交叉引物等溫擴(kuò)增檢測霍亂弧菌方法的建立

張霞，高琳，王淞，趙良娟，鄭文杰，王碩

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；2.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津300461）

交叉引物等溫擴(kuò)增檢測霍亂弧菌方法的建立

張霞1，2，高琳2，王淞2，趙良娟2，鄭文杰2，王碩1，*

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；2.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津300461）

建立食品中全血清型霍亂弧菌的交叉引物等溫擴(kuò)增檢測方法。針對霍亂弧菌設(shè)計特異性引物及探針，建立交叉引物等溫擴(kuò)增法，利用免疫金標(biāo)試紙條對結(jié)果進(jìn)行檢測。用57株霍亂弧菌及相近株細(xì)菌進(jìn)行特異性試驗(yàn)；通過定量DNA、純菌液計數(shù)、樣品中添菌檢測及與環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法進(jìn)行靈敏度驗(yàn)證及比較工作。結(jié)果表明，建立方法具有較好特異性；DNA檢測靈敏度為79.28 fg/test，增菌液檢測靈敏度為4.2×102CFU/mL，當(dāng)每25克樣品中有5.6 CFU菌時經(jīng)增菌步驟后即可檢出。建立的交叉引物恒溫檢測方法可作為食品中霍亂弧菌快速初篩檢測方法使用，較環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法靈敏且易于操作。

交叉引物等溫擴(kuò)增技術(shù)；霍亂弧菌；檢測

人類在飲食過程中，由于食用污染霍亂弧菌（Vibrio cholera）的食物，導(dǎo)致胃腸道紊亂，產(chǎn)生明顯的腹瀉、嘔吐等臨床癥狀。通常人們認(rèn)為O1與O139血清型的霍亂弧菌容易導(dǎo)致霍亂疾病的流行，而非O1和非O139的霍亂弧菌是普遍存在于河流、水域的正常菌群，不具有致病性，稱為非致病性霍亂弧菌［1］。但是，在近十幾年的研究中發(fā)現(xiàn)，非致病性霍亂弧菌也可導(dǎo)致胃腸炎、敗血癥及腦膜炎等疾?。?-3］。因此，針對食品中霍亂弧菌的檢測不應(yīng)僅局限于對O1和O139等致病性霍亂弧菌，還應(yīng)包括非致病性霍亂弧菌，即對于全血清型霍亂弧菌進(jìn)行檢測成為保障食品安全的必然。

目前對于霍亂弧菌的檢測主要有常規(guī)生化培養(yǎng)法、PCR方法、實(shí)時熒光PCR方法［4-8］及LAMP方法［9］等；常規(guī)生化培養(yǎng)方法作為檢測用金標(biāo)準(zhǔn)，檢測流程在3 d以上，可以對全血清型霍亂弧菌進(jìn)行檢測；目前分子生物學(xué)檢測方法主要針對mshA、RTX及ctxA等基因［10-12］進(jìn)行O1群及O139群霍亂弧菌檢測，還鮮見檢測全血清型霍亂弧菌方法報道。

本研究旨在應(yīng)用新型交叉引物等溫擴(kuò)增技術(shù)［13］建立全血清型霍亂弧菌檢測方法，不依賴PCR、熒光PCR等昂貴儀器，避免LAMP方法結(jié)果檢測需要電泳使用EB危害、PCR產(chǎn)物污染等問題，將分子生物學(xué)檢測推廣至基層實(shí)驗(yàn)室或經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)。

1材料與儀器

1.1主要材料與試劑

dNTPs：Fermentas；10×Bst buffer：New England Biolabs；Bst DNA polymerase large fragment：New England Biolabs；MgSO4、betaine：Sigma；核酸快速檢測試紙條：杭州優(yōu)思達(dá)公司；DNA ladder II：北京天為時代科技有限公司；瓊脂糖：promega公司；10×loading buffer：大連寶生物工程公司；5×TBE：大連寶生物工程公司。

菌株采用16株霍亂弧菌，其中5株O1群、1株O139群，10非O1和非O139，來源于臨床分離2株、食品中分離10株；17株其他弧菌，24株食品中常見致病菌，詳見表1。

1.2主要儀器與設(shè)備

PCR儀：Biometra；離心機(jī)：Eppendorf，5417R；DNA/RNA/蛋白分析儀：BHIMUZDA，Bio Specmini；電泳儀：Hoefer，PS3000，American；凝膠成像儀：Bio-Rad，Italy。

表1　試驗(yàn)菌株Table 1Bacterial strains for detection

1.3方法

1.3.1引物及探針的設(shè)計

利用霍亂弧菌toxR基因序列（GenBank CP001233）［14-15］設(shè)計特異性引物及探針見表2。參照已發(fā)表的LAMP方法［16］設(shè)計引物，序列見表2。

表2　檢測霍亂弧菌引物序列Table 2 Primers and probe used for the detection of V.cholera

1.3.2反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

1.3.2.1交叉引物等溫擴(kuò)增方法

反應(yīng)體系50 μL，各試劑濃度為：10×ThermoPol buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，100 mmol/L MgSO42 μL，5 mol/L betaine 5 μL，8 U/μL Bst DNA酶2.5 μL，2 μmol/L VCF及VCR各1 μL，20 μmol/L VCCF及VCCR各2 μL，20 μmol/L VCDF及VCDR各2 μL，1 μL模板，22.5 μL水。

反應(yīng)條件：60℃反應(yīng)60 min。

1.3.2.2環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法

反應(yīng)體系50 μL，各試劑濃度為：濃度50 μmol/L的FI及BI引物各1.6 μL，10 μmol/L的F3及B3引物1 μL，50 μmol/L的L引物0.8 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，100 mmol/L MgSO43 μL，5 mol/L betaine 4 μL，8 U/μL Bst DNA酶2 μL，10×ThermoPol buffer 5 μL，1 μL模板，水補(bǔ)足至50 μL。

反應(yīng)條件：60℃反應(yīng)75 min。

1.3.3特異性試驗(yàn)

對表1中菌株核酸樣本進(jìn)行試驗(yàn)，以證明交叉引物等溫擴(kuò)增檢測方法是否具有通用性及特異性。

1.3.4靈敏度試驗(yàn)

霍亂弧菌CDC1201、CDC0904及MCCC1A02608為試驗(yàn)菌株，37℃培養(yǎng)16 h，取1 mL用于細(xì)菌基因組提取，利用DNA/RNA/蛋白分析儀檢測進(jìn)行DNA定量。對培養(yǎng)的純菌液計數(shù)后10倍稀釋，按照CPA及LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.5樣品添菌檢測

取經(jīng)證實(shí)不含霍亂弧菌的魚糜樣品A、B在增菌前分別添加101CFU/25g，100CFU/25g霍亂弧菌MCCC1A02608菌液1 mL，混勻1 min，加入225 mL堿性胨水（APW）37℃培養(yǎng)24 h，取1 mL樣品增菌液按照本研究方法進(jìn)行檢測，未添加菌的樣品A、B作為空白對照，同時做細(xì)菌計數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1特異性試驗(yàn)

圖1是交叉引物等溫擴(kuò)增方法部分霍亂弧菌檢測結(jié)果。

圖1　霍亂弧菌交叉引物等溫擴(kuò)增特異性檢測Fig.1Specificity of detecting V.cholera

56株實(shí)驗(yàn)菌株，其中16株霍亂弧菌檢測全部為陽性，其余17株其他弧菌及24株陰性相關(guān)菌檢測為陰性，說明交叉引物等溫擴(kuò)增結(jié)合免疫金標(biāo)試紙條檢測方法特異性良好，而且對于霍亂弧菌全血清型具有很好的通用性。

2.2檢測靈敏度

2.2.1DNA檢測

利用紫外分光光度計檢測CDC1201，CDC0904 and MCCC1A02608的OD 260/280在1.83-1.982，說明DNA質(zhì)量好，可以進(jìn)行分子生物學(xué)檢測，DNA濃度分別為79.28、74.02、67.39 μg/mL，10倍梯度稀釋至10-8，按照2種等溫擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)3次，結(jié)果見表3。

說明交叉引物等溫擴(kuò)增方法DNA檢測靈敏度高于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)方法，交叉引物在79 fg/test時，檢測全部為陽性，環(huán)介導(dǎo)3個檢測出現(xiàn)1個陽性。

2.2.2純菌液檢測

霍亂弧菌試驗(yàn)菌株過夜培養(yǎng)后菌液濃度分別為CDC1201（4.2×108CFU/mL）、CDC0904（8.7×107CFU/mL）、MCCC1A02608（6.7×107CFU/mL），用PBS對菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋至100CFU/mL數(shù)量級，各取1 mL提取DNA做實(shí)驗(yàn)?zāi)０?，兩種等溫擴(kuò)增方法結(jié)果見表4。

表3　霍亂弧菌DNA靈敏度試驗(yàn)結(jié)果Table 3Sensitivity of detecting V.cholerae genomic DNA

表4　霍亂弧菌菌液靈敏度試驗(yàn)結(jié)果Table 4Sensitivity of detecting V.cholerae in pure cultures

其靈敏度穩(wěn)定達(dá)到102CFU/mL，在101CFU/mL數(shù)量級時，CPA方法可以檢出，但LAMP方法檢測全部為陰性。

2.3樣品添菌實(shí)驗(yàn)

對魚糜空白樣品細(xì)菌計數(shù)，即樣品本底雜菌數(shù)為7.2×102CFU/g，向樣品中添菌量為5.6及56 CFU/25 g，兩種方法均可檢出，說明經(jīng)增菌后的檢測靈敏度二者一致，在有其他干擾菌的情況下均可以達(dá)到100CFU/ 25 g的檢測低限。

3結(jié)論

霍亂弧菌作為人類食源性致病菌其致病性及檢測方法早已引起各國學(xué)者的重視，對非致病性霍亂弧菌在近年來發(fā)展迅速，研究發(fā)現(xiàn)非致病性霍亂弧菌也導(dǎo)致人類疾病，推測可能與有關(guān)毒力因子有關(guān)，如毒素協(xié)同調(diào)節(jié)菌毛（TCP）［17］，毒力調(diào)節(jié)基因toxR，細(xì)胞毒素因子［18］溶血素（Hly A）［19］等，其中ToxR在所有的非致病性霍亂弧菌中被發(fā)現(xiàn)，其與霍亂毒素A基因的調(diào)節(jié)有關(guān)［20-21］，因此本研究以toxR為靶基因檢測全血清型霍亂弧菌，經(jīng)特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，以該基因?yàn)槟康钠螜z測霍亂弧菌具有良好的特異性及通用性。

隨著等溫擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展，解決了分子生物學(xué)快速檢測方法對儀器的依賴，將其應(yīng)用推廣到一個新的高度。通過研究發(fā)現(xiàn)，由于引物設(shè)計原理的不同，交叉引物等溫擴(kuò)增方法實(shí)際檢測靈敏度要略高于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法，但是由于樣品增菌后目標(biāo)菌濃度一般可達(dá)到104CFU/mL左右，二者添菌試驗(yàn)檢測靈敏度一致，由于方法操作簡便，不需要特殊設(shè)備，均可應(yīng)用于基層實(shí)驗(yàn)室檢測以及樣品的快速篩選檢測。但是本研究交叉引物等溫擴(kuò)增結(jié)合免疫金標(biāo)試紙條檢測方法的建立，解決了環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法檢測結(jié)果的缺陷，避免電泳時PCR產(chǎn)物的二次污染和EB對人體的危害，同時克服了觀察沉淀或顏色變化造成的不客觀性，在結(jié)果觀察方面明顯優(yōu)于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法，所以本研究建立的霍亂弧菌檢測方法具有較強(qiáng)的推廣效應(yīng)。

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Detection of Vibrio cholera by Lsothermal Cross-priming Amplification

ZHANG Xia1，2，GAO Lin2，WANG Song2，ZHAO Liang-juan2，ZHENG Wen-jie2，WANG Shuo1，*
（1.College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin，300457，China；2.Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China）

To develop a cross-priming amplification（CPA）method for the detection of all serotypes of V. cholera on food.Specific primers and probe were designed，we developed cross-primer isothermal amplification method，using the immuno-gold standard test strip to test results.The specificity of the method was evaluated by 57 different bacterial strains.The sensitivity of the method was evaluated by testing the quantitative DNA，pure bacteria counted and the sample of adding V.cholera comparing with the loop-mediated isothermal amplification（LAMP）method.All of the V.cholera strains showed positive results，and 41 other types of bacteria gave negative results.The limit of detection of the CPA method was 79.28 fg of genomic DNA，4.2×102CFU/mL for bacteria in pure culture，and 5.6 CFU per 25 g of sample with pre-enrichment.This method showed a higher sensitivity than the LAMP method did and was more convenient to perform.These results indicate that the CPA method can be used for the rapid preliminary screening of V.cholera.

cross prime isothermal amplification；Vibrio cholera；detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.028

2015-07-21

質(zhì)檢總局科研專項(xiàng)《食源性致病菌恒溫擴(kuò)增結(jié)合免疫金標(biāo)檢測技術(shù)的研究》資助（2011IK241）

張霞（1975—），女（漢），高級工程師，碩士研究生，研究方向：食品安全檢測。

王碩（1969—），男，教授，研究方向：食品安全檢測。