3種藥用石斛多糖的抗氧化活性比較研究

王再花， 章金輝， 李　杰， 徐曄春， 朱根發(fā)， 葉慶生

(1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所，廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新綜合利用重點實驗室， 廣州 510640；2.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室，廣州 510631)

3種藥用石斛多糖的抗氧化活性比較研究

王再花1,2， 章金輝1， 李杰1， 徐曄春1， 朱根發(fā)1， 葉慶生2*

(1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所，廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新綜合利用重點實驗室， 廣州 510640；2.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室，廣州 510631)

石斛； 多糖； 抗氧化活性

1　材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)、大苞鞘石斛(Dendrobiumwardianum)和金釵石斛(Dendrobiumnobile)，均采于云南，栽培于溫室大棚內(nèi).取成熟未開花石斛莖若干，切成小段，蒸餾水洗凈，105 ℃殺青15 min，60 ℃烘干至恒質(zhì)量，粉碎成粉末后過0.25 mm篩，置于干燥器備用. 抗壞血酸(Vitamin c:Vc)從中國標準物質(zhì)網(wǎng)訂購，為純品標準品，產(chǎn)品編號BW4032.

1.2試驗方法

1.2.1多糖的純化與分級參考Sun 等[20]的方法進行3種石斛多糖的提取、純化和分級.分別稱取3種石斛粉末50 g，加石油醚500 mL，80 ℃回流提取，抽濾，所得濾渣再加500 mL 80%的乙醇水溶液80 ℃回流提取，抽濾，濾渣于60 ℃烘干保存，即得3種石斛的脫脂干粉.脫脂干粉經(jīng)500 mL蒸餾水80 ℃提取1 h，抽濾，收集濾液，重復(fù)1次，濾液經(jīng)減壓濃縮，再加預(yù)冷無水乙醇使溶液含醇量至80%，4 ℃靜置過夜，12 000 r/min離心，收集沉淀，冷凍干燥得鐵皮石斛、大苞鞘石斛和金釵石斛3種石斛粗多糖，分別命名為DOCP、DWCP和DNCP，與初始石斛粉末相比，得率分別為17.9%、24.3%和9.1%.

純化：將3種石斛粗多糖溶液稀釋成質(zhì)量濃度40 g/L，加入1 g/L 的胰蛋白酶72 mL(胰酶液和粗多糖溶液體積比為0.4∶1.0)，37 ℃恒溫處理5 h，升溫滅酶后，再用Sevag-去蛋白法萃取上述溶液3次，收集上層水相，所得多糖液裝入透析袋(截留相對分子量為7.5×103)中，蒸餾水透析72 h，加入預(yù)冷無水乙醇使溶液含醇量至80%，4 ℃靜置過夜，12 000 r/min離心，收集沉淀，真空冷凍干燥，即得鐵皮石斛、大苞鞘石斛、金釵石斛精多糖，分別命名為DOPP、DWPP和DNPP，與初始石斛粉末相比，得率分別為9.6%、14.1%和4.1%.

分級：選用DEAE-52層析柱(2.6 cm×50 cm)對精多糖進行分級，適量蒸餾水洗脫后，再用0.3 mol/L NaCl進行洗脫，洗脫速度控制在1 mL/min，部分收集器的轉(zhuǎn)速為8 mL/管，得到洗脫曲線，合并主峰，凍干得到鐵皮石斛、大苞鞘石斛和金釵石斛的多糖組分，分別命名為DOPP-I、DWPP-I和DNPP-I.

1.2.2DPPH·自由基清除率測定將3種石斛的粗多糖、精多糖和水溶性多糖均配成2 g/L的母液，再用雙蒸水再稀釋成6種質(zhì)量濃度: 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/L，以Vc(vitamin c)為對照品.參考Fan等[6]的方法測定上述多糖對DPPH·自由基的清除率.

1.2.3羥基自由基(·OH)清除率測定參考Fan等[6]的方法測定3種石斛的粗多糖、精多糖和多糖組分對·OH自由基的清除率.

1.2.5 數(shù)據(jù)分析試驗均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)整理采用Excel 2007軟件，方差分析采用SAS 8.1軟件.

2　結(jié)果與分析

2.1石斛多糖的純化與分級

本試驗采用了石油醚、80%乙醇脫脂脫色得鐵皮石斛、大苞鞘石斛和金釵石斛3種石斛粗多糖，分別命名為DOCP、DWCP和DNCP. 再經(jīng)sevag-胰蛋白酶脫蛋白得到鐵皮石斛、大苞鞘石斛和金釵石斛3種石斛精多糖，分別命名為DOPP、DWPP和DNPP. 最后采用DEAE-Cellulose-52離子交換層析法分級，用蒸餾水洗脫時，3種石斛都有大量的多糖被洗脫下來，而0.3 mol/mL NaCl洗脫時3種石斛均只有一個較小的多糖洗脫峰，可見，3種石斛的水洗多糖占精多糖的絕大部分(圖1)，考慮中藥的熬制主要以水為溶劑(簡稱DH)，因此，本試驗對水洗多糖組分進一步純化，分別合并3個樣品的蒸餾水洗洗脫峰，經(jīng)減壓濃縮，脫鹽，真空冷凍干燥后得到3種石斛的多糖組分,分別命名為DOPP-I、DWPP-I和DNPP-I，NaCl洗脫多糖組分，分別命名為DOPP-II、DWPP-II和DNPP-II.

圖1鐵皮石斛(A)、大苞鞘石斛(B)和金釵石斛精多糖(C)的DEAE-Cellulose-52離子交換層析

Figure 1Seperation of DOPP (A), DWPP (B) and DNPP (C) by DEAE-Cellulose-52 column chromatograph

2.23種石斛多糖對DPPH·的清除力

3種石斛多糖組對DPPH·自由基清除能力的變化趨勢一致(圖2)，隨著質(zhì)量濃度的增加清除率顯著增強，具有一定的質(zhì)量濃度效應(yīng)，其中多糖組分DOPP-I、DWPP-I和DNPP-I的清除效果最佳，顯著高于對照組Vc.3種石斛多糖組分對DPPH·自由基的清除能力(清除率33.8%～35.3%)從質(zhì)量濃度0.4 g/L起就顯著優(yōu)于同等質(zhì)量濃度的Vc(31.8%～33.4%)、粗多糖(28.7%～28.9%)與精多糖(31.1%～32.6%)，且在1.2 g/L時清除能力達到最大，鐵皮石斛多糖組清除能力大小依次為DOPP-I(77.1%)>Vc(66.1%)>DOPP(64.7%)>DOCP(63.5%)，大苞鞘石斛多糖組清除能力則為DWPP-I(76.9%)>Vc(66.2 %)>DWPP(64.8%)>DWCP(63.6%)，而金釵石斛多糖組清除能力則為DNPP-I(76.5%)>Vc(66.6%)>DNPP(63.7%)>DNCP(62.3%).

2.33種石斛多糖對·OH的清除力

3種石斛多糖對·OH自由基清除率的變化趨勢相同(圖3)，均顯著高于Vc對照組，均隨著質(zhì)量濃度的增加，清除率不斷增強，具質(zhì)量濃度效應(yīng).3種石斛多糖組分對·OH自由基的清除能力(39.4%～40.2%)從0.2 g/L起就顯著高于同等質(zhì)量濃度的Vc對照組(26.0%～26.9%)、粗多糖(30.5%)與精多糖(33.2%～34.3%)，且在1.2 g/L時達到最大，鐵皮石斛多糖對·OH自由基清除能力從大至小依次為DOPP-I(85.2%)>DOPP(81.7%)>DOCP(79.8%)>Vc(79.5%)，大苞鞘石斛多糖則為DWPP-I(84.6%)>DWPP(81.6%)>DWCP(80.3%)>Vc(79.3%)，而金釵石斛多糖則為DNPP-I(84.2%)>DNPP(81.6%)>DNCP(80.6%)>Vc(79.7%).

2.5不同石斛多糖組分對同種自由基的清除力

圖2鐵皮石斛(A)、大苞鞘石斛(B)和金釵石斛多糖(C)質(zhì)量濃度對DPPH·自由基的清除效果

Figure 2Scavenging activities of the polysaccharides fromD.officinale(A),D.wardianum(B) andD.nobile(C) on the content of DPPH· radicals

圖3　鐵皮石斛(A)、大苞鞘石斛(B)和金釵石斛多糖(C)質(zhì)量濃度對·OH自由基的清除效果

Figure 3Scavenging activities of the polysaccharides fromD.officinale(A),D.wardianum(B) andD.nobile(C) on the content of ·OH radicals

圖4　鐵皮石斛(A)、大苞鞘石斛(B)和金釵石斛多糖(C)質(zhì)量濃度對的清除效果

注：小寫英文字母表示不同多糖組分對同種自由基清除率的差異顯著性(P<0.05).

3　討論

4　結(jié)論

抗氧化活性研究表明，石斛多糖的純度越高，活性越大，呈現(xiàn)多糖組分>精多糖>粗多糖的趨勢，同時，多糖質(zhì)量濃度越高，抗氧化效果越強.在抗超氧陰離子方面，大苞鞘石斛優(yōu)于鐵皮石斛，抗DPPH·自由基方面與鐵皮石斛相近，但均優(yōu)于金釵石斛.因此，本研究認為與傳統(tǒng)藥用石斛鐵皮石斛和金釵石斛相比，大苞鞘石斛在人工栽培管理、多糖含量和產(chǎn)出方面具有一定的優(yōu)勢，其抗氧化等藥理活性具有較好的應(yīng)用前景.

[1]Luo A X, He X J, Zhou S D, et al.Invitroantioxidant activities of a water-soluble polysaccharide derived fromDendrobiumnobileLindl. extracts[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2009, 45:359-363.

[2]Wang S, Wei F J, Cai Y P, et al. Anti-oxidation activityinvitroof polysaccharides ofDendrobiumhuoshaneseandDendrobiummoniliforme[J]. Agricultual Science and Technology, 2009, 10(6):121-124.

[3]Tian C C, Zha X Q, Pan L H, et al. Structural characterization and antioxidant activity of a low-molecular polysaccharide fromDendrobiumhuoshanense[J]. Fitoterapia, 2013, 91:247-255.

[4]Zhao Y P, Son Y O, Kim S S, et al. Antioxidant and antihyperglycemic activity of polysaccharide isolated fromDendrobiumchrysotoxumLindl.[J]. Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 2007,40(5):670-677.

[5]文小玲, 徐俊駒, 陳麗君, 等. 云南藥用植物束花石斛提取物的體外抗氧化活性研究[J]. 昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2014, 35(4):4-5.

Wen X L，Xu J J，Chen L J, et al. Antioxidant activityinvitroofDendrobiumchrysanthumWall in Yunnan[J]. Journal of Kunming Medical University, 2014, 35(4):4-5.

[6]Fan Y J, He X J, Zhou S D, et al. Composition analysis and antioxidant activity of polysaccharide fromDendrobiumdenneanum[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2009, 45:169-173.

[7]章金輝,張愉,劉海林,等.四種石斛不同器官的多糖含量比較分析[C]∥ 中國觀賞園藝研究進展, 2014： 471-474.

Zhang J H, Zhang Y, Liu H L, et al. Comparative analysis of different organs polysaccharide contents of four species ofDendrobium[C]∥Advances in Ornamental Horticulture of China, 2014: 471-474.

[8]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典:第二部[M]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2010：85-87；265-266.

[9]Xia L J, Liu X F, Guo H Y, et al. Partial characterization and immunomodulatory activity of polysaccharides from the stem ofDendrobiumofficinale(Tiepishihu)invitro[J]. Journal of Functional Foods, 2012, 4:294-301.

[10]Luo A X, Fan Y J. Immune stimulating activity of water-soluble polysaccharide fractions fromDendrobiumnobileLindl.[J]. African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2011, 5(5): 625-631.

[11]Wang J H, Luo J P, Zha X Q, et al. Comparison of antitumor activities of different polysaccharide fractions from the stems ofDendrobiumnobileLindl.[J]. Carbohydrate Polymers, 2010, 79:114-118.

[12]李菲, 黃琦, 李向陽, 等. 金釵石斛提取物對腎上腺素所致血糖升高的影響[J]. 遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2008, 31(1):11-12.

Li F, Huang Q, Li X Y, et al. Effects of the extr acts fromDendrobiumnobilelindl. on bloodsugar in normal and hyperglycemic mice[J]. Acta Academiae Medicinae Zunyi, 2008, 31(1):11-12.

[13]Pan L H, Li X F, Wang M N, et al. Comparison of hypoglycemic and antioxidative effects of polysaccharides from four differentDendrobiumspecies[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2014(64):420-427.

[14]李安華, 周志宏, 沈妍, 等. 大苞鞘石斛化學(xué)成分研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2012,24(4):479-480.

Li A H, Zhou Z H, Shen Y, et al. Chemical constituents from stem ofdendrobiumwardianum[J]. Natural Product Research and Development, 2012, 24(4):479-480.

[15]Fan W W, Xu F Q, Dong F W, et al. Dendrowardols A and B, two new sesquiterpenoids fromDendrobiumwardianumWarner[J]. Tetrahedron Letters, 2013, 54:1928-1930.

[16]王偉, 黃衛(wèi)昌, 金荷仙, 等. 大苞鞘石斛的離體培養(yǎng)與快速繁殖[J]. 植物生理學(xué)通訊, 2008, 44(5):959-960.

Wang W, Huang W C, Jin H X, et al.Invitroculture and rapid propagation ofDendrobiumwardianumWarner[J]. Plant Physiology Communications, 2008, 44(5):959-960.

[17]王偉, 靳曉翠, 金荷仙, 等. 大苞鞘石斛(Dendrobiumwardianum)種子離體萌發(fā)培養(yǎng)[J]. 種子, 2011, 30(4):45-49.

Wang W，Jin X C，Jin H X, et al. Study on vitro germination ofDendrobiumwardianum[J]. Seed, 2011, 30(4):45-49.

[18]劉曉東, 李曉丹, 吳元玲, 等. 大苞鞘石斛原球莖超低溫保存中生理生化變化[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2013, 41(7):79-84.

Liu X D, Li X D, Wu Y L, et al. Physilogical and biochemical characteristics ofDendrobiumwardianumprotocorms during cryopreservation[J]. Journal of Northeast Forestry University, 2013, 41(7):79-84.

[19]吳元玲, 申曉輝. 大苞鞘石斛原球莖玻璃化超低溫保存技術(shù)的研究[J]. 中國細胞生物學(xué)學(xué)報, 2011,33(3):279-287.

Wu Y L, Shen X H. Cryopreservation ofDendrobiumwardianumWarner. potocorms by vitrfication[J].Chinese Journal of Cell Biology,2011,33(3):279-287.

[20]Sun Y D, Wang Z H, Ye Q S. Composition analysis and anti-proliferation activity of polysaccharides fromDendrobiumchrysotoxum[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2013, 62:291-295.

[21]張澤慶，田應(yīng)娟，張靜．防風多糖的抗氧化活性研究[J]. 中藥材, 2008, 31(2): 268-272.

Zhang Z Q, Tian Y J, Zhang J. Studies on the antioxidative activity of polysaccharides fromRadixSaposhnikoviae[J]. Journal of Chinese Medicinal Materials, 2008, 31(2): 268-272.

[22]Luo A X, He X J, Zhou S D, et al. Purification, composition analysis and antioxidant activity of the polysaccharides fromDendrobiumnobileLindl.[J]. Carbohydrate Polymers, 2010, 4(79): 1014-1019.

[23]鮑素華, 查學(xué)強, 郝杰, 等. 不同分子量鐵皮石斛多糖體外抗氧化活性研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(21):123-127.

Bao S H，Zha X Q，Hao J, et al.Invitroantioxidant activity of polysaccharides with different molecular weights fromDendrobiumcandidum[J].Food Science, 2009, 30(21):123-127.

【中文責編：成文英文責編：李海航】

Comparison of Antioxidant Activity of the Polysaccharides from Three Dendrobium Species

Wang Zaihua1,2, Zhang Jinhui1, Li Jie1, Xu Yechun1, Zhu Genfa1, Ye Qingsheng2*

(1. Environmental Horticulture Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences; Guangdong Provincial Key Lab of Ornamental Plant Germplasm Innovation and Utilization, Guangzhou 510640, China; 2. School of Life Science,South China Normal University; Guangdong Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development, Guangzhou 510631, China)

Dendrobium; polysaccharides; antioxidant activity

2015-04-15《華南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

廣東省科技計劃項目(2012B080701006)；廣東省農(nóng)業(yè)建設(shè)與改革發(fā)展專項項目 (粵農(nóng)計〔2012〕138號) ；廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長基金項目(201417)

葉慶生，教授，Email：ye-lab@scnu.edu.cn.

S682.31

A

1000-5463(2015)05-0065-06