紅果參果實(shí)多糖的提取及其單糖組分研究

李 斌，李 貴，陳功錫，李 輝，梁俊鵬，陳 雅

(1.吉首大學(xué) 植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 吉首 416000；2.中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 210000；3.吉首大學(xué) 生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000）

多糖為機(jī)體內(nèi)重要的天然生物大分子，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖等生理功效[1—3]。這些生物活性與其化學(xué)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，單糖組成是多糖一級(jí)結(jié)構(gòu)研究的重要內(nèi)容。目前多糖的單糖組成分析方法主要有氣相色譜(GC)、薄層色譜法(TLC)和高效液相色譜法(HPLC)等[4]。

湘西苗族資源植物紅果參，又名蜘蛛果、肉算盤等，學(xué)名長葉輪鐘草Campnumoea lancifolia，系桔?？平疱X豹屬多年生草本植物[5—6]。其味甘、微苦，性平，具益氣補(bǔ)虛、祛瘀止血功效，主要用于氣虛乏力、跌打損傷，民間則多用于治療肺癆咳嗽、瘰疬、疝氣等[7]。同時(shí)由于其有較高的觀賞價(jià)值，很受當(dāng)?shù)厝藗兿矏邸?011年陳功錫等[8]對(duì)紅果參多糖含量有初步報(bào)道，陳莉華等[9]報(bào)道了紅果參多糖能很好地清除羥基自由基和超氧陰離子自由基，其清除能力與多糖濃度呈正相關(guān)性，對(duì)油脂氧化有明顯的抑制作用。本文擬采用超聲波法[10—11]提取紅果參中具有活性作用的多糖，通過水解-還原-衍生，結(jié)合GC-MS[12—14]測(cè)定其單糖組成，為合理開發(fā)紅果參資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

紅果參果實(shí)采自湖南吉首市植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室紅果參試驗(yàn)基地，海拔247 m，為當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶從附近山林采挖栽培的植株。

1.2 試劑和儀器

葡萄糖(PR)、重蒸苯酚、濃硫酸(GR)、乙醇、氯仿、正丁醇、鹽酸(GR)、三氟乙酸、乙酸乙酯、異丙醇、冰乙酸、乙酸酐、吡啶、苯胺、二苯胺、丙酮、磷酸、D-葡萄糖(BR，天津市科米歐化學(xué)試劑有限公司)、麥芽糖(BR，上海國藥集團(tuán))，阿拉伯糖(BR)、D-半乳糖(BR)、D-木糖(BR)、D-甘露糖(BR)、L(+)鼠李糖(BR)、D-果糖(BR)由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，其他未標(biāo)明試劑均為分析純。

GCMS-QP2010氣質(zhì)聯(lián)用儀(島津)；UV-2550紫外可見分光光度計(jì)(島津)；HETOLL 1500 冷凍干燥機(jī)(捷克Heto)；J-26XP高速離心機(jī)(美國貝克曼)；DCTZ-2000多用途恒溫超聲波提取機(jī)(北京弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；AUY 120電子天平(島津)；HH.Q-1電熱恒溫干燥箱(長沙醫(yī)療器械廠)；RE-52真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紅果參多糖超聲提取工藝 根據(jù)紅果參特性，采用“果實(shí)—干燥—粉碎—過篩—脫脂—超聲波提取—過濾(離心)—濃縮—醇沉—冷凍干燥—紅果參粗多糖”的基本提取流程，通過單因素實(shí)驗(yàn)與L9(33)正交試驗(yàn)，研究浸提時(shí)間、溫度、提取功率對(duì)多糖提取率的影響(表1)。

表1 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平Table1 Experimental factors and levels of orthogonal design

1.3.2 紅果參多糖含量測(cè)定 以硫酸-苯酚法顯色[15]，紫外可見分光光度法測(cè)定紅果參樣品多糖含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：稱取干燥至恒重的葡萄糖，配置成100 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)使用液。分別移取0.0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)使用液置于10 mL刻度管中，補(bǔ)充蒸餾水至1.0 mL。分別加入苯酚試劑1.0 mL，搖勻，于冷水浴中緩緩加入3.0 mL硫酸，立刻搖勻。靜置5 min后，置于沸水浴加熱15 min，取出后立即以流水冷卻至室溫。在λ= 488 nm處以紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定吸光度A，以吸光度A為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量M為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算曲線相關(guān)系數(shù)。

樣品處理：取樣品溶液1.0 mL，按照硫酸-苯酚法，加入苯酚試劑，搖勻，冷水浴中緩緩加入3.0 mL硫酸，立刻搖勻，靜置5 min后，沸水浴15 min，冷卻后于λ= 488 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)。多糖含量按公式計(jì)算：多糖得率= (樣品中多糖質(zhì)量/紅果參樣品質(zhì)量)×100%。

1.3.3 紅果參多糖的分離純化 將所得粗多糖溶于純水中，分別以乙酸乙酯、Sevage試劑（三氯甲烷-正丁醇1: 5）混勻萃取5次，取水相加入10% H2O2，水浴15 min，再加入1.5%活性炭粉末，水浴10 min過濾，濾液濃縮，冷凍干燥，得多糖成品。

1.3.4 紅果參多糖的水解及衍生 水解：將10 mg多糖成品溶液加入0.5 mL 12 mol·L-1鹽酸，純氮封管，置于沸水浴中水解8 h，然后減壓濃縮水解液至最小體積。

還原：取0.066 g NaBH4，加入水解液中，再向水解液中加入0.66 mL濃氨水，靜置反應(yīng)過夜；加入冰醋酸至無氣泡產(chǎn)生，再減壓餾干溶液，去除產(chǎn)生的硼酸，得淡黃色水解產(chǎn)物。

衍生：水解產(chǎn)物中加入吡啶、乙酸酐各2.0 mL，于80 ℃水浴處理2.0 h，將衍生后的溶液減壓濃縮至干，加入1.0 mL蒸餾水，并用1.0 mL氯仿反復(fù)萃取三次，將三次萃取液合至刻度管中，氮吹至氯仿體積為0.5 mL，低溫密封保存，即得GC-MS待測(cè)衍生溶液；同時(shí)以氯仿為對(duì)照，進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 GC-MS分析條件 色譜條件：毛細(xì)管色譜柱；進(jìn)樣口溫度245 ℃；柱箱起始溫度130 ℃，保留3 min，以15 ℃·min-1升溫至210 ℃，保留2.0 min，再以10 ℃·min-1升溫至270 ℃，保留4.0 min；載氣為氦氣，恒流0.94 mL·min-1，分流比 20:1。

質(zhì)譜條件：EI電離電壓70 eV，離子源溫度200 ℃，接口溫度230 ℃，溶劑切除時(shí)間3.0 min，M/Z范圍50～500。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定結(jié)果表明，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量M在10～100 g范圍時(shí)，其與吸光度A線性關(guān)系良好，線性回歸方程為A= 0.0055M - 0.0053，相關(guān)系數(shù)R= 0.9995。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)顯示，其在8 h內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。精密度實(shí)驗(yàn)誤差范圍在0.23%～5.66% (n=6)，回收率為96.35%～101.80%。

2.2 紅果參多糖提取及其含量

超聲波溶劑法提取紅果參果實(shí)多糖，通過正交試驗(yàn)，初步確定最佳提取條件為提取溫度30 ℃，提取時(shí)間50 min，提取功率100 W，其中影響提取效果的因素主次順序?yàn)樘崛r(shí)間＞提取溫度＞提取功率(表2)。根據(jù)該最佳提取條件，測(cè)定其總糖得率為45.80%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table2 The results of orthogonal test

2.3 紅果參多糖組分

紅果參多糖GC-MS分析譜圖顯示有5個(gè)主峰(圖1)，對(duì)5個(gè)主峰成分進(jìn)一步分析，得到紅果參多糖主要單糖組成及百分比分別是阿拉伯糖(5.00%)、木糖(9.65%)、甘露糖(11.55%)、果糖(30.20%)、半乳糖(33.85%)(圖2)。另外，在10.7～11.0 min之間，還有未知峰組分(圖1)，具體組分有待進(jìn)一步研究。

圖1 紅果參多糖的GC-MS總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatogram of polysaccharide component from Campnumoea lancifolia by GC-MS

圖2 紅果參多糖各單糖組分的質(zhì)譜圖Fig.2 MS chromatogram of polysaccharide composition from Campnumoea lancifolia

3 討論

本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察影響紅果參多糖提取的因素，得出紅果參多糖最佳提取條件。結(jié)果表明，提取時(shí)間是影響提取效果的主要因素，提取溫度次之，提取功率影響相對(duì)較小，說明各因素對(duì)紅果參多糖提取的影響存在一定的差異。前人分別采用柱前衍生HPLC法和水解—衍生—TLC法[16—21]對(duì)不同材料中多糖的單糖組成進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)雖然TLC法可定性分析單糖組成，但GC-MS法和HPLC法能更合理地反映單糖的組成及配比，且柱前衍生化聯(lián)合GC-MS測(cè)定多糖的方法更簡(jiǎn)便有效。因此，本研究采用衍生GC-MS法測(cè)定紅果參多糖的單糖組成。GC-MS實(shí)驗(yàn)表明，紅果參多糖主要由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、果糖和半乳糖組成，其百分比分別為 5.00%、9.65%、11.55%、30.20%和 33.85%；另外，圖1中存在其他峰，可能是其他單糖分子結(jié)構(gòu)衍生物?？紤]到糖(特別是酮糖)衍生物制備過程中，糖結(jié)構(gòu)容易發(fā)生異構(gòu)化，同種單糖可能出現(xiàn)數(shù)個(gè)衍生物的色譜峰。因此，這些峰組分有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。

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