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    基于COI基因的搖蚊亞科部分屬的系統(tǒng)發(fā)育分析(雙翅目:搖蚊科)

    2015-11-01 03:41:02王婷婷王新華閆春財(cái)
    關(guān)鍵詞:搖蚊亞科密碼子

    姜 麗,閆 嬌,王婷婷,郭 琴,王新華,閆春財(cái)

    (1.天津師范大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院,b.天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300387;2.南開(kāi)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,天津300071)

    搖蚊科隸屬雙翅目長(zhǎng)角亞目(Diptera:Nematocera),搖蚊科種類約占淡水湖沼生物區(qū)系的25%,其幼蟲(chóng)生物量約占底棲動(dòng)物總量的70%~80%.由于搖蚊科昆蟲(chóng)具有個(gè)體相對(duì)較大、易獲得、生活習(xí)性多樣、區(qū)域性強(qiáng)、底棲生活等優(yōu)點(diǎn),因此是監(jiān)測(cè)水體環(huán)境和污染狀況的優(yōu)良指示生物[1].

    搖蚊亞科是搖蚊科中僅次于直突搖蚊亞科的第2大亞科,目前對(duì)搖蚊亞科的研究相對(duì)較少.搖蚊亞科有3個(gè)族:搖蚊族(Chironomini,至少 69個(gè)屬)、長(zhǎng)跗搖蚊族(Tanytarsini,至少16屬)和偽搖蚊族(Pseudochironomini,至少5屬).由于形態(tài)學(xué)和核型特征的不同造成了復(fù)雜的物種多樣性和較小的屬間差異,出現(xiàn)了基因重組和趨同進(jìn)化,導(dǎo)致物種鑒定的難度加大和搖蚊物種分類地位的不明確.為解決這一問(wèn)題,近年來(lái)分子系統(tǒng)學(xué)利用標(biāo)記基因在物種分類方面取得了一些進(jìn)展.這些標(biāo)記基因的特點(diǎn)是多態(tài)性高、共顯性遺傳、選擇中性、容易獲得、容易操作及重復(fù)性好.線粒體細(xì)胞色素氧化酶I基因(COI)自2004年以來(lái)被廣泛應(yīng)用于昆蟲(chóng)的條形碼研究[2].迄今,一個(gè)包含超過(guò)8萬(wàn)種昆蟲(chóng)信息的數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)形成[3].廣泛多態(tài)性和豐富的可用數(shù)據(jù)使COI基因成為一個(gè)能夠鑒定物種多樣性的分子系統(tǒng)學(xué)工具.Guryev[4]第一次嘗試基于COI的核苷酸序列和線粒體DNA的細(xì)胞色素b基因(Cytb)研究搖蚊科的系統(tǒng)發(fā)育.然而,Guryev僅利用了幾個(gè)屬(Chironomus、Kiefferulus、Sergentia、Polypedilum和Axarus)建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)來(lái)反映亞科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系.此后,Sharma[5]基于rDNA的ITS1和ITS2建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),確定了搖蚊族9個(gè)屬的物種地位.Ekrem等[6]基于線粒體COI基因的核苷酸序列獲得了長(zhǎng)跗搖蚊族(Tanytarsini)5個(gè)屬的親緣關(guān)系,包括2個(gè)核基因(FE1和CAD)及3個(gè)線粒體基因(COI、COⅡ和16s RNA)的分析[7].關(guān)于Chironomus和Sergentia的屬內(nèi)關(guān)系[8-11]也有少量報(bào)道.迄今為止,所有的搖蚊亞科系統(tǒng)發(fā)育重建均包含數(shù)目有限的屬和種,屬間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系仍然不明確.

    本研究基于搖蚊亞科39屬48種的COI基因序列,擬重建搖蚊亞科屬級(jí)之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系.

    1 材料和方法

    1.1 樣品來(lái)源

    實(shí)驗(yàn)所用的搖蚊樣品主要來(lái)自野外采集,采集方式包括網(wǎng)捕和燈誘.標(biāo)本放置于-20℃的冰箱中保存.經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定,供系統(tǒng)發(fā)育研究的搖蚊樣本詳細(xì)信息如表1所示,在GenBank下載的25種搖蚊COI基因的相關(guān)序列信息如表2所示.

    表1 實(shí)驗(yàn)樣品來(lái)源Tab.1 Sourceof samples

    表2 25種搖蚊COI基因的相關(guān)信息Tab.2 Information of COI genesof 25 species

    1.2 DNA的提取

    取頭部、觸角、翅、足、腹部和生殖節(jié),用加拿大樹(shù)膠做永久裝片,為種類鑒定提供依據(jù),剩下的胸部用于DNA提取.使用天根生化科技有限公司生產(chǎn)的血液/細(xì)胞/組織/基因組DNA提取試劑盒,按照使用說(shuō)明書(shū),微調(diào)部分操作步驟進(jìn)行DNA提取.

    1.3 PCR擴(kuò)增

    對(duì)COI基因進(jìn)行擴(kuò)增使用的是通用引物L(fēng)CO1490(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和 HCO-2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAAT-CA-3′).這2個(gè)引物組合能夠擴(kuò)增長(zhǎng)度大約為1 kbp的片段.大多數(shù)個(gè)體都能用這段引物擴(kuò)增得到相應(yīng)序列.

    PCR反應(yīng)體系為25μL,包括:ddH2O 16.2μL,10×PCR Buffer 2.5 μL,dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL,上游和下游引物(10μmol/L)各 1μL,Taq酶(500 U,2.5 U/μL)0.3μL,DNA 模板2μL.

    PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性40 s,56℃退火40 s,72℃延伸1 min,32個(gè)循環(huán),最后72℃延伸5 min,溫度降低到4℃終止擴(kuò)增.得到的PCR產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè),經(jīng)檢測(cè)符合要求的產(chǎn)物送北京華大基因研究中心測(cè)序.

    1.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理和分析

    所測(cè)得序列先進(jìn)行校對(duì),然后在NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì),得到的同源序列絕大多數(shù)來(lái)自昆蟲(chóng)綱線粒體基因組細(xì)胞色素氧化酶 I(Cytochrome oxidase I,COI)的目標(biāo)DNA片段,在排除了外源基因污染后,經(jīng)過(guò)比對(duì)再將確認(rèn)無(wú)誤后的序列采用BioEdit 7.01軟件進(jìn)行比對(duì),去掉兩端不整齊的序列.

    2 基于COI基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

    2.1 COI基因序列的堿基組成

    利用MEGA5.1軟件對(duì)搖蚊亞科48種搖蚊的基因序列進(jìn)行分析,結(jié)果如表3所示.序列總長(zhǎng)度平均為698 bp,序列中各堿基含量的平均值是:A=29.3%,T=37.7%,G=14.7%,C=18.3%,(C+G)含量(33%)遠(yuǎn)低于(A+T)含量(67%),表現(xiàn)出明顯的堿基偏倚性,這與絕大多數(shù)昆蟲(chóng)線粒體的基因具有一致性.

    在比對(duì)的序列中,C(保守位點(diǎn)數(shù))占69.6%(486/698),V(變異位點(diǎn)數(shù))占24.6%(172/698),Pi(簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù))占 16.1%(113/698),S(自裔位點(diǎn)數(shù))占5.73%(40/698).密碼子第2位點(diǎn)較為保守,其保守位點(diǎn)數(shù)占全部保守位點(diǎn)數(shù)的49.8%(242/486).密碼子第3位點(diǎn)可變數(shù)占全部可變位點(diǎn)數(shù)的84.8%(146/172),而且簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)也集中在第3位點(diǎn)上,其比例為62.5%,由此可見(jiàn)密碼子第3位點(diǎn)上的堿基進(jìn)化速率較快.

    表3 搖蚊亞科48種搖蚊COI基因序列信息Tab.3 Information of COI gene sequencesof 48 species from Chironom inae

    2.2 密碼子氨基酸組成分析

    對(duì)搖蚊亞科48種搖蚊的密碼子使用頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果如表4所示.該序列編碼了212種氨基酸,富含AT的密碼子包括:亮氨酸(Leu L)的使用頻率(CU)和相對(duì)使用頻率(RSCU)值范圍分別為2.9~9.0和0.64~1.98;甲硫氨酸(Met M)的CU和RSCU值范圍分別為0.0~1.8和0.00~1.00.富含GC的密碼子包括:甘氨酸(Gly G)的CU和RSCU值范圍分別為0.3~1.6和0.22~1.27;脯氨酸(Pro P)的CU和RSCU值范圍分別為 0.6~3.1和 0.32~1.56;精氨酸(Arg R)的 CU 值和RSCU值范圍分別為0.2~0.6和0.27~0.71.苯丙氨酸(F)使用量最高;其次是異亮氨酸(I);再次是酪氨酸(Y).因此COI基因表達(dá)產(chǎn)生的氨基酸在組成上具有一定的偏向性,AT密碼子的相對(duì)使用頻率大于GC密碼子的相對(duì)使用頻率.

    表4 搖蚊亞科48種搖蚊的密碼子使用頻率Tab.4 Codon usage frequency of 48 species in Chironom inae

    2.3 堿基替換分析

    對(duì)搖蚊亞科48種搖蚊的COI基因進(jìn)行堿基替換分析,結(jié)果如表5所示.總轉(zhuǎn)換數(shù)為84,總顛換數(shù)為105,轉(zhuǎn)換略低于顛換.不同密碼子之間的堿基替換具有差異性.密碼子第3位點(diǎn)上出現(xiàn)了較為明顯的堿基替換,替換比例達(dá)到7%(70/189),其中轉(zhuǎn)換占全部轉(zhuǎn)換數(shù)的 34.5%(29/84),顛換占 39%(41/105).第 2 點(diǎn)位點(diǎn)最為保守,只有26.9%(51/189)的替換率,分別占轉(zhuǎn)換發(fā)生數(shù)的32.1%(27/84),顛換發(fā)生數(shù)的22.8%(24/105).內(nèi)群平均轉(zhuǎn)換比顛換(R 值)=0.8,小于 1,表明堿基替代未達(dá)到飽和.

    表5 搖蚊亞科48種搖蚊COI基因序列基因堿基替換Tab.5 Nucleotidessubstitution of COI gene sequencesof 48 species in Chironom inae

    2.4 COI基因序列堿基替換飽和度分析結(jié)果

    利用MEGA 5.1軟件對(duì)搖蚊亞科48種搖蚊COI基因進(jìn)行堿基替換飽和度分析,結(jié)果如圖1所示.

    圖1 COI基因轉(zhuǎn)換顛換數(shù)與p距離的關(guān)系Fig.1 Relationship between COI gene conversion and transversion with p-distance

    從圖1可以看出,轉(zhuǎn)換數(shù)(Ts)和顛換數(shù)(Tv)大部分重合,呈直線分布,隨著p距離的增大而增多,顛換略高于轉(zhuǎn)換,但兩者沒(méi)有明顯的飽和趨勢(shì).同Tv相比,Ts與p距離的線性關(guān)系更強(qiáng),堿基替換未達(dá)到飽和.推測(cè)顛換數(shù)高于轉(zhuǎn)換數(shù)的原因與COI序列中(A+T)含量較高有關(guān),因?yàn)楦撸ˋ+T)含量增加了A-T顛換的幾率.

    2.5 遺傳距離分析

    計(jì)算48種搖蚊之間未校正的p距離,結(jié)果顯示:搖蚊亞科內(nèi)各屬間p距離的變化范圍為0.061~0.183;而外群環(huán)足搖蚊屬與搖蚊亞科間的p距離的變化范圍則為0.013~0.156,所有序列的平均p距離為0.201.

    2.6 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的構(gòu)建

    以環(huán)足搖蚊屬的5個(gè)種作為外群,使用MEGA5.1軟件構(gòu)建基于Kimura-2-parameter模型的鄰接法(NJ)和最大簡(jiǎn)約法(MP)的48種搖蚊的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,結(jié)果如圖2和圖3所示.以重復(fù)抽樣分析(Bootstrap test)1 000次來(lái)檢驗(yàn)分子系統(tǒng)樹(shù)各分支的置信度.2種建樹(shù)方法得到的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致.

    圖2 基于COI基因序列構(gòu)建的48種搖蚊的NJ樹(shù)Fig.2 NJ tree of 48 speciesof Chironom inae based on COI gene sequences

    圖3 基于COI基因序列構(gòu)建的48種搖蚊的MP樹(shù)Fig.3 MP tree of 48 species of Chironom inae based on COI gene sequences

    3 討論

    本研究中NJ樹(shù)和MP樹(shù)形成的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本相似,所反映的部分屬間關(guān)系情況大致相同.搖蚊亞科的2個(gè)屬群的進(jìn)化基本得到了解決,出現(xiàn)了2個(gè)明顯的進(jìn)化枝.總體上系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系支持了形態(tài)學(xué)上鑒定的屬和大部分種的地位.搖蚊亞科包括兩大有區(qū)別的集群:搖蚊族和長(zhǎng)跗搖蚊族,它們?cè)诩s8 500萬(wàn)年以前開(kāi)始分化,這些族的代表屬在形態(tài)學(xué)特征上有顯著不同.目前分類學(xué)家分辨出的Pseudochironomini的代表屬在Dillon等[11]構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育圖中沒(méi)有形成一個(gè)分支,Pseudochironomus sp.和Chironomini的屬在一個(gè)進(jìn)化枝上,其分類地位還不明確.搖蚊亞科和直突搖蚊亞科的代表種形成約在104萬(wàn)年以前,與古生物學(xué)家鑒定的白堊紀(jì)搖蚊[12]的形態(tài)相一致.105萬(wàn)年以前的一個(gè)搖蚊亞科的代表—狹搖蚊屬,從搖蚊亞科和直突搖蚊亞科之間單獨(dú)形成一支.在本研究中,多足搖蚊屬群中的內(nèi)搖蚊屬(Endochironomus Kieffer)、倒毛搖蚊屬(Microtendipes Kieffer)、明搖蚊屬(Phaenopsectra Kieffer)和斑搖蚊屬(Stictochironomus Kieffer)很好地聚集在一起,有很近的親緣關(guān)系,與形態(tài)學(xué)的分類一致.分類學(xué)家依據(jù)一些相似的特征(如觸角13鞭節(jié),下唇須5節(jié),中足具一內(nèi)一外2根短脛距及偶爾外脛距退化,上、下附器、肛尖形狀變異情況以及有或無(wú)中附器等)將11個(gè)近緣的屬聚為多足搖蚊屬群.長(zhǎng)跗搖蚊屬群中桿長(zhǎng)跗搖蚊屬(Virgatanytarsus)和長(zhǎng)跗搖蚊屬(Tanytarsus),小突搖蚊屬(Micropsectra)和流長(zhǎng)跗搖蚊屬(Rheotanytarsus)很好地聚集在了一起,與形態(tài)學(xué)的分類一致,還有一些同屬群的物種個(gè)體并沒(méi)有聚類在一起.Cranston[13]在1989年編制的屬級(jí)鑒別特征,依據(jù)非常長(zhǎng)的中附器、V型的臀板帶、肛尖頂尖、指附器未伸出上附器內(nèi)緣等相似特征將31個(gè)近緣屬聚為長(zhǎng)跗搖蚊屬群,但是其中泉搖蚊屬(Krenopsectra)和長(zhǎng)跗搖蚊屬(Tanytarsus)聚為姐妹群,這與形態(tài)學(xué)分類有明顯差異.多數(shù)基于形態(tài)學(xué)研究的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系顯示:狹搖蚊屬(Stenochironomus)和明搖蚊屬(Phaenopsectra)互為姐妹群,但是在本研究中這2個(gè)類群并沒(méi)有聚合在一起形成姐妹群關(guān)系.在本文中顯示較高支持率的姐妹群為:阿克西搖蚊屬(Axarus)和異足搖蚊屬(Apedilum)、二叉搖蚊屬(Dicrotendipes)和枝角搖蚊屬(Cladopelma).由于目前尚無(wú)分子系統(tǒng)學(xué)和形態(tài)學(xué)研究的相關(guān)報(bào)道,本文結(jié)果有待進(jìn)一步驗(yàn)證,在今后研究中需要增加更多的基因序列進(jìn)行聯(lián)合分析.

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