組合培養(yǎng)下Hep-2對(duì)EPCs的影響

賴怡　張怡　劉肖珩★　曾燁　吳江

·基礎(chǔ)研究·

組合培養(yǎng)下Hep-2對(duì)EPCs的影響

賴怡張怡劉肖珩★曾燁吳江

目的 探討喉鱗癌細(xì)胞與內(nèi)皮祖細(xì)胞組合培養(yǎng)后對(duì)兩種細(xì)胞的影響。方法 在組合培養(yǎng)后，觀察內(nèi)皮祖細(xì)胞的細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期以及成血管能力變化。通過免疫組化檢測細(xì)胞表面分子標(biāo)注物的變化。結(jié)果 在與喉鱗癌細(xì)胞組合培養(yǎng)后，內(nèi)皮祖細(xì)胞的細(xì)胞增殖和凋亡均增加，上調(diào)細(xì)胞表面標(biāo)志物。喉鱗癌細(xì)胞Fascin-1表達(dá)上調(diào)，內(nèi)皮祖細(xì)胞的成血管能力加強(qiáng)。結(jié)論 內(nèi)皮祖細(xì)胞與喉鱗癌細(xì)胞組合培養(yǎng)可以導(dǎo)致細(xì)胞生物學(xué)特性和成血管能力的變化，從而促進(jìn)腫瘤血管生成。

Fascin-1 組合培養(yǎng) 喉鱗癌細(xì)胞 內(nèi)皮祖細(xì)胞 腫瘤血管生成

喉鱗癌是一種常見的頭頸部惡性癌癥，在大部分病例中治療療效較差［1］。腫瘤微環(huán)境，能夠促進(jìn)血管和細(xì)胞外基質(zhì)生成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的遷移，研究透徹其相關(guān)因素將有助于腫瘤治療［2］。循環(huán)祖細(xì)胞如內(nèi)皮祖細(xì)胞［3］、胚胎祖細(xì)胞均參與內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的新生血管形成過程中。作者自2011年1月至6月采用喉鱗癌細(xì)胞（Hep-2）與內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCS）組合培養(yǎng)后，觀察內(nèi)皮祖細(xì)胞在組合培養(yǎng)后細(xì)胞生物特性和細(xì)胞成血管、遷移能力的變化，探討EPCs對(duì)腫瘤血管新生的作用和在抗癌治療中的潛在作用。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Beagle實(shí)驗(yàn)用犬，雌性，成年，四川大學(xué)華西醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2主 要 試 劑 Transwell小 室（Costar，USA）；EBM-2培養(yǎng)液（Lonza，USA）；MPA、淋巴細(xì)胞分離液，均購自Sigma USA。CD34、CD133、VWF、VEGR-2購自Santa Cruz USA。

1.3EPCs的分離培養(yǎng)和鑒定 無菌抽取犬骨髓5ml，肝素抗凝，置于淋巴細(xì)胞分離液（1.077）上，密度梯度離心（2113r/min，25min）。吸出離心后的單個(gè)核細(xì)胞層，PBS洗滌兩次（1494r/min，10 min），以EBM-2重懸細(xì)胞，接種于FN預(yù)包被的培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)。4d后首次換液，以后換液1次/3d，待細(xì)胞長至90%匯合后傳代并檢測其表面標(biāo)志因子CD34、CD133、VWF。本實(shí)驗(yàn)采用3～5代細(xì)胞。

1.4細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡檢測 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞加入96孔（2.5×103/孔）板中，檢測EBM-2培養(yǎng)基和M199（10%胎牛血清）培養(yǎng)液情況下細(xì)胞增殖情況。MTT法測定吸光度值（OD），連續(xù)7d，繪制EPCs的生長曲線。EPCs細(xì)胞以5×105/孔接種于6孔板中，48h后收集細(xì)胞，70%冰乙醇固定后加入碘化丙醇（PI）染色，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期和凋亡率。

1.5Transwell組合培養(yǎng) 在上室或下室分別接種Hep-2 或 EPCs，在各自生長融合后，進(jìn)行組合培養(yǎng)。設(shè)置對(duì)照組，組合培養(yǎng)后分別進(jìn)行免疫組化、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡及體外血管形成實(shí)驗(yàn)。

1.6體外血管生成實(shí)驗(yàn) Matrigel （100 μl） 接種到24孔板中，在37℃ 孵化30 min 。EPCs 細(xì)胞消化重懸后，加至鋪設(shè)Matrigel的孔板中。在不同時(shí)間段觀測評(píng)價(jià)血管形成情況，評(píng)價(jià)顯微鏡下三個(gè)隨機(jī)區(qū)域毛細(xì)血管樣管狀結(jié)構(gòu)的數(shù)量。

1.7細(xì)胞遷移試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞4×104/孔接種于Transwell上室中。置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h。用棉簽小心刮除未遷移過膜的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定20 min，0.2%結(jié)晶紫染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察，隨機(jī)取10個(gè)視野計(jì)數(shù)遷移過膜的細(xì)胞。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料均以（x±s）表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1喉鱗癌組織、臍帶及內(nèi)皮細(xì)胞免疫組化情況 見圖1。

圖1　喉鱗癌組織、臍帶及內(nèi)皮細(xì)胞免疫組化情況

2.2EPCs細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及其生物學(xué)特性（1）倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況：剛分離的細(xì)胞多呈圓形，周圍有較多血細(xì)胞，較難分辨出 EPCs，在各種內(nèi)皮系生長因子的作用下，隨培養(yǎng)天數(shù)增加，在培養(yǎng)瓶中的貼壁細(xì)胞形態(tài)開始出現(xiàn)改變，形成內(nèi)皮樣細(xì)胞，按照條索狀分布，逐漸形成集落，從而細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)增長期（見圖2A）。（2）細(xì)胞鑒定：免疫細(xì)胞化學(xué)的結(jié)果，表明所分離的細(xì)胞表達(dá)CD133、CD34、VEGFR-2。EPCs可攝取乙酰化低密度脂蛋白（ac-LDL）并與荊豆凝集素－1（UEA-1）反應(yīng)（見圖2B）。用紅色熒光標(biāo)記的是 DiI-acLDL，用綠色熒光表示 FITCUEA-1 染色情況。分離出來的細(xì)胞均表達(dá)這兩種蛋白，為正在分化的EPCs（見圖2C）［4］。（3）MTT法繪制細(xì)胞生長曲線：若僅在M119中添加VEGF等一系列生長因子，EPCs從2 d起較采用EBM-2培養(yǎng)的細(xì)胞生長明顯落后。盡管生長明顯減緩，但各組細(xì)胞仍可以在5d達(dá)到生長的高峰期，在此后的時(shí)間內(nèi)，生長速度開始逐漸下降。細(xì)胞接種密度同樣也可以影響細(xì)胞成長情況。當(dāng)EPCs接種密度為105，在同等情況下（M199或EBM-2），細(xì)胞生長均顯著高于接種密度為104的細(xì)胞。值得關(guān)注的是，接種密度為104且采用EBM-2培養(yǎng)的EPCs，可以見到在5d后，細(xì)胞均數(shù)仍在增長（見圖2D）。（4）體外血管生成：顯示細(xì)胞接種不同時(shí)間后，體外血管形成的情況。接種后0 h，細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)液中，分布較均勻接種。＞1h，細(xì)胞形態(tài)無明顯變化。接種＞2h，在Matrigel不同層面，逐漸貼壁，向周圍延伸，細(xì)胞間形成連接。接種＞4h，可有血管網(wǎng)絡(luò)的形成。接種8h后，細(xì)胞相互接觸更為顯著，逐漸形成小的血管分支。接種＞12h后，Matrigel各層均有管狀連接形成，可認(rèn)為EPCs形成血管的能力較強(qiáng)，并在三維空間上生長并延伸（見圖2E）。

圖2　EPCs細(xì)胞生物學(xué)特性檢測

2.3組合培養(yǎng)后EPCs和Hep-2細(xì)胞的生物學(xué)特性變化。（1） 組合培養(yǎng)后EPCs和Hep-2細(xì)胞形態(tài)的變化：組合培養(yǎng)1 d后，EPCs 的細(xì)胞形態(tài)較之前有明顯變化，細(xì)胞變得細(xì)長，胞漿減少，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，EPCs 的形態(tài)繼續(xù)變化，胞漿持續(xù)減少，至組合培養(yǎng)第4 d，細(xì)胞形態(tài)變化最為顯著。Hep-2 細(xì)胞的變化較之前并無顯著性變化（圖3A）。（2） 組合培養(yǎng)后EPCs和Hep-2細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的變化：組合培養(yǎng)后 EPCs的 PI 較單獨(dú)培養(yǎng)的EPCs 有顯著性增高（P＜0.05）；組合培養(yǎng)后 Hep-2 的 PI 較單獨(dú)培養(yǎng)的Hep-2的PI有顯著性增高（P＜0.01）。以上結(jié)果表明，在組合培養(yǎng)后，EPCs、Hep-2 兩種細(xì)胞增殖均明顯增加，Hep-2 的增殖更為顯著。組合培養(yǎng)后 EPCs 的 AI 較單獨(dú)培養(yǎng)的 EPCs 有顯著性增高（P＜0.01）；同時(shí)，組合培養(yǎng)后 Hep-2 的 AI 較單獨(dú)培養(yǎng)的 Hep-2 的 AI 有顯著增高（P＜0.01）。以上結(jié)果表明，在組合培養(yǎng)后，EPCs、Hep-2 兩種細(xì)胞發(fā)生凋亡明顯增加，Hep-2 的凋亡更為顯著。（3）組合培養(yǎng)后EPCs和Hep-2細(xì)胞表面標(biāo)志物的變化：在組合培養(yǎng)后EPCs表面標(biāo)志物發(fā)生變化：CD133的表達(dá)略有減弱，而CD 34和VEGFR-2的表達(dá)增強(qiáng)。組合培養(yǎng)后Hep-2中Fascin-1的表達(dá)較之前顯著增加（P＜0.01），意味著組合培養(yǎng)可上調(diào)Fascin-1的表達(dá)。（4）組合培養(yǎng)后EPCs體外血管生成情況變化：在接種4 h后，細(xì)胞間開始出現(xiàn)連接趨勢；在5 h，細(xì)胞開始逐漸形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；到7 h可見這些細(xì)胞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且并不局限于一個(gè)層面，而是在多個(gè)層次上延伸；到8 h血管結(jié)構(gòu)已經(jīng)非常明顯。

3　討論

Fascin 是一種關(guān)鍵的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，結(jié)合粘附在絲狀偽足上。Fascin在較多腫瘤中表達(dá)增高如乳腺癌、肺癌、子宮癌等，并引起腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，主要是源于對(duì)膜突起和遷移特性的加強(qiáng)［5，6］。研究表明，F(xiàn)ansin-1在喉鱗癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中起著重要作用［7］。喉鱗癌組織切片結(jié)果表明，F(xiàn)ascin-1的表達(dá)與喉鱗癌分化程度有關(guān)。Fascin-1可能會(huì)在喉鱗癌的腫瘤微環(huán)境的形成及發(fā)展過程中發(fā)揮作用。因此，有必要研究Hep-2 與EPCs組合培養(yǎng)后，兩種細(xì)胞生物學(xué)特性以及 Fascin-1 表達(dá)的變化。

組合培養(yǎng)3 d之后，EPCs的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著改變，而Hep-2在整個(gè)過程中變化不大。因此采用組合培養(yǎng)3 d后的EPCs和Hep-2用于實(shí)驗(yàn)。EPCs 具有體外成血管能力，在接種4 h后開始出現(xiàn)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在后續(xù)時(shí)間內(nèi)逐漸增強(qiáng)連接，并在凝膠各層形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，12 h后細(xì)胞趨于融合。而組合培養(yǎng)后，EPCs的血管生成情況發(fā)生變化，一旦細(xì)胞接觸形成，迅速形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并在各個(gè)層面延伸。到8 h時(shí)，細(xì)胞已趨于融合。這意味著，組合培養(yǎng)可促進(jìn)EPCs 的成血管能力。

在EPCs和Hep-2組合培養(yǎng)后，PI和AI均較單獨(dú)培養(yǎng)組有顯著性差異，意味著組合培養(yǎng)可使兩種細(xì)胞的增殖和凋亡均增加。盡管組合培養(yǎng)可以同時(shí)影響細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡，但數(shù)據(jù)顯示，細(xì)胞凋亡的程度較細(xì)胞增殖程度更為顯著。

組合培養(yǎng)可導(dǎo)致EPCs細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)發(fā)生改變：CD133表達(dá)減弱，CD34和VEGFR-2表達(dá)增強(qiáng)，意味著組合培養(yǎng)可使EPCs從祖細(xì)胞向成熟內(nèi)皮細(xì)胞分化［8，9］?？赡苁怯捎诮M合培養(yǎng)過程中，Hep-2分泌相關(guān)因子影響EPCs的增殖、凋亡、細(xì)胞表面標(biāo)志物以及成血管能力。

組合培養(yǎng)后，Hep-2中Fascin-1的表達(dá)增強(qiáng)，即組合培養(yǎng)可使Hep-2侵襲性增強(qiáng)?？赡苁墙M合培養(yǎng)情況下，EPCs通過分泌相關(guān)因子對(duì)Hep-2產(chǎn)生影響。國內(nèi)研究結(jié)果表明，采用EPCs與其他細(xì)胞組合培養(yǎng)，有促進(jìn)其他細(xì)胞增殖的作用［10，11］，在使用VEGF抗體后將拮抗相關(guān)作用［12］。

本資料結(jié)果表明，F(xiàn)ascin-1可在高分化喉鱗癌、臍帶及內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)；EPCs與Hep-2組合培養(yǎng)可使兩種細(xì)胞增殖和凋亡增強(qiáng)；EPCs體外成血管能力增強(qiáng)；EPCs從祖細(xì)胞向成熟內(nèi)皮細(xì)胞分化，Hep-2中Fascin-1的表達(dá)增強(qiáng)。因此，EPCs和Hep-2組合培養(yǎng)后，可改變兩種細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)特性及Fascin-1的表達(dá)。因此，采用組合培養(yǎng)方式來分析Hep-2與EPCs在喉鱗癌發(fā)生發(fā)展中作用是切實(shí)可行的，為進(jìn)一步在組合培養(yǎng)系統(tǒng)中研究喉鱗癌血管生成和侵襲的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1Forastiere A， Koch W， Trotti A， et al. Head and neck cancer. N Engl J Med， 2001， 345（26）：1890～1900.

2Cooney MM， van Heeckerem W， Bhakta S，et al. Drug insight： vascular disrupting agents and angiogenesis-novel approaches for drug delivery. Nat Clin Prat Oncl，2006， 3（12）：682～692.

3Beckermann BM， Kallifatidis G， Groth A，et al. VEGF expression by mesenchymal stem cells contributes to angiogenesis in pancreatic carcinoma. Br J Cancer，2008，99（4）：622～631.

4Hamid B， Fardin F， Habibollah P， et al. Evaluating The Expression of Self-Renewal Genes in Human Endothelial Progenitor Cells. Cell J，2013， 14（4）：298～305 .

5Jeong HH， Christian A， Bodour S， et al.The Role of Fascin in the Migration and Invasiveness of Malignant Glioma Cells. Neoplasis，2008， 10（2）：149～159.

6Kulasinggam V， Diamandis EP. Fascin-1 is a novel biomarker of aggressiveness in some carcinomas. BMC Med，2013，11：53～55 .

7Zou J， Yang H， Chen H， et al. Prognostoc significance of fascin-1 and E-casherin expression in laryngeal squamous cell carcinoma. Eur J Cancer Pre v，2010，19（1）：11～17 .

8Christoph K， Haruchika M， Tomono T， et al. Transplantation of ex vivo expanded endothelial progenitor cells foe therapeutic neovascularization. PNAS，2000，97（7）：3422～3427.

9Mihail H， Wolfgang E， Peter CW. Endothelial Progenitor Cells Mobilization， Differentiation， and Homing.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2003，23（7）：1185～1189.

10杜公文，杜怡斌，張輝，等.組合培養(yǎng)下內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖及分化的影響.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，48（12）：1445～1449.

11慈維萍，劉文嫻，李鵬，等.晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)組合培養(yǎng)心肌細(xì)胞功能的影響.心肺血管病雜志，2012，31（3）：328～332.

12羅艷梅，梁志清，陳振波，等.內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3生物學(xué)功能的影響.實(shí)用婦產(chǎn)科雜志，2014，30（3）：191～195.

Aim In the present study，laryngeal squamous cell carcinoma cells were co-cultured with endothelial progenitor cells in transwell chamber experiments to investigate the infl uence of co-culture on both cell types. Methods After co-culturing，proliferation，apoptosis，cell cycle and tube formation by endothelial progenitor cells were measured. Changes in expression of cell surface markers and Fascin-1 were detected by immunocytochemistry. Results Both the proliferation and apoptosis indices increased in endothelial progenitor cells and laryngeal squamous cell carcinoma cells after co-culture. Co-culturing upregulated the expressions of endothelial progenitor cells surface markers. Fascin-1 expression in laryngeal squamous cell carcinoma cells was increased and the angiogenic capacity of EPCs was enhanced. Conclusion Co-culture of endothelial progenitor cells with laryngeal squamous cell carcinoma cells induces changes in biological characteristics and angiogenic capacity，thereby promoting tumor angiogenesis.

Fascin-1 Co-culture Laryngeal squamous cell carcinoma EPCs Tumor angiogenesis

國家自然科學(xué)基金No 81201477，10972148

610091成都市婦女兒童中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室（賴怡）610041 四川大學(xué)華西醫(yī)院西部婦幼研究院圍生醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室（張怡）610041四川大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程實(shí)驗(yàn)室（劉肖珩 曾燁 吳江）