玉米自交系（AS-9）耐鹽突變體的遺傳變異分析

楊鳳嬌，李紅英，盧存福，陳玉珍

（北京林業(yè)大學 生物科學與技術學院 林木育種國家工程實驗室 林木花卉遺傳育種教育部重點實驗室，北京 100083）

玉米自交系（AS-9）耐鹽突變體的遺傳變異分析

楊鳳嬌，李紅英，盧存福，陳玉珍

（北京林業(yè)大學 生物科學與技術學院 林木育種國家工程實驗室 林木花卉遺傳育種教育部重點實驗室，北京 100083）

以玉米基礎自交系（AS-9）及其化學誘變自交系M4為實驗材料進行耐鹽性鑒定，同時利用44對可能與根系性狀有關聯(lián)的SSR引物進行遺傳變異分析。結(jié)果表明，誘變M4幼苗經(jīng)200和250 mmol·L-1NaCl鹽脅迫處理7 d后，IV400、IV1600根數(shù)比AS-9對照分別增加23.1%、19.1%，誘變IV1600初生根1、2、3根長分別為對照的1.33、1.70、2.15倍；同時在M4玉米試材中擴增出多態(tài)性條帶的引物25對，占引物總數(shù)的56.82%；誘變自交系M4與AS-9的遺傳相似系數(shù)平均值為0.6563，遺傳相似系數(shù)中心化后，數(shù)據(jù)在-0.04處可把材料分為三個類群，基礎材料AS-9為Ⅰ類，M4代IV1400、IV1600、IV2000聚為Ⅲ類，其余誘變系為Ⅱ類。此外，6對引物的SSR-PCR產(chǎn)物進行序列差異檢測，結(jié)果產(chǎn)生新的基元和基元重復次數(shù)變化，說明系列化學誘變已使玉米自交系AS-9產(chǎn)生了顯著的遺傳變異。

玉米；自交系；化學誘變；SSR標記；遺傳變異

目前，人工誘變被廣泛運用到植物育種工作中，主要包括離子束、X射線、γ射線等物理誘變方法，疊氮化物、烷化劑等化學誘變方法以及T-DNA、轉(zhuǎn)座子等生物誘變方法［1—2］?；瘜W誘變突變率高，突變位點具一定的特異性，出現(xiàn)的分子水平變化較多，不會引起染色體畸變或損傷，且致死率低、價格低廉、操作簡單［2—3］。目前，通過化學誘變方法獲得了多種植物如水稻、玉米、黃瓜、花生等的多種突變體［4—6］。

DNA分子標記可以直接反映核苷酸序列上的差異，檢測結(jié)果精確。分子標記技術如RFLP、RAPD、AFLP、SSR等已用于各種實驗材料的遺傳變異研究。SSR分子標記具有染色體上分布均勻、共顯性、多態(tài)性較為豐富、分辨率高且不受環(huán)境影響等優(yōu)點，被廣泛應用于植物種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、目標性狀基因定位、遺傳圖譜構建及種子純度分析等研究［7—10］。研究產(chǎn)量、品質(zhì)、抗逆性等數(shù)量性狀對農(nóng)作物遺傳改良具有重要意義，隨著DNA分子標記技術的不斷發(fā)展，把數(shù)量性狀的復雜遺傳剖析推向新的高度［11—12］。關聯(lián)分析將標記（或候選基因）的遺傳變異與目標的表型性狀聯(lián)系起來［13—14］，目前在小麥［12］、玉米［15］、水稻［16—17］等植物中應用較廣泛。

本研究以數(shù)據(jù)庫資源豐富的基因組測序植物玉米的基礎自交系 AS-9及化學誘變系 M4為實驗材料，檢驗幼苗經(jīng)鹽脅迫后的生物學效應，并以與根系性狀可能有關聯(lián)的SSR 標記研究各誘變系與基礎材料間的遺傳差異，以此驗證化學誘變對實驗材料遺傳變異的影響，為合理利用化學誘變創(chuàng)造新的種質(zhì)資源提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

以玉米自交系AS-9為基礎自交系，經(jīng)系列化學誘變后獲得自交第4代（M4）誘變系，分別為IV200、IV400、IV800、IV1200、IV1400、IV1600、IV2000。自交系AS-9與誘變系同時種植至第4代命名為IVCK。用于SSR分子標記的實驗材料取自玉米自交系IVCK和誘變系M4各株系未作任何鹽脅迫處理正常生長的幼苗。

1.2發(fā)芽實驗

上述實驗材料種子在75%酒精溶液中消毒5 min，次氯酸鈉溶液（2.5%有效氯）消毒3 min，無菌水清洗3～5次，培養(yǎng)皿中發(fā)芽。每培養(yǎng)皿50粒，重復3次，于25 ℃進行暗發(fā)芽。幼苗生長30 d后，采用200 mmol·L-1和250 mmol·L-1NaCl各處理7 d，進行芽長、根長及根數(shù)等形態(tài)學指標檢測。

1.3SSR標記引物篩選及PCR體系擴增

1.3.1引物篩選根據(jù)玉米數(shù)據(jù)庫MaizeGDB公布的引物序列及已有文獻資料［18—20］，合成可能與根系發(fā)育有關的引物44對，篩選出擴增穩(wěn)定、條帶清晰、重復性高、多態(tài)性好的25對引物用于實驗，目標引物占總合成引物數(shù)的56.82%。

1.3.2基因組DNA提取及PCR擴增采用李紅英等［21］的方法提取基因組DNA。PCR擴增體系（20 μL）：F-primer與R-primer各0.5 μL（10 μmol·L-1），dNTP 0.4 μL（2.5 mmol·L-1），Taq酶0.2 μL（2.5 U·μL-1），DNA 6 μL （15 ng·μL-1），ddH2O 10.4 μL，Buffer（10×） 2 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，28個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，并于4 ℃保存。

1.4擴增產(chǎn)物電泳檢測

6%變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，對3次電泳完全一致的條帶進行統(tǒng)計。

1.5數(shù)據(jù)分析

采用Excel和SPSS19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。利用NTSYSpc 2.10e軟件計算SSR遺傳相似系數(shù)（Dice）；應用SAHN程序中的UPGMA方式構建樹狀圖，完成聚類分析［21］。利用Popgene1.32 計算Simpson多樣性指數(shù)（也稱位點多態(tài)信息量PIC）以及Shannon-weaver多樣性指數(shù)（也稱基因型多樣性H）［21—22］。

2　結(jié)果與分析

2.1化學誘變對M4代種子生物學效應的影響誘變自交系 M4代幼苗生長30 d后，采用200、250 mmol·L-1NaCl各處理 7 d，誘變自交系 M4代IV400、IV1600根數(shù)增加23.1%、19.1%，誘變自交系IV1600初生根（最早長出的根）根長1、根長2、根長3分別為對照的1.33、1.70、2.15倍；大部分誘變系M4代的芽長降低，只有IV400與對照差異不顯著。鹽脅迫后，誘變M4代多數(shù)芽長降低而根數(shù)增加，說明化學誘變改變了玉米誘變系的生根能力，根長增加及根數(shù)增多為提高其抗逆能力奠定了基礎（表1，圖1）。

表1　鹽脅迫對誘變玉米自交系 M4代幼苗生長的影響Table 1　Effects of salt stress on seedling growth of M4 maize

圖1　化學誘變后代玉米自交系幼苗抗鹽性的變化Fig. 1　The seedling salt resistance results of untreated maize line AS-9 and M4 generation of mutagenic line generated from AS-9 treated with mutagens

2.2化學誘變后代的遺傳變異分析

2.2.1誘變后代SSR標記分析采用44對可能與根系發(fā)育有關的SSR引物進行PCR擴增，篩選出擴增穩(wěn)定、條帶清晰、重復性高、多態(tài)性好的引物。根據(jù)篩選出的25 對SSR引物對基礎材料（IVCK）和7個誘變玉米自交系擴增條帶進行統(tǒng)計，共擴增得到69個等位基因，其中，多態(tài)性條帶總數(shù)為50個，多態(tài)性百分率達 72.46%，單個引物擴增帶變幅 1～2個。位點的多態(tài)信息量（PIC）和基因型多樣性（H）變化范圍分別為0.1103～0.3750和0.2338～0.6931，平均值分別為0.3062和0.5697 （表2）。結(jié)果表明，基礎自交系AS-9與其誘變自交系之間存在較高的遺傳差異。

2.2.2SSR標記遺傳相似性分析利用25個可能與根系相關的多態(tài)性標記進行統(tǒng)計（表3），所有實驗材料間的遺傳相似系數(shù)在0.5797～0.8841之間。其中，7個誘變系間的遺傳相似系數(shù)為0.5942～0.8841；各誘變系與AS-9遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.5797～0.7101，表明誘變 M4代與AS-9的遺傳相似性較低。誘變系IV1400、IV2000與AS-9遺傳相似性最低，為0.5797，可見IV1400、IV2000誘變效果明顯；誘變系IV400、IV1200盡管與AS-9的相似性最高，可遺傳相似系數(shù)僅為0.7101，充分說明采用系列化學誘變獲得的M4代已發(fā)生較為明顯的遺傳變異。

表2　25對引物在8個自交系中檢測到的遺傳變異信息Table 2　Genetic variation information for 25 loci detected in 8 maize inbred lines

表3　玉米自交系AS-9及誘變 M4代遺傳相似系數(shù)Table 3　Genetic similarity coefficient of maize inbred lines AS-9 and mutagenesis M4 generation

2.2.3SSR標記的聚類分析聚類分析顯示（圖2），遺傳相似系數(shù)進行中心化后，數(shù)據(jù)在-0.04處，可將自交系玉米材料分為三個類群，基礎自交系IVCK為Ⅰ類；誘變系IV800和IV1200的聚類完全重疊在一起，與IV200、IV400為Ⅱ類；誘變M4代IV1400、IV1600、IV2000聚為Ⅲ類。利用可能與根系相關的標記進行檢測，誘變M4與AS-9之間發(fā)生了顯著的遺傳變異，SSR標記的聚類分析結(jié)果與遺傳相似性分析結(jié)果基本一致。

圖2　玉米自交系AS-9及誘變自交系M4代進行聚類分析結(jié)果Fig. 2　A UPGMA dendrogram ofmaize inbred lines AS-9 andmutagenesis M4 generationbased on 25 SSR markers

2.2.4不同誘變系部分引物 SSR-PCR產(chǎn)物序列變化選取具有擴增多態(tài)性，清晰穩(wěn)定性好的部分引物進行測序，其中 6對引物 bnlg339、umc1064、umc2365、phi10412、bnlg391、umc1993可能與根系的發(fā)生及數(shù)目關聯(lián)度較高（表4）。

將SSR-PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與NCBI和MaizeGDB數(shù)據(jù)庫的序列進行比對（表4），結(jié)果顯示，不同玉米自交系的短片段序列重復兩端是高度保守的，由于實驗采用的基礎自交系AS-9與數(shù)據(jù)庫的玉米自交系不同，因此SSR-PCR產(chǎn)物基元類型和重復次數(shù)表現(xiàn)不同。6對引物均使基礎自交系和誘變系的基元重復次數(shù)發(fā)生了一定的變化，其中標記引物bnlg339、umc1064、phi10412、bnlg391發(fā)生了基元重復次數(shù)的變化，而umc2365、umc1993不但發(fā)生了基元重復的變化，同時出現(xiàn)了新的重復基元。此外，從擴增片段大小的差異來看，umc2365、phi10412、umc1993三對引物檢測出基礎自交系和誘變系發(fā)生非常顯著的遺傳變異，其中誘變系IV800、IV1200、IV1400、IV1600、IV2000與基礎自交系的遺傳差異最為明顯，這與前述的聚類分析結(jié)果一致。

表4　6對SSR引物擴增片段測序結(jié)果Table 4　The sequencing results of amplified fragment based on 6 SSR markers

圖3　樣品在凝膠圖譜中的位置Fig. 3　The positions of the samples in the gel maps

3　討論

化學誘變育種具有經(jīng)濟方便、加快遺傳基因重組、提高突變頻率、擴大實驗材料的突變譜等優(yōu)點，能夠較快地創(chuàng)造有利用價值的突變體。SSR共顯性標記能直接在分子水平上反映實驗材料的遺傳與變異，且不受環(huán)境影響［10，23］，因此被廣泛應用于遺傳變異研究。

對實驗材料進行表型性狀差異分析是鑒定各種誘變產(chǎn)生遺傳變異的有效方法［24］。實驗表明，化學誘變系M4種子的發(fā)芽率、芽長和根數(shù)普遍高于對照［21］；幼苗經(jīng)200、250 mmol·L-1NaCl鹽脅迫各處理7 d后，誘變系 M4中 Ⅳ400、Ⅳ1600根數(shù)比AS-9增加23.1%、19.1%，誘變系Ⅳ1600初生根1、2、3根長分別為對照1.33、1.70、2.15倍（圖1，表1）。可見誘變處理顯著提高了誘變后代實驗材料的種子活力、發(fā)芽率，根數(shù)和芽長明顯增加，同時鹽處理后根部性狀差異較大，誘變系生物學性狀的變化為增強其抗逆能力奠定了基礎。

利用各種誘變方法處理玉米自交系后，均產(chǎn)生了不同程度的遺傳變異。李奇等［23］利用60Co-γ處理玉米自交系（R08、48-2）種子，選育101份M3株系，與對照平均遺傳相似系數(shù)為0.8194～0.8373；喬曉等［22］將玉米自交系（K305、K169、698-3）進行航天育種實驗，獲得的118個誘變后代與各自對照遺傳相似系數(shù)平均值為 0.6894～0.7924；覃鴻妮等［4］利用 52對SSR引物進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)大部分誘變系與對照的玉米自交系“082”平均遺傳相似系數(shù)為0.823，表示化學誘變前后遺傳距離較近；Kostova等［25］利用SSR分子標記分析化學誘變玉米的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)化學誘變使開花時間、產(chǎn)量、顆粒類型、蛋白含量等表型性狀及非生物脅迫耐受性等發(fā)生了變化，誘變使遺傳多樣性水平從原始自交系材料的0.608增加到0.651。本實驗玉米化學誘變自交系 M4與AS-9遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.5797～0.7101，平均值為0.6563（表2），同時位點的多態(tài)信息量（PIC）、基因型多樣性（H）（表2）、聚類分析（圖2）以及SSR-PCR產(chǎn)物序列測序結(jié)果（表4）均表明，本實驗系列化學誘變獲得的誘變系純合度較高，且在分子水平上發(fā)生了較大程度的變異。

Tuberosa等［18］研究Lo964 × Lol0l6的F3家系在水培條件下玉米根系相關性狀的QTL，同時還研究了水分脅迫條件下該家系產(chǎn)量性狀的QTL，進而分析根系相關性狀對產(chǎn)量的影響。張微［19］采用845對SSR引物對親本綜3和87-1進行多態(tài)性檢測，利用覆蓋玉米全基因組的分析標記連鎖圖，進行玉米苗期根系性狀的QTL定位，發(fā)現(xiàn)研究中所定位的QTL與其他群體所定位根系相關的QTL具有相同或相似的染色體區(qū)間，同時闡明了控制玉米根系的QTL與控制水稻根系的QTL存在廣泛同源性關系。

本實驗化學誘變系在鹽脅迫下根部性狀與基礎自交系差異顯著。采用篩選出的25對與根系性狀可能相關的引物對化學誘變系M4進行檢測，結(jié)果顯示，誘變系發(fā)生了顯著的遺傳變異。但由于數(shù)量性狀在遺傳上非常復雜，性狀與基因組之間的關系受多種因素調(diào)控，同時基因與基因、基因與環(huán)境之間還存在明顯的互作關系，其表達還受遺傳背景的影響［11，26—27］，因此化學誘變與根部相關性狀之間的關聯(lián)還有待進一步驗證。

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Genetic Variation Analysis of Salt-tolerant Mutant from Maize Inbred Lines （AS-9）

YANG Feng-jiao， LI Hong-ying， LU Cun-fu， CHEN Yu-zhen
（National Engineering Laboratory for Tree Breeding， Key Laboratory of Genetics and Breeding in Forest Trees and Ornamental Plants， Ministry of Education， College of Biological Sciences and Biotechnology， Beijing Forestry University， Beijing 100083， China）

Chemical mutation was an effective way of creating new germplasm resources. To analyze the impact of chemical mutagenesis on AS-9 maize inbred offspring， the salt tolerance and genetic variation between mutant M4 and the corresponding original material （AS-9） were evaluated by using 44 pairs of SSR markers that may be associated with root traits. Seed germination， bud length and root number of M4 were higher than that of AS-9. After treatment with 200 and 250 mmol·L-1NaCl for 7 days， root numbers of IV400 and IV1600 seedlings were higher than that of AS-9， with increases of 23.1% and 19.1%， respectively. IV1600 primary root lengths of 1， 2， 3 were 1.33， 1.70，and 2.15 times longer than that of AS-9， respectively. Twenty five pairs of SSR primers gave profiles amplified in sample of M4 mutants， accounting for 56.82% of the total pairs of primers. The average value of genetic similarity coefficient between IVCK and M4 was 0.6563. With the centered genetic similarity coefficient of -0.04 by UPGMA， the maize inbred line materials were divided into three groups： the original material （IVCK）， the M4 mutants including IV1400， IV1600， IV2000， and other M4 mutants （IV200， IV400， IV800， IV1200）. Principal component analysis and clustering results were similar. In addition， SSR-PCR products amplified by six pairs of primers were sequenced， the results showed that there was distinct variation between AS-9 and the induced M4， indicating chemical mutagenesis made maize inbred AS-9 produce a wide range of genetic variation.

maize； inbred lines； chemical mutagenesis； SSR markers； genetic variation

10.3969/j.issn.1009-7791.2015.01.001

S513

A

1009-7791（2015）01-0001-07

2014-12-24

國家科技支撐計劃項目（2011BAI13B06）；國家自然科學基金（31270737） ；北京市自然科學基金（6112016）

楊鳳嬌，碩士研究生，從事植物分子生物學研究。E-mail： yfj0704029@163.com

注：楊鳳嬌與李紅英為同等貢獻作者；陳玉珍為通訊作者。E-mail： chenyuzhen@bjfu.edu.cn