玉米中霉菌的分離純化及鑒定

徐艷陽，于靜，繆彬彬，關(guān)歡歡

（吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林長春130022）

玉米中霉菌的分離純化及鑒定

徐艷陽，于靜，繆彬彬，關(guān)歡歡

（吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林長春130022）

從儲藏玉米中分離純化得到霉菌的單菌落，并對菌種進行鑒定。對玉米進行5次取樣，分離到60個單菌落，其中曲霉屬檢出率最高，青霉屬次之。采用點植法對霉菌在察氏培養(yǎng)基和高鹽察氏培養(yǎng)基上的生長情況，包括菌落直徑、質(zhì)地、顏色、滲出物有無等進行記錄，同時在光學(xué)顯微鏡下對菌體結(jié)構(gòu)進行觀察，參照菌落標(biāo)準圖譜，鑒定出5種霉菌，分別為黑曲霉、煙曲霉、產(chǎn)黃青霉、桔青霉和緩生青霉，為今后玉米儲藏中的菌相研究提供參考。

玉米；霉菌；分離；純化；鑒定

霉菌是引起糧食變質(zhì)的主要微生物類群，無論糧食儲藏的品種、條件、期限等方面有多大的不同，其儲藏的安全性都將受到霉菌的威脅。糧食經(jīng)霉菌及毒素污染后，輕者食用品質(zhì)下降，重者危害人體健康。全球每年受到霉菌污染的農(nóng)作物約有25%，有2%的糧食由于霉變喪失使用價值［1］，我國糧食霉菌及毒素污染情況也十分嚴重［2-3］。

玉米是全世界重要的糧食作物和的飼料來源，是我國年產(chǎn)量最大的農(nóng)作物［4］，其產(chǎn)量高達2億t左右［5］。玉米在收獲、儲藏和加工過程中都易受到霉菌的污染。相對于其他糧食，玉米的胚部較大、營養(yǎng)成分豐富、原始水分高、成熟度不均勻［6］，在儲藏過程中更易發(fā)生霉變。在玉米儲藏過程中的霉菌污染以青霉屬、曲霉屬、根霉屬和鐮刀霉屬為主，其中青霉屬和曲霉屬是優(yōu)勢菌屬［7］，曲霉屬［8］、青霉屬［9］和鐮刀霉［10-11］屬均可產(chǎn)生毒素。因此本文對玉米中的霉菌進行分離純化，找到玉米儲藏中常見的霉菌，通過霉菌菌落在察氏培養(yǎng)基和高鹽察氏培養(yǎng)基上生長情況以及對其在光學(xué)顯微鏡下的結(jié)構(gòu)觀察進行鑒定，為今后玉米儲藏中菌相研究以及抑菌方法的研究提供試驗菌種。

1材料與方法

1.1材料與儀器

玉米：由本院玉米實驗基地提供。察氏培養(yǎng)基（CA）、高鹽察氏培養(yǎng)基（CD）、孟加拉紅培養(yǎng)基、棉蘭石碳酸染液：生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院食品理化分析實驗室自制。

硝酸鈉，磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀，硫酸鎂，氯化鉀，硫酸亞鐵，蔗糖，瓊脂，葡萄糖，氯化鈉，乳酸（比重1.21），吐溫-80等均為分析純試劑；蛋白胨，孟加拉紅，氯霉素等均為生物試劑。

JA3003A電子精密天平：上海精天電子儀器有限公司；DSX-280A不銹鋼手提式高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；DHP060恒溫培養(yǎng)箱：上海實驗儀器廠有限公司；SW-CJ-1DF潔凈工作臺：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SHA-C水浴恒溫振蕩器：金壇市恒豐儀器廠；DMXY數(shù)碼生物顯微鏡：寧波舜寧儀器有限公司；BCD-L45冰箱：合肥榮事達電冰箱有限公司；LD4-2A低速離心機：北京雷勃爾離心機有限公司。

1.2方法

1.2.1玉米霉菌的分離及純化

在無菌條件下，將25 g玉米放入到裝有225 mL無菌水的三角瓶中，在恒溫水浴振蕩器上振蕩20 min，然后進行梯度稀釋至合適濃度。取0.5 mL稀釋樣品轉(zhuǎn)移到孟加拉紅培養(yǎng)基上，用無菌涂布棒涂勻后，放入恒溫培養(yǎng)箱中，（28±1）℃條件下培養(yǎng)3 d～5 d。

待長出菌落后，用接種針挑取疑似霉菌菌落，在孟加拉紅培養(yǎng)基上做劃線分離，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)（28±1）℃培養(yǎng)5 d，鏡檢后，接種于試管馬鈴薯斜面培養(yǎng)基內(nèi)于4℃冰箱內(nèi)進行保存。

1.2.2玉米霉菌的鑒定

菌落形態(tài)觀察：采用點植法將分離到的疑似霉菌菌落接種于察氏培養(yǎng)基和CD內(nèi)，（28±1）℃培養(yǎng)5 d～7 d，期間測量菌落直徑、觀察菌落形態(tài)并拍照記錄。

菌落顯微結(jié)構(gòu)觀察：將上述得到的菌種制成水浸片，在載玻片上滴加一滴乳酸石碳酸棉蘭染液，用解剖針從生長有霉菌的平板中挑取少量帶有孢子的菌絲，用50%的乙醇浸潤，再用蒸餾水將浸潤過的菌絲清洗一遍，然后放入載玻片的染液中，用解剖針將菌絲仔細分散開來，蓋上蓋玻片，在光學(xué)顯微鏡下進行微觀形態(tài)觀察。

鑒定方法：參照GB/T4789.16-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗常見產(chǎn)毒霉菌的鑒定》［12］。

鑒定結(jié)果：參照GB/T 26628.1-2011《糧油檢驗儲糧真菌標(biāo)準圖譜》［13］、《真菌鑒定手冊》［14］和《中國氣傳真菌圖譜鑒定》［15］等資料。

1.2.3霉菌檢出率的測定

對分離霉菌時培養(yǎng)基上長出的單菌落進行計數(shù)，并在光學(xué)顯微鏡下進行觀察，確定其菌屬。霉菌檢出率公式：

式中：D為菌屬檢出率；M1為各菌屬單菌落數(shù)量；M2為總的單菌落數(shù)量。

2結(jié)果與分析

2.1霉菌鑒定結(jié)果

對玉米中的霉菌進行分離、純化，得到5種霉菌，分為菌落特征和顯微觀察兩部分進行研究。菌落特征包括：菌落生長速度、顏色、質(zhì)地，滲出物和氣味的有無，以在培養(yǎng)基上的顏色變化。顯微觀察包括：分生抱子形狀、分生抱子梗的特征、小梗的著生方式等。

2.1.1黑曲霉（Aspergillus niger）鑒定

菌落生長較快，在高鹽CD察氏培養(yǎng)基上生長5 d～7 d，直徑為27.8 mm～41.2 mm；CA上生長5 d～7 d，直徑29.9 mm～46.7 mm。菌落初期正反面均為白色，隨培養(yǎng)時間增長，正面逐漸變?yōu)闉楹谏?，致密厚絨狀，無明顯凸起；反面顏色加深，有褶皺及放射性溝紋，無氣味，無滲出，菌落形態(tài)見圖1。光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)菌絲無色，分生孢子梗長且光滑，從壁厚而膨大的菌絲細胞垂直生出，無橫隔，上部較粗大，頂端膨大成泡囊（球形、橢圓形或半圓形）；從泡囊的表面叢生出小梗，小梗雙層（初期為單層），分生孢子生于小梗頂端，黑色穗球狀，初期光滑，后期較粗糙，微觀形態(tài)見圖2。參照標(biāo)準圖譜圖3鑒定結(jié)果為黑曲霉。

圖1　黑曲霉形態(tài)圖（CA）Fig.1Form figure of A.niger（in CA）

圖2　黑曲霉光學(xué)顯微鏡下形態(tài)圖Fig.2Microscopic morphology of A.niger

圖3　黑曲霉標(biāo)準圖Fig.3Standard figure of A.nigers

2.1.2煙曲霉（Aspergillus fumigatus）鑒定

CD上菌落生長較局限，培養(yǎng)5d～7d，直徑2.1mm～9.9 mm；CA上菌落生長較為迅速，培養(yǎng)5 d～7 d，直徑達到23.8 mm～33.2 mm。菌落正面為煙綠色或暗綠色，菌落絨絮狀，無褶皺及溝紋；反面初期為白色至淡黃色，后期變?yōu)闊熅G色或暗綠色，無滲出物，有霉味，有褶皺，菌落形態(tài)見圖4。光鏡下觀察到其分生孢子穗圓筒狀，呈綠色，分生孢子梗短且光滑；頂囊燒瓶裝，僅上半部分或三分之二出產(chǎn)生孢子，分生孢子球狀小梗單層，微觀形態(tài)見圖5。參照標(biāo)準圖譜圖6鑒定結(jié)果為煙曲霉。

圖4　煙曲霉形態(tài)圖（CD）Fig.4Form figure of A.fumigatus（in CD）

圖5　煙曲霉顯光學(xué)微鏡下形態(tài)圖Fig.5Microscopic morphology of A.fumigates

2.1.3產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum）鑒定

圖6　煙曲霉標(biāo)準圖Fig.6Standard figure of A.fumigatus

菌落生長較較快，CD上生長5d～7d，直徑13.0mm～16.4 mm；CA上生長5 d～7 d，直徑18.4 mm～20.1 mm。菌落蔓延，表面致密絨狀，出去呈白色，后顏色加深變?yōu)樗{綠色，具有明顯的放射狀溝紋，邊緣白色；有滲出液擴散至培養(yǎng)基，背面呈黃色，菌落形態(tài)見圖7。光鏡下觀察分生孢子梗光滑，帚狀枝不對稱，作2～3次分支，分支長短不等；分生孢子為橢圓形，顯微結(jié)構(gòu)見圖8。參照標(biāo)準圖譜圖9鑒定結(jié)果為產(chǎn)黃青霉。

圖7　產(chǎn)黃青霉形態(tài)圖（CA）Fig.7Form figure of P.chrysogenum（in CA）

圖8　產(chǎn)黃青霉光學(xué)顯微鏡下形態(tài)圖Fig.8Microscopic morphology of P.chrysogenum

圖9　桔青霉標(biāo)準圖Fig.9Standard figure of P.citrinum

2.1.4桔青霉（Penicillium citrinum）鑒定

菌落生長較局限，CD上生長5d～7d，直徑8.6mm～10.7 mm；CA上生長5 d～7 d，直徑9.8 mm～12.3 mm。表面綠色或艾綠色，呈絨狀且致密，有放射狀溝紋，邊緣白色；反面淡黃色，與培養(yǎng)基顏色相仿，菌落形態(tài)見圖10。光鏡下觀察分生孢子梗光滑由基質(zhì)生出，不分支；帚狀枝由三四個輪生略散開的梗基構(gòu)成，每個基梗上簇生6個～10個密集平行的小梗；分生孢子球狀或近球狀，顯微結(jié)構(gòu)見圖11。參照標(biāo)準圖譜圖12鑒定結(jié)果為桔青霉。

圖10　桔青霉形態(tài)圖（CD）Fig.10Form figure of P.citrinum（in CD）

圖11　桔青霉顯光學(xué)微鏡下形態(tài)圖Fig.11Microscopic morphology of P.citrinum

圖12　桔青霉標(biāo)準圖Fig.12Standard figure of P.citrinum

2.1.5緩生青霉（Penicillium tardum）鑒定

菌落生局限，CD上生長5 d～7 d，直徑2.6 mm～3.4 mm；CA上生長5 d～7 d，直徑1.9 mm～3.1 mm。菌落薄且平坦，表面無褶皺，漸變灰綠色，中間絮狀凸起，邊緣白色；反面顏色較淡，中央黃色，與培養(yǎng)基顏色相仿，菌落形態(tài)見圖13。光鏡下觀察分生孢子梗光滑由基質(zhì)生出，2～3次分支，分支長短接近，分支上簇生出5個～8個密集小梗，分生孢子梗光滑；分生孢子橢圓形，光滑，顯微結(jié)構(gòu)見圖14。參照標(biāo)準圖譜圖15鑒定結(jié)果為緩生青霉。

圖13　緩生青霉形態(tài)圖（CA）Fig.13Form figure of P.tardum（in CA）

圖14　緩生青霉顯光學(xué)微鏡下形態(tài)圖Fig.14Microscopic morphology of P.tardum

圖15　緩生青霉霉標(biāo)準圖Fig.15Standard figure of P.tardum

2.2霉菌檢出率

玉米取樣5次，分離到60個霉菌單菌落，各種菌屬單菌落數(shù)和檢出率見表1，其中曲霉屬和青霉屬檢出率最高。

表1　霉菌檢出率Table 1Detective rate of molds

3結(jié)論

使用孟加拉紅培養(yǎng)基對玉米中的霉菌進行分離，對玉米進行5次取樣，分離到60個霉菌單菌落，其中曲霉屬檢出率最高，青霉屬次之。通過對霉菌在察氏培養(yǎng)基和高鹽察氏培養(yǎng)基上的生長情況觀察，包括菌落直徑、顏色、質(zhì)地、氣味和有無滲出以及光學(xué)顯微鏡下對霉菌菌絲形態(tài)和分生孢子形態(tài)的觀察，鑒定出5種霉菌，分別為黑曲霉、煙曲霉、產(chǎn)黃青霉、桔青霉和緩生青霉。

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Separation Purification and Identification of Molds in Corn

XU Yan-yang，YU Jing，MIAO Bin-bin，GUAN Huan-huan
（College of Biological and Agricultural Engineering，Jilin University，Changchun 130022，Jinlin，China）

Molds derived from corn were separated and purified by single colony，and identified.Corn samples were taken for 5 times from stored corn，and 60 single colonies were isolated.The highest detection rate was of Aspergillus，the higher was Penicillium.The growth situations of molds from corn were recorded，which included colony's diameter，texture，color，and exudates presence of molds in czapek's medium and high salt czapek's medium separately.And the microscopic morphology of molds from corn were observed by optical microscope.Compared with the standard figures，five kinds of molds from corn were identified as follows：Aspergillus funigatus，Aspergillus niger，Penicillium chrysogenu，Penicillium citrinum and Penicillium tardum. This result will provide reference to study further microflora in corn.

corn；molds；separation；purification；identification

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.16.035

2014-06-10

吉林省科技發(fā)展計劃項目（20120717）；吉林大學(xué)開放性創(chuàng)新實驗項目（456OEP16）

徐艷陽（1972—），女（漢），副教授，博士，主要從事食品營養(yǎng)與安全研究。