產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌種的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

陳 朋，朱玥明，韓文佳，門 燕，賈士儒，孫媛霞，*

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所， 天津 300308）

產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌種的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

陳 朋1，2，朱玥明2，韓文佳1，2，門 燕2，賈士儒1，孫媛霞2，*

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所， 天津 300308）

以 褐藻酸鈉為唯一碳源，經(jīng)多次富集和馴化，從養(yǎng)殖場腐爛海帶中篩選到一株高產(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌株Alg07。依據(jù)菌體形態(tài)、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析，歸屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），命名為Bacillus weihaiensis Alg07。通過單因素試驗和正交試驗，確 定菌株Alg07的最佳發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基成分：褐藻酸鈉9 g/L、蛋白胨1 g/L、酵母粉3 g/L、NaCl 5 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、KCl 5 g/L、CaCl24 g/L；最佳發(fā)酵產(chǎn)酶條件為：250 mL三角瓶裝液量40 mL、培養(yǎng)溫度30 ℃、初始發(fā) 酵pH 6.5、接種量0.5%、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、培養(yǎng)時間24 h。在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下，褐藻膠裂解酶活力由35 U/mL提高到563 U/mL。

褐藻膠裂解酶；篩選；鑒定；芽孢桿菌；發(fā)酵條件優(yōu)化

褐藻膠是由β-D-甘露糖醛酸（β-D-1，4-mannuronic acid，簡稱M）和其5位差向異構(gòu)體α-L-古羅糖醛酸（α-L-1，4-guluronic acid，簡稱G）以C-1，4糖苷鍵非均聚形成的線性分子。根據(jù)兩種糖的組合方式不同，褐藻膠具有3 種結(jié)構(gòu)單元，聚甘露糖醛酸片段（polymannuronic acid，PM）、聚古羅糖醛酸片段（polyguluronic acid，PG）以及甘露糖醛酸與古羅糖醛酸的交替片段（PMG）［1］。研究發(fā)現(xiàn)褐藻膠的降解產(chǎn)物--褐藻寡糖穩(wěn)定性高、水溶性強、安全無毒，具有抗凝血［2］、抗腫瘤［3］、促進腸道內(nèi)雙歧桿菌生長［4］、增強植物抗逆性［5］等眾多生理活性，其開發(fā)與應用研究已經(jīng)成為新的熱點。與傳統(tǒng)的酸降解的方法制備褐藻寡糖不同，褐藻膠裂解酶酶解生產(chǎn)褐藻寡糖具有催化效率高、過程可控、降解條件溫和、節(jié)約能源、產(chǎn)物收率高等優(yōu)點。此外，褐藻膠裂解酶可以作為工具酶用于治療囊性纖維化（cysticfibrosis，CF）患者的肺部感染［6］，褐藻膠精細結(jié)構(gòu)的分析［7］，海藻單細胞及原生質(zhì)體的制備。2012年Wargacki等［8］在Science上發(fā)表用褐藻膠裂解酶降解褐藻膠來生產(chǎn)生物乙醇的論文，為解決能源危機提供了新的思路。

褐藻膠裂解酶通過β-消除反應催化降解褐藻膠單體間的1，4糖苷鍵，在C4、C5之間形成不飽和雙鍵，并伴隨4-O-糖苷鍵的消除，且在非還原端生成4-脫氧-L-erthro-hex-4-烯醇式吡喃糖醛酸（4-deoxy-L-erythro-hex-4-enopyranosyl uro nic acid）［9］。褐藻膠裂解酶按其降解褐藻多糖作用方式的不同在EC數(shù)據(jù)庫中被分為多聚β-D-1，4-甘露糖醛酸裂解酶（EC 4.2.2.3）和多聚α-L-1，4-古洛糖醛酸裂解酶（EC 4.2.2.11）［10］。在自然界中能夠產(chǎn)生褐藻膠裂解酶的生物分布廣泛，已報道產(chǎn)褐藻膠裂解酶的物種有海洋軟體動物［11］、棘皮動物［12］、細菌［13］、真菌［14］等，其中由于細菌生長快、產(chǎn)酶量高，因此相關(guān)研究最多。目前褐藻膠裂解酶的產(chǎn)品開發(fā)依然面臨酶活力較低、酶穩(wěn)定性差、酶的底物譜窄等問題。目前，國際市場上只有Sigma公司的一種產(chǎn)自黃菌屬（Flavobacterium sp.）的褐藻膠裂解酶酶制劑產(chǎn)品A1603問世，價格昂貴，主要以試劑形式出售，這極大地限制了褐藻膠裂解酶在食品、農(nóng)業(yè)及醫(yī)藥等領(lǐng)域的廣泛應用。

本實驗以褐藻酸鈉為唯一碳源，經(jīng)過多次富集和馴化，從腐爛海帶中分離篩選得到一株高產(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌株，通過形態(tài)觀察、生理生化實驗和16S rRNA基因序列分析進行菌種鑒定，并對其產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化，以期為褐藻膠裂解酶的分離純化、酶學性質(zhì)研究及褐藻寡糖的酶法制備奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與培養(yǎng)基

篩選樣品來源于威海青漁灘海珍品養(yǎng)殖場腐爛海帶。

海藻酸鈉 國藥集團化學試劑有限公司；二硝基水楊酸（dinitrosaliccylic acid，DNS） 生工生物工程（上海）股份有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；擴增16S rRNA基因引物由金唯智生物科技有限公司合成，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

富集培養(yǎng)基：海藻酸鈉5 g、（NH4）2SO45 g、NaCl 19.45 g、MgCl2·6H2O 12.6 g、Mg SO4·7H2O 6.64 g、KCl 0.55 g、NaHCO30.16 g、檸檬酸鐵（FeC6H5O7）0.1 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.2。初篩培養(yǎng)基在富集培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加15 g瓊脂。121 ℃濕熱滅菌20 min。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：海藻酸鈉5 g、蛋白胨5 g、酵母膏1 g、NaCl 19.45 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2。

1.2儀器與設(shè)備

UV-1800紫外分光光度計 日本島津公司；HZQ-C空氣浴振蕩器 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)有限公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國Eppendorf公司；恒溫培養(yǎng)箱 上海福瑪實驗設(shè)備有限公司；生物顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3方法

1.3.1產(chǎn)酶菌株的篩選

取5 g樣品放入盛有45 mL富集培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在30 ℃、180 r/min條件下?lián)u瓶發(fā)酵培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)液用無菌生理鹽水按照10－3到10－7進行梯度稀釋，取0.1 mL的稀釋液涂布于初篩固體平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后觀察，將先生長的或有透明圈的菌落用平板劃線法進行菌株的分離純化，將分離純化的菌株用甘油管保存。將分離純化的菌株接入初始發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h，取發(fā)酵液，12 000 r/min離心15 min，測定發(fā)酵上清液酶活力。

1.3.2褐藻膠裂解酶酶活力測定

取0.2 mL粗酶液加入1.8 mL用pH 8.0 Tris-HCl緩沖液配制的1 g/100 mL海藻酸鈉底物中，空白對照只加入1.8 mL底物，40 ℃條件下反應20 min，100 ℃滅活5 min，在空白管中加入0.2 mL已經(jīng)滅活的粗酶液，加入DNS試劑1.5 mL，沸水浴5 min，冷卻至室溫，定容至10 mL，于540 nm波長處測定吸光度。每次做3 個平行。

酶活力單位（U）定義為在實驗條件下，每分鐘催化底物產(chǎn)生1 ?g還原糖所需的酶量。

相對酶活力：將實驗組中最高的酶活力定義為100%，其他條件下的酶活力與最高酶活力的比值為相對酶活力。

1.3.3菌種鑒定

1.3.3.1形態(tài)學鑒定及生理生化實驗

取發(fā)酵培養(yǎng)24 h的菌液稀釋至合適濃度，涂布于初篩培養(yǎng)基，30 ℃倒置培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)及細胞形態(tài)（革蘭氏染色法）。生理生化鑒定參照《伯杰細菌鑒定手冊》［15］。

1.3.3.216S rRNA基因鑒定

用細菌基因組D N A提取試劑盒提取該菌的全基因組，以1 6 S r R N A基因的通用引物2 7 F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）、1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進行擴增，擴增片段送至金唯至生物科技公司測序。將測序結(jié)果的基因序列輸入美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）核酸數(shù)據(jù)庫進行BLAST分析，采用Clustal X進行完全序列比對切割，將結(jié)果輸入MEGA6.0軟件中，以Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［16］。

1.3.4初始培養(yǎng)條件

在250 mL三角瓶中裝入50 mL初始發(fā)酵培養(yǎng)基，121 ℃滅菌20 m in，將培養(yǎng)至對數(shù)期后期的種子液無菌接種到三角瓶，接種量為2%，30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h，測發(fā)酵液酶活力，所有實驗設(shè)計3 次平行。前一步優(yōu)化的結(jié)果用于后續(xù)實驗。

1.3.5培養(yǎng)基成分優(yōu)化

通過單因素試驗研究碳源種類及其質(zhì)量濃度、NaCl質(zhì)量濃度、氮源種類及各種無機鹽對菌株產(chǎn)酶的影響。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗確定對菌株產(chǎn)酶有促進作用的各種組分的最佳組合質(zhì)量濃度。

1.3.5.1碳源種類對產(chǎn)酶的影響

分別選用5 g/L的葡萄糖、乳糖、甘露糖、D-甘露醇、麥芽糖、淀粉和海藻酸鈉作為唯一碳源配制發(fā)酵培養(yǎng)基，確定最佳碳源。

1.3.5.2海藻酸鈉質(zhì)量濃度對產(chǎn)酶的影響

在初始培養(yǎng)基中添加0、3、6、9、12、15 g/L的海藻酸鈉，確定菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳碳源質(zhì)量濃度。

1.3.5.3氮源種類對產(chǎn)酶的影響

添加9 g/L的海藻酸鈉，分別用5 g/L的有機氮源（牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、尿素）、無機氮源（（NH4）2SO4、NH4Cl、（NH4）3PO4）及2.5 g/L的復合氮源（尿素+蛋白胨、酵母粉+蛋白胨）作為氮源進行菌株的發(fā)酵培養(yǎng)，考察不同氮源對產(chǎn)酶的影響。

1.3.5.4無機鹽對產(chǎn)酶的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0、5、10、15、20、25、30 g/L的NaCl，確定菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳NaCl質(zhì)量濃度。在最佳的NaCl質(zhì)量濃度的基礎(chǔ)上，在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加MgSO4·7H2O、KCl、CaCl2、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CuSO4·5H2O、FeSO4·7H2O、FeCl3·6H2O、FeC6H5O7，其中MgSO4·7H2O、KCl、CaCl2的質(zhì)量濃度均為1 g/L，其他無機鹽的質(zhì)量濃度均為0.05 g/L，確定對菌株的產(chǎn)酶有促進作用的無機鹽。

1.3.5.5MgSO4·7H2O、KCl、CaCl2質(zhì)量濃度對產(chǎn)酶的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0、1、2、3、4、5、6 g/L的MgSO4·7H2O、KCl、CaCl2，確定菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳無機鹽質(zhì)量濃度。

1.3.5.6培養(yǎng)基成分的正交試驗

選擇海藻酸鈉、蛋白胨、酵母粉、N a C l、MgSO4·7H2O、KCl、CaCl2質(zhì)量濃度7 個因素為主要影響因素，按照七因素三水平進行正交試驗（L18（37））。

1.3.6培養(yǎng)條件優(yōu)化

以優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分配制發(fā)酵培養(yǎng)基，通過單因素試驗研究培養(yǎng)溫度（15～40 ℃）、初始發(fā)酵pH值（5.5～10）、接種量（0.1%～3%）、裝液量（20～100 mL/250 mL）對菌株產(chǎn)酶的影響。

2　結(jié)果與分析

2.1菌種篩選

經(jīng)富集培養(yǎng)、分離及純化，共篩選到11 株能在以褐藻酸鈉為唯一碳源的初篩培養(yǎng)基上生長且能形成透明圈的菌株。將篩選到的11 株菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，進行復篩，對其產(chǎn)酶能力進行比較。結(jié)果表明，菌株Alg07發(fā)酵上清液酶活力最高。經(jīng)5 代遺傳穩(wěn)定性培養(yǎng)證明，該菌株產(chǎn)酶能力穩(wěn)定，作為下一步研究的出發(fā)菌株。

2.2菌株Alg07的鑒定

2.2.1形態(tài)學鑒定

圖1　菌株Alg07的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of strain Alg07

由圖1可知，菌株Alg07在初篩培養(yǎng)基上生長48 h后，菌落呈圓形，淡黃色，菌落較大，中間不透明，邊緣半透明，表面粗糙。菌株Alg07在顯微鏡下為桿狀，革蘭氏染色陽性。

2.2.2生理生化特征

表1　菌株Alg07生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain Alg07

由表1可知，菌株Alg07可在15～45 ℃、pH 5.5～10.5范圍內(nèi)生長，最適生長溫度為37 ℃、最適生長pH值為8.5，最高能耐受12 g/100 mL的NaCl。

2.2.316S rRNA基因鑒定

菌株Alg07的16S rRNA基因序列長度為1 497 bp，該序列已提交至NCBI GenBank，其登錄號為KM040772。經(jīng)過比對，與菌株Alg07相似性97%以上的菌株大部分為不可培養(yǎng)的菌株，少數(shù)為沒有鑒定到種的菌株。與菌株Alg07相似性最高的菌株為B. litoralis S20409（97%）和B. simplex J2S3（97%）。用Mega軟件繪制Alg07系統(tǒng)進化樹，結(jié)果見圖2。菌株Alg07與其他已鑒定到種的芽孢桿菌親緣關(guān)系較遠，結(jié)合形態(tài)特征及生理生化特征將其鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus），命名為Bacillus weihaiensis Alg07。

圖2　依據(jù)16S rRNA基因序列構(gòu)建的菌株Alg07的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain Alg07 based on 16S rRNA gene sequence

2.3產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.3.1海藻酸鈉質(zhì)量濃度對產(chǎn)酶的影響

實驗發(fā)現(xiàn)，菌株Alg07只有以海藻酸鈉為碳源時才產(chǎn)酶，說明該菌株產(chǎn)生的褐藻膠裂解酶為誘導酶，這與文獻報道的相一致［17-18］。不同海藻酸鈉質(zhì)量濃度對菌株Alg07產(chǎn)酶的影響見圖3。

圖3　海藻酸鈉質(zhì)量濃度對菌株Alg07產(chǎn)酶的影響Fig.3 Influence of alginate concentration of on enzyme production

由圖3可知，當海藻酸鈉質(zhì)量濃度為9 g/L時，其產(chǎn)酶達到最高值，海藻酸鈉質(zhì)量濃度超過9 g/L時，菌株產(chǎn)酶不斷降低，原因可能是褐藻膠降解產(chǎn)物會對褐藻酸裂解酶的生物合成產(chǎn)生阻遏。但其菌體生物量（用OD600nm表示）卻隨著海藻酸鈉質(zhì)量濃度的增加不斷增大，可能是海藻酸鈉中的色素影響了OD600nm的測定。

2.3.2氮源種類對產(chǎn)酶的影響

氮源是構(gòu)成生物體蛋白質(zhì)、核酸及氮素類化合物的原料，是微生物代謝生長的重要營養(yǎng)物質(zhì)，對菌體的生長及產(chǎn)酶具有重要影響。由表2可知，菌株Alg07能在多種氮源條件下生長，但在以酵母粉與蛋白胨為復合氮源時菌株產(chǎn)酶能力與菌體生物量均明顯高于其他氮源。因此，培養(yǎng)基的最適氮源為酵母粉與蛋白胨組成的有機復合氮源?？赡苁墙湍阜叟c蛋白胨中有許多的小肽及微量元素有利于菌株的生長及產(chǎn)酶。

表2　不同氮源對菌株Alg07產(chǎn)酶的影響Table 2 Influence of different nitrogen sources on enzyme production

2.3.3無機鹽對產(chǎn)酶的影響

由于菌株Alg07是由海洋附近的腐爛海帶中篩選獲得的，對鹽度的依賴是海洋微生物的基本特征。因此，首先測定了不同質(zhì)量濃度的NaCl對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，實驗發(fā)現(xiàn)，不同質(zhì)量濃度的NaCl對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶影響不顯著，當NaCl質(zhì)量濃度為5 g/L時，菌株產(chǎn)酶達到最大值，選擇5 g/L的NaCl質(zhì)量濃度作為下一步研究的基礎(chǔ)。接下來，研究了各種無機鹽對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，發(fā)現(xiàn)MgSO4·7H2O、KCl、CaCl2對菌株Alg07產(chǎn)酶促進作用明顯，其余金屬離子對菌株的產(chǎn)酶均有不同程度的抑制作用。進一步測定了不同質(zhì)量濃度的MgSO4·7H2O、KCl、CaCl2對菌種Alg07產(chǎn)酶的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，不同質(zhì)量濃度的MgSO4·7H2O、KCl對菌株Alg07的產(chǎn)酶無明顯的規(guī)律性，但不添加這兩種無機鹽會導致菌株產(chǎn)酶量明顯降低。不同質(zhì)量濃度的CaCl2對菌株的產(chǎn)酶促進作用趨勢明顯，結(jié)果見圖4。

圖4　CaaCCll2質(zhì)量濃度對菌株Alg07產(chǎn)酶的影響Fig.4 Influence ofof CaCl2concentration on enzyme production

由圖4可知，當CaCl2質(zhì)量濃度低于5 g/L時，菌體的生物量變化不大，但不同質(zhì)量濃度的CaCl2對菌株的產(chǎn)酶影響非常顯著。當CaCl2質(zhì)量濃度為4 g/L時，菌株產(chǎn)酶的能力最高，CaCl2質(zhì)量濃度過高，過多的CaCl2與海藻酸鈉形成沉淀，影響菌體的生長，從而導致菌體產(chǎn)酶量減少。

2.3.4培養(yǎng)基成分正交試驗優(yōu)化

表3　正交試驗分析培養(yǎng)基成分對菌株Alg07產(chǎn)酶的影響Table 3 Orthogonal array analysis of the effect of different medium components on enzyme production

在用單因素優(yōu)化氮源的試驗中由于菌株Alg07只有在蛋白胨與酵母粉共同存在時，菌株生長較好，發(fā)酵上清液酶活力較高，但單因素試驗無法確定蛋白胨與酵母粉的最佳組合質(zhì)量濃度。另外，培養(yǎng)基中各種成分可能存在相互作用，導致MgSO4·7H2O、KCl對產(chǎn)酶的影響并沒有很強的規(guī)律性，但不添加這兩種無機鹽又導致菌株產(chǎn)酶量較低。所以，設(shè)計正交試驗確定蛋白胨與酵母粉的最佳組合，及最佳的產(chǎn)酶MgSO4·7H2O、KCl質(zhì)量濃度。由表3可知，菌株Alg07發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)條件為：A2B1C2D1E3F3G2。即海藻酸鈉質(zhì)量濃度為9 g/L、蛋白胨質(zhì)量濃度為1 g/L、酵母粉質(zhì)量濃度為3 g/L、NaCl質(zhì)量濃度為5 g/L、MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度為5 g/L、KCl質(zhì)量濃度為5 g/L、CaCl2質(zhì)量濃度為4 g/L。按照極差的大小可以決定因素的主次順序為：B＞G＞F＞A＞C＞E＞D。因此，B為影響菌株產(chǎn)酶活力的主要因素，即蛋白胨質(zhì)量濃度對菌株產(chǎn)酶的影響最為顯著，由表3可知，氮源的最佳組合質(zhì)量濃度為蛋白胨1 g/L、酵母粉3 g/L。表3還顯示，CaCl2質(zhì)量濃度對菌株產(chǎn)酶的影響僅次于蛋白胨，不同質(zhì)量濃度的NaCl、MgSO4·7H2O對菌株產(chǎn)酶的影響很小，且無明顯的規(guī)律性，與單因素試驗所得結(jié)果相符，選擇5 g/L的NaCl和1 g/L的MgSO4·7H2O，進入下一步試驗。

2.3.5培養(yǎng)條件對菌株Alg07產(chǎn)酶的影響

以上述優(yōu)化的培養(yǎng)基成分制備發(fā)酵培養(yǎng)基，考察了培養(yǎng)溫度、初始發(fā)酵pH值、接種量、裝液量對菌株Alg07產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖5所示。當培養(yǎng)溫度低于20 ℃時，菌體生物量和產(chǎn)酶量都較低。培養(yǎng)溫度在20～30 ℃時，酶活力較高，且無明顯差異，當培養(yǎng)溫度高于30 ℃時，菌體生物量無明顯降低，但酶活力降低迅速?？紤]到實際生產(chǎn)過程中培養(yǎng)溫度過低難以控制，因此培養(yǎng)溫度選擇30 ℃（圖5A）。由圖5B可知，培養(yǎng)基的初始pH值對菌體生物量幾乎沒有影響，對菌體產(chǎn)酶影響也不太顯著，當發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為6.5時，菌株產(chǎn)酶達到最大值。

進一步對接種量進行考察，結(jié)果表明當接種量為0.5%以下時，菌體生物量與產(chǎn)酶均較低，接種量高于0.5%時，菌種的產(chǎn)酶量相差不大，因此接種量選擇0.5%（圖5C）。在考察溶氧條件對產(chǎn)酶影響時，結(jié)果顯示在250 mL三角瓶裝液量小于40 mL，菌株Alg07產(chǎn)酶量較高，說明該菌是好氧菌，提高溶氧有利于菌體生長與酶的合成。但由于培養(yǎng)基量過少，可能會使細菌過早進入衰亡期，而且隨著發(fā)酵時間的延長，最后剩下的發(fā)酵液會很少，所以選擇了40 mL裝液量（圖5D）。

圖5　培養(yǎng)條件對菌株Alg07產(chǎn)酶的影響Fig.5 Influence of culture conditions on enzyme production

2.3.6菌株Alg07的發(fā)酵產(chǎn)酶曲線

以優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分與培養(yǎng)條件發(fā)酵培養(yǎng)菌株Alg07，測定不同發(fā)酵時間的菌體生物量與發(fā)酵上清液酶活力，結(jié)果如圖6所示。

圖6　培養(yǎng)時間對菌株Alg07產(chǎn)酶的影響Fig.6 Influence of culture time on enzyme production

由圖6可知，菌株Alg07在16 h生物量即達到最大值，24 h發(fā)酵上清液酶活力最高，為563 U/mL。菌體的產(chǎn)酶比菌體生長略微滯后，可見是菌體生長后，褐藻酸鈉再誘導其產(chǎn)酶，同時，也證明了菌株Alg07所產(chǎn)褐藻膠裂解酶是誘導酶。當酶活力達到最高值后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，發(fā)酵上清液酶活力并沒有顯著的下降，可能是該酶穩(wěn)定性較好導致的。目前已報道的產(chǎn)褐藻膠裂解酶細菌主要來源于假單胞菌［19］、弧菌［20］、產(chǎn)黃菌屬［13］等。關(guān)于芽孢桿菌產(chǎn)褐藻膠裂解酶的報道則較少，1984年，Hansen等［21］首次從土壤和海水中分離出一株產(chǎn)褐藻膠裂解酶的芽孢桿菌JBH2，為革蘭氏陽性細菌，好氧，褐藻膠裂解酶在對數(shù)生長期出現(xiàn)合成的高峰期，發(fā)酵培養(yǎng)48 h其酶活力僅有8.0 U/mL。2010年，劉玉佩等［22］利用響應面法對解淀粉芽孢桿菌生產(chǎn)褐藻膠裂解酶的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，在最優(yōu)的發(fā)酵條件下，發(fā)酵培養(yǎng)42 h，理論酶活力為6.48 U/mL。之后，他們對產(chǎn)褐藻膠裂解酶的基因進行了異源表達［23］，使酶活力提高到了21 U/mL。Masayuki等［24］從海洋沉淀物中發(fā)現(xiàn)一株能夠降解海帶的Microbulbifer sp. 6532A，培養(yǎng)2 d以后，其褐藻膠裂解酶活力達114.8 U/mL。Li Weijian等［25］篩出Pseudoalteromonas sp. SM0524，產(chǎn)酶條件優(yōu)化后，發(fā)酵周期60 h，酶活力達到62.6 U/mL。An Qingda等［26］從巨藻中篩選出Flavobacterium sp. LXA，培養(yǎng)溫度30 ℃，培養(yǎng)時間32 h，酶活力達到30.1 U/mL。

本研究獲得的菌株Alg07發(fā)酵溫度為30 ℃，發(fā)酵周期24 h，酶活力為563 U/mL。與菌株JBH2［21］、6532A［24］、SM0524［25］、LXA［26］相比具有酶活力高、發(fā)酵周期短等優(yōu)點?？蛇M一步將對菌株Alg07產(chǎn)生的褐藻膠裂解酶進行分離純化并進行酶學性質(zhì)研究，通過克隆褐藻膠裂解酶的基因?qū)崿F(xiàn)其異源表達或者通過菌種誘變的方式繼續(xù)提高產(chǎn)酶量，實現(xiàn)褐藻膠裂解酶的工業(yè)化生產(chǎn)。

3　結(jié) 論

從養(yǎng)殖場腐爛海帶中篩選到一株新型的高產(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌株Alg07。依據(jù)菌體形態(tài)、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析，鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus），命名為Bacillus weihaiensis Alg07。通過單因素試驗和正交試驗，確定菌株Alg07的最佳發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基成分：褐藻酸鈉 9 g/L、蛋白胨1 g/L、酵母粉3 g/L、NaCl 5 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、KCl 5 g/L、CaCl24 g/L；最佳發(fā)酵產(chǎn)酶條件為：裝液量40 mL/250 mL、培養(yǎng)溫度30 ℃、初始發(fā)酵pH 6.5、接種量0.5%、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、培養(yǎng)時間24 h。在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下，褐藻膠裂解酶活力由35 U/mL提高到563 U/mL。菌株Alg07生產(chǎn)褐藻膠裂解酶具有酶活力高、發(fā)酵周期短等諸多優(yōu)點，是一株新型的極具潛力的褐藻膠裂解酶生產(chǎn)菌株。

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Screening and Identification of a Bacterial Stra in and Optimization of Medium Composition and Culture Conditions for the Production of Alginate Lyase

CHEN Peng1，2， ZHU Yueming2， HAN Wenjia1，2， MEN Yan2， JIA Shiru1， SUN Yuanxia2，*
（1. College of Biotechnology， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin 300457， China；2. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology， Chinese Academy of Sciences， Tianjin 300308， China）

A highly efficient alginate-degrading microorganism was isolated from rotten seaweed through several cycles of enrichment and domestication in liquid medium containing alginate as the sole carbon source. According to morphological，physiological characteristics and 16S rRNA gene sequence analysis， the strain was iden tified as Bacillus weihaiensis Alg07. Based on the results of single factor experiments and orthogonal array experiments， the optimal liquid fermentation medium contained 9 g/L of alginate， 1 g/L of peptone， 3 g/L of yeast exact， 5 g/L of NaCl， 1 g/L of MgSO4·7H2O， 5 g/L of KCl and 4 g/L of CaCl2. The strain was cultured at 30 ℃， pH 6.5 and 180 r/min for 24 h in 40 mL of the medium using a 250-mL flask， and the inoculum concentration was 0.5% （V/V）. Under these optimal conditions， the activity of alginate lyase was significantly increased from 35 U/mL to 563 U/mL， indicating a 16-fold increase compared with that before optimization.

alginate lyase； screening； identification； Bacillus； fermentation optimization

TS254.4

A

1002-6630（2015）15-0105-07

10.7506/spkx1002-6630-201515020

2014-09-17

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2013AA102105）；中國科學院重點部署項目（KSZD-EW-Z-019）

陳朋（1988—），男，碩士研究生，研究方向為酶工程。E-mail：864724133@qq.com

孫媛霞（1963—），女，研究員，博士，研究方向為功能糖與天然活性物質(zhì)。E-mail：syx0430@hotmail.com