBank登錄號AF000134），依據(jù)其序列特點，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計1對引物，并在上游引物5′端和下游引物5′端分別引入NcoI酶切位點（下劃線部分）和XhoI酶切位點（下劃線部分），引物序列如下所示：

1.2.3RT-PCR制備豬β2AR的cDNA以所提的豬肝細(xì)胞總RNA為模板，參考RT-PCR試劑盒操作步驟進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR產(chǎn)物。采用50 μL的反應(yīng)體系，具體如下所示：水（無核酸酶）22 μL，AMV/Tfi 5×反應(yīng)緩沖液10 μL，dNTP混合物（每dNTP 10 mmol/L）1 μL，上游引物（10 pmol/μL）5 μL，下游引物（10 pmol/μL）5 μL，MgSO4（25 mmol/L）2 μL，輕微渦旋混勻后加入AMV反轉(zhuǎn)錄酶（5 U/μL）1 μL，DNA聚合酶（5 U/μL）1 μL，輕微振蕩10 s后加入模板RNA 3 μL。

RT-PCR反應(yīng)條件：50℃45 min，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；94℃2 min，滅活反轉(zhuǎn)錄酶及預(yù)變性；94℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃最終延伸10 min，同時設(shè)立無菌水為模板的陰性對照。取擴增產(chǎn)物5 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4豬β2AR基因重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，按照凝膠產(chǎn)物回收試劑盒說明書對目的片段切膠回收，將回收產(chǎn)物與PMD18-T Vector按照摩爾比3∶1，在16℃條件下連接12 h。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞并涂布平板，挑取單個白色菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定。將經(jīng)以上步驟鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒命名為pMD-18T-β2AR。

1.2.5豬β2AR基因重組酵母表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建據(jù)已制備得到的豬β2AR的cDNA序列以及pPICZαA載體上多克隆位點所包含的酶切位點，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計1對引物，在上游引物5′端和下游引物5′端分別引入EcoRI酶切位點（下劃線部分）和NotI酶切位點（下劃線部分），引物序列如下所示：

從陽性克隆菌株中提取質(zhì)粒DNA，以其為模板，利用上述引物進(jìn)行PCR擴增。然后用EcoRI和NotI限制性內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物及pPICZαA載體分別進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物參考1.2.4中的方法進(jìn)行回收、連接、轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒提取，經(jīng)PCR和雙酶切方法鑒定為陽性的重組質(zhì)粒，并命名為pPICZαA-β2AR，并進(jìn)行測序鑒定進(jìn)一步驗證結(jié)果。

1.2.6酵母菌落陽性重組子的PCR鑒定采用限制性內(nèi)切酶SacI酶切重組質(zhì)粒pPICZα-β2AR，得到線性化質(zhì)粒。然后將其經(jīng)酵母電擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入自制的畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞中，用酵母菌落PCR方法鑒定陽性重組子。

2　結(jié)果與分析

2.1豬β2AR的cDNA制備

分光光度計法測定所提豬肝細(xì)胞總RNA的吸光度值，RNA純度為：OD260nm/OD280nm=1.988，比值在1.8～2.0之間，說明所提RNA中蛋白質(zhì)或其他有機物的污染在允許范圍內(nèi)，同時測得RNA濃度為0.6 μg/μL，結(jié)合電泳結(jié)果說明所提RNA的質(zhì)量滿足下一步RT-PCR要求。

將所提豬肝細(xì)胞總RNA進(jìn)行RT-PCR擴增，取5 μL擴增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果如圖1所示，出現(xiàn)了預(yù)期大小的單一條帶，大小為1257 bp左右，說明本實驗所設(shè)計的引物及反應(yīng)條件特異性較好。

圖1　RT-PCR電泳結(jié)果Fig.1　Assay of agrose electrophoresis of RT-PCR

2.2豬β2AR基因的克隆與鑒定

挑取轉(zhuǎn)化后獲得的白色菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37℃下過夜振蕩培養(yǎng)，提取其中的重組克隆質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，并用NcoI和XhoI進(jìn)行質(zhì)粒雙酶切鑒定。PCR電泳結(jié)果如圖2（a）所示，可見重組克隆質(zhì)粒擴增出了1200 bp左右的特異性條帶；雙酶切電泳結(jié)果如圖2（b）所示，該重組克隆質(zhì)粒經(jīng)NcoI和XhoI酶切后電泳，出現(xiàn)2條帶：1條為約2700 bp左右的pMD-18T載體條帶，另1條為約1200 bp左右的豬β2AR的cDNA片段。

圖2　重組克隆質(zhì)粒PCR及雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2　Identification of recombinant cloning plasmid by PCR and double enzyme digestion

2.3豬β2AR基因序列測定及分析

將PCR及雙酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，得到全長為1257 bp的β2AR cDNA序列，在GenBank上進(jìn)行基因序列注冊，登錄號為KF023571.1。圖3所示為β2AR的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列。將其與已發(fā)表的豬β2AR（AF000134）比對，基因序列一致性為99.68%，發(fā)生4處堿基突變，氨基酸序列一致性為99.28%，發(fā)生3處突變，具體為：85GAC（D）→AAC（N），AAT（N）1056→AAC（N），1153GAC GCC（D A）→GAG CCC（E P）（加粗下劃線）。β激動劑與受體結(jié)合位點處的氨基酸均未發(fā)生突變（圓圈），為后續(xù)體外表達(dá)具有活性的β2AR奠定了基礎(chǔ)。

采用Compute pI/Mw在線軟件預(yù)測豬β2AR蛋白分子質(zhì)量為46.73 ku。Signal P程序分析表明該基因編碼的蛋白質(zhì)序列無信號肽序列。將β2AR的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行在線BLAST分析，比較豬和其他物種β2AR序列及氨基酸序列的一致性，結(jié)果顯示，所列序列均為不同物種β2AR序列，且一致性99%以上的8個基因均為豬β2AR，再次驗證了所克隆基因?qū)儆谪iβ2AR。該基因與人（Homo sapiens）、野駱駝（Camelus ferus）、黑猩猩（Pan troglodytes）、大倉鼠（Tscherskia triton）、荷蘭豬（Cavia porcellus）序列的一致性分別為86%、91%、89%、83%和86%，氨基酸序列一致性分別為83%、91%、83%、84%和85%，說明不同物種間β2AR有較高的同源性。

圖3　豬β2AR cDNA及其編碼的氨基酸序列Fig.3　The cDNA and amino acid sequence of pig β2AR gene

2.4豬β2AR基因重組酵母表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

圖4 重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-β2AR PCR及雙酶切鑒定結(jié)果Fig.4　Identification of pPICZαA-β2AR by PCR and double enzyme digestion

將所構(gòu)建的重組酵母表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定及EcoRI和NotI質(zhì)粒雙酶切鑒定。以載體的上、下游引物5’AOX1primer和3’AOX1primer為引物對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，PCR產(chǎn)物片段長度應(yīng)為載體上片段長度（550 bp）和目的片段長度（1254 bp）之和，約為1800 bp左右。PCR電泳結(jié)果（圖4a）顯示，該重組質(zhì)粒擴增出了1800 bp左右的特異性條帶。雙酶切電泳結(jié)果（圖4b）顯示，該重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和NotI雙酶切后，電泳出現(xiàn)2條帶：一條為pPICZαA載體條帶（約3600 bp左右），另一條為目的基因片段（約1200 bp左右）。將經(jīng)上述鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定，表明質(zhì)粒讀碼框正確，說明重組酵母表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，可用于后續(xù)酵母真核系統(tǒng)的表達(dá)。

2.5酵母菌落PCR鑒定陽性重組子

挑取Zeocin抗性克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定陽性重組子。分別以pPICZαA空質(zhì)粒和pPICZαA-β2AR作為陰性對照和陽性對照，引物采用載體引物5’AOX1primer和3’AOX1primer，電泳結(jié)果如圖5所示。陽性重組子與pPICZαA-β2AR擴增的條帶大小一致，約為1800 bp。而pPICZαA空質(zhì)粒沒有擴增出相應(yīng)條帶，說明β2AR基因已成功整合到X-33宿主菌基因組中。

圖5　轉(zhuǎn)化子菌落PCR鑒定結(jié)果Fig.5　Identification of transformant by colony PCR

3　結(jié)論

本研究從豬肝細(xì)胞中克隆得到β2AR基因，全長為1257 bp，蛋白分子量預(yù)測為46.73 ku。與GenBank上已發(fā)表的其他豬β2AR基因序列相比，核苷酸水平同源性均在99%以上，與其他動物和人的β2AR基因的同源性也在83%以上，說明β2AR基因具有較高的保守性，不同物種間同源性較高。將該β2AR基因克隆到pPICZα A載體，成功構(gòu)建可在畢赤酵母系統(tǒng)體外表達(dá)的重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-β2AR，為該基因在畢赤酵母細(xì)胞中的體外表達(dá)提供了技術(shù)支持。

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Cloning of β2adrenergic receptors cDNA and construction of yeast expression plasmid

WANG Jian1，2，LI Yong-fei1，SHE Yong-xin1，JIN Mao-jun1，WANG Jing1，*
（1.Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agri-products of CAAS，Key Laboratory of Agrifood Safety and Quality，Ministry of Agriculture，Beijing 100081，China；2.Department of Food Science，Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China）

This study aimed to clone pig β2AR gene，analysize its sequence and construct its recombinant yeast expression plasmid.Total RNA was extracted from pig liver，and then RT-PCR was conducted based on published pig β2AR gene sequence（AF000134）.By cloning of the PCR product and identification，the cDNA fragment of pig β2AR was obtained.Bioinformatical tools were adopted to analyze the gene sequence and amino acid.The target gene was cloned to pPICZα A vector，constructing recombinant expression plasmid. The cDNA fragment of pig β2AR（KF023571.1）was 1257 bp，and encodeed 418 amino acids.The deduced protein was predicted to have a computed molecular mass of 46.73 ku.There were high similarity（more than 83%）and homology in β2AR gene between pig and other species.Finally，recombinant plasmid named pPICZαA-β2AR was constructed successfully after verification by PCR，restriction enzyme analysis and sequencing.This research will serve as a base for expression of pig β2AR gene in yeast expression system and its application in multiresidue determination of β2-adrenoceptor agonists.

β2adrenergic receptor；clone；yeast expression plasmid；pig

TS201.1

A

1002-0306（2015）18-0156-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.023

2015－02－05

王健（1980-），男，博士研究生，副教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全快速檢測技術(shù)，E-mail：xuanyuanjian0228@126.com。

王靜（1963-），女，博士，教授，研究方向：食品安全與檢測技術(shù)，E-mail：w_jing2001@126.com。

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201203094）。