六盤水野生蕨菜多糖的超聲波輔助提取及含量測定

方玉梅，張萍，王毅紅，譚萍，王盼，趙晉軍

（六盤水師范學(xué)院，貴州水城553004）

六盤水野生蕨菜多糖的超聲波輔助提取及含量測定

方玉梅，張萍，王毅紅，譚萍，王盼，趙晉軍

（六盤水師范學(xué)院，貴州水城553004）

以六盤水野生蕨菜為材料，通過單因素設(shè)計(jì)以及正交試驗(yàn)對蕨菜多糖超聲波提取的最佳工藝進(jìn)行探索，并采用苯酚硫酸法對六盤水野生蕨菜多糖的含量進(jìn)行測定。結(jié)果表明：蕨菜多糖的超聲波輔助提取最佳工藝為料液比1∶100（g/mL）、功率70%（420 W）、時間50 min、溫度35℃；蕨菜多糖的含量為245.751 67 mg/g。為六盤水野生蕨菜的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論參考。

蕨菜；超聲波輔助提?。欢嗵?/p>

蕨菜，別名拳頭菜、如意菜、龍頭菜等，屬于蕨科。喜生于淺山區(qū)向陽地塊，多分布于稀疏針闊混交林。其食用部分是未展開的幼嫩葉芽［1］。農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)及食品營養(yǎng)學(xué)等方面的研究結(jié)果顯示，蕨菜的某些有效成分能擴(kuò)張血管，降低血壓；粗纖維能促進(jìn)胃腸蠕動，具有下氣通便的作用；蕨菜還具有清熱解毒、殺菌清炎、補(bǔ)脾益氣、強(qiáng)健機(jī)體、增強(qiáng)抗病能力保健功能，為某些疾病問題的解決提供了更簡便有效的新途徑［2］。目前，大多數(shù)對蕨菜的研究均集中于次生代謝物質(zhì)（生物類黃酮）的含量上，對蕨菜多糖的研究鮮見報道。蕨菜多糖的提取方法多種多樣，但在利用超聲波輔助提取的方法上較少。

隨著食品營養(yǎng)學(xué)的不斷發(fā)展，人們更加關(guān)注植物性來源的非傳統(tǒng)營養(yǎng)素，并試圖從植物中尋找生理活性物質(zhì)來降低、緩解、解決呈不斷上升趨勢的各種現(xiàn)代社會居民退行性疾病問題。研究表明植物多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、降血糖、刺激造血等多種生物學(xué)功效，而且對機(jī)體幾乎沒有毒性，故對植物多糖生物學(xué)功效的研究愈來愈引起國內(nèi)外藥理學(xué)家、生物學(xué)家和化學(xué)家們的興趣，它已成為當(dāng)代生物學(xué)的熱門領(lǐng)域［3-4］。

蕨菜作為一種野生植物資源，生長在深山叢林之中，沒有工業(yè)排放“三廢”污染，也沒有現(xiàn)代工業(yè)產(chǎn)品造成的農(nóng)藥污染，是一顆天然無公害的綠色珍珠，常年埋沒在高山深谷內(nèi)，屬于天然無公害綠色食品［5］。如果能夠以資源豐富且廉價的蕨菜為試驗(yàn)原料，利用超聲波輔助提取的方法探索優(yōu)化蕨菜多糖的提取工藝并測得其多糖含量，這將對進(jìn)一步開發(fā)利用蕨菜多糖有著重要的意義。

1試驗(yàn)儀器與試劑

1.1主要原料及試劑

原料：蕨菜（采自六盤水石龍）。

試劑：石油醚（安徽易普化工有限公司，分析純）；蒸餾水（二次蒸餾）；苯酚（江蘇振日化工有限公司，分析純）；鋁片（天津市化學(xué)試劑三廠，分析純）；碳酸氫鈉（鄭州超凡化工有限公司，分析純）；葡萄糖（吳江市永和精細(xì)化工有限公司，分析純）。

1.2試驗(yàn)儀器及設(shè)備

LC-600B型數(shù)控超聲波清洗機(jī)：濟(jì)寧市中區(qū)魯超儀器廠，總功率600 W；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；202A-3型恒溫干燥箱：上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠；TGL-16G型離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；FW80型高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；BS110S電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

2試驗(yàn)方法

2.1蕨菜的前處理及脫脂

將采來的新鮮蕨菜洗凈置于調(diào)至65℃的恒溫干燥箱中進(jìn)行烘干處理，徹底脫水后用粉碎機(jī)粉碎成粉末，過60目篩，然后稱取200 g蕨菜干粉于1 000 mL燒杯中，再量取400 mL石油醚加入其中，放置24 h進(jìn)行脫脂，24 h后將蕨菜粉末過濾，然后將蕨菜粉末鋪在大濾紙上待其干燥，將其盛入試劑瓶中放入恒溫干燥箱備用。

2.2蕨菜多糖的顯色工藝

采用苯酚-硫酸法［7-9］對蕨菜多糖進(jìn)行顯色反應(yīng)。

2.2.15%苯酚溶液的配制

5%苯酚溶液配制：取苯酚100 g，加鋁片0.1 g與碳酸氫鈉0.05 g，蒸餾182℃餾分，吸取此餾分10 mL加水至200 mL棕色容量瓶中，即得。

2.2.2參比液的配制

精確吸取3 mL蒸餾水，置于10 mL容量瓶中，加入5%苯酚溶液1 mL混勻，再加入7 mL濃硫酸并計(jì)時，加蒸餾水至刻度，漩渦混合5 min，放置1 min，加蒸餾水至刻度，放置20 min，加蒸餾水至刻度。即獲得參比液。

2.2.3蕨菜多糖樣液的顯色反應(yīng)

從每次試驗(yàn)提取液中精確吸取3 mL蕨菜多糖樣液，置于10 mL容量瓶中，加入5%苯酚溶液1 mL混勻，再加入7 mL濃硫酸并計(jì)時，加蒸餾水至刻度，漩渦混合5 min，放置1 min，加蒸餾水至刻度，放置20 min，加蒸餾水至刻度。

2.3蕨菜多糖的超聲波輔助提取

2.3.1蕨菜多糖超聲波輔助提取條件的單因素研究［10-11］

2.3.1.1提取料液比的單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取0.1 g蕨菜干粉5份于干凈標(biāo)號的具塞試管中，按料液比1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100（g/mL）依次加入2、4、6、8、10mL蒸餾水，置于超聲波清洗機(jī)中，調(diào)節(jié)溫度為55℃，功率70%（420W），提取30 min。然后離心取上清液，將上清液定容至10 mL，再依次精確吸取3 mL提取液進(jìn)行顯色，以制備的參比液作參比，在485nm處分別測其吸光度。以上試驗(yàn)每一處理，3次重復(fù)。

2.3.1.2提取功率的單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取0.1 g蕨菜干粉5份于干凈標(biāo)號的具塞試管中，按料液比1∶80（g/mL）分別加入8 mL蒸餾水，調(diào)取溫度55℃，分別在50%（300 W）、60%（360 W）、70%（420 W）、80%（480 W）、90%（540 W）5種功率下超聲波輔助提取30 min。然后離心取上清液，將上清液定容至10 mL，再依次精確吸取3 mL提取液進(jìn)行顯色，以制備的參比液作參比，在485 nm處分別測其吸光度。以上試驗(yàn)每一處理，3次重復(fù)。

2.3.1.3提取時間的單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取0.1 g蕨菜干粉5份于干凈標(biāo)號的具塞試管中，按料液比1∶80（g/mL）分別加入8 mL蒸餾水，調(diào)節(jié)超聲波清洗機(jī)功率80%（480 W），溫度55℃，分別按時間長短10、20、30、40、50min進(jìn)行提取。然后離心取上清液，將上清液定容至10 mL，再依次精確吸取3 mL提取液進(jìn)行顯色，以制備的參比液作參比，在485 nm處分別測其吸光度。以上試驗(yàn)每一處理，3次重復(fù)。

2.3.1.4提取溫度的單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取0.1 g蕨菜粉末5份置于干凈標(biāo)號的具塞試管中，按料液比1∶80（g/mL）分別加入8 mL蒸餾水，調(diào)節(jié)超聲波清洗機(jī)功率80%（480 W），分別在溫度35、45、55、65、75℃下提取40 min。然后離心取上清液，將上清液定容至10 mL，再依次精確吸取3 mL提取液進(jìn)行顯色，以制備的參比液作參比，在485 nm處分別測其吸光度。以上試驗(yàn)每一處理，3次重復(fù)。

2.3.2蕨菜多糖超聲波輔助提取的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)［12-13］

2.3.2.1蕨菜多糖超聲波輔助提取正交設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用L9（34）四因素三水平設(shè)計(jì)，見表1。

表1　蕨菜多糖超聲波輔助提取正交設(shè)計(jì)因素表Table 1The orthogonal design table of Pteridium Revolutum polysaccharide extraction factors

2.3.2.2蕨菜多糖超聲波輔助提取正交試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取0.1 g蕨菜粉末9份置于干凈標(biāo)號的具塞試管中，按以下正交表分別進(jìn)行試驗(yàn)，然后離心取上清液，將上清液定容至10 mL，再依次精確吸取3 mL提取液進(jìn)行顯色，以制備的參比液作參比，在485 nm處分別測其吸光度。以上試驗(yàn)，每一處理，3次重復(fù)。

表2　蕨菜多糖超聲波輔助提取正交表Table 2Orthogonal table of Pteridium Revolutum polysaccharide by ultrasonic-assisted extraction

2.4蕨菜多糖含量的測定

2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［14］

精確稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖0.1000g，置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀至刻度，搖勻。精確吸取上述溶液1.0 mL，置50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度。

精確量取0.500 0 mg/mL葡萄糖溶液0.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 mL，分別置于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，配成不同濃度的對照品系列溶液。于485 nm波長處測定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，以濃度（X）為橫坐標(biāo)，得回歸方程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.2蕨菜多糖含量測定

準(zhǔn)確稱取0.1 g蕨菜粉末一份置于干凈標(biāo)號的具塞試管中，按料液比1∶100（g/mL）加入10 mL蒸餾水，調(diào)節(jié)超聲波清洗機(jī)功率70%（420 W），溫度35℃，提取50min。然后離心取上清液，將上清液定容至10mL，再依次精確吸取3 mL提取液進(jìn)行顯色，以制備的參比液作參比，在485 nm處分別測其吸光度。以上試驗(yàn)，每一處理3次重復(fù)。之后取吸光度平均值帶入回歸方程，從而求得多糖濃度X。

3結(jié)果與分析

3.1蕨菜多糖超聲波輔助提取條件的單因素研究結(jié)果

3.1.1超聲波輔助提取單因素試驗(yàn)料液比的確定

以吸光度為縱坐標(biāo)，料液比為橫坐標(biāo)，得到不同料液比對多糖的提取效果的影響，結(jié)果見圖1。

圖1　超聲波輔助提取單因素不同料液比的選擇Fig.1Selection of single factor of ultrasonic-assisted extraction for different solid-liquid ratio

通過對圖1數(shù)據(jù)分析，可得知料液比為1∶80（g/mL）時吸光度最高，故單因素最佳提取料液比為1∶80（g/mL）。

3.1.2超聲波輔助提取單因素試驗(yàn)功率的確定

以吸光度為縱坐標(biāo)，超聲波功率為橫坐標(biāo)，得到不同超聲波功率對多糖的提取效果的影響，結(jié)果見圖2。

圖2　超聲波輔助提取單因素不同功率的選擇Fig.2Selection of single factor of ultrasonic-assisted extraction

通過對圖2數(shù)據(jù)分析，可得知功率為80%（480 W）時吸光度最高，故單因素最佳提取功率為80%（480W）。

3.1.3超聲波輔助提取單因素試驗(yàn)時間的確定

以吸光度為縱坐標(biāo)，提取時間為橫坐標(biāo)，得到不同提取時間對多糖的提取效果的影響，結(jié)果見圖3。

圖3　超聲波輔助提取單因素不同提取時間的選擇Fig.3Selection of single factor by ultrasonic-assisted extraction of time

通過對圖3數(shù)據(jù)分析，可得知時間為40 min時吸光度最高，故單因素最佳提取時間為40 min。

3.1.4超聲波輔助提取單因素試驗(yàn)溫度的確定

以吸光度為縱坐標(biāo)，提取溫度為橫坐標(biāo)，得到不同提取溫度對多糖的提取效果的影響，結(jié)果見圖4。

圖4　超聲波輔助提取單因素不同溫度的選擇Fig.4Selection of single factor by ultrasonic-assisted extraction of temperature

通過對圖4數(shù)據(jù)分析，可得知溫度為55℃時吸光度最高，故單因素最佳提取溫度為55℃。

綜上單因素試驗(yàn)結(jié)果，可得蕨菜多糖的超聲波最佳提取條件為：料液比1∶80（g/mL）、功率80%（480 W）、時間40 min、溫度為55℃。

3.2蕨菜多糖超聲波輔助提取的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

采用L9（34）四因素三水平對料液比、超聲波功率、提取時間、提取溫度進(jìn)行設(shè)計(jì)，結(jié)果見表3。

表3　正交設(shè)計(jì)極差分析結(jié)果Table 3Result of orthogonal design range analysis

由上表可知，料液比、功率、時間、溫度為主要影響因子，這4個因素對蕨菜多糖的提取率影響因素顯著，從正交的極差分析，可看出RD＞RB＞RC＞RA，主次因素為D-B-C-A。從K值（直觀分析）來看，D1＞B2＞C3＞A3，所以可確定正交最優(yōu)提取條件為A3B2C3D1，即：料液比1∶100（g/mL）、功率70%（420W）、時間50min、溫度35℃。3.3超聲波輔助提取多糖的驗(yàn)證試驗(yàn)

由于表3沒有最優(yōu)組合方案，故有必要對其做驗(yàn)證試驗(yàn)，以進(jìn)一步確認(rèn)正交試驗(yàn)的可行性。稱取烘干的蕨菜粉3份，每份0.1 g，置于10 mL離心管內(nèi)，按優(yōu)選出的最佳生產(chǎn)工藝條件進(jìn)行提取，于紫外分光光度計(jì)485 nm處測定吸光值，試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4　最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表Table 4Optimal process verification experiment results

由表4的試驗(yàn)結(jié)果可知，在最佳的提取工藝條件下，多糖的吸光度值為0.473，高于正交試驗(yàn)的最高水平（A2B2C3D1），其多糖的吸光度值為0.452。故最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)成功，說明該提取工藝可靠且穩(wěn)定。

3.4蕨菜多糖含量的測定結(jié)果

3.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制結(jié)果見圖5。

圖5　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5The standard curve of glucose

求得回歸方程為：A=0.007097X-0.05023，r=0.9990。

3.4.2多糖含量計(jì)算結(jié)果

將所測的吸光度均值0.473帶入回歸方程，求得蕨菜多糖含量為245.751 67 mg/g。

4結(jié)論與討論

通過查閱文獻(xiàn)及資料可知多糖類物質(zhì)皆在485 nm處有最大吸收峰，故本試驗(yàn)都是采用485 nm來測其吸光度；通過單因素條件探索，初步得知蕨菜多糖的超聲波輔助提取工藝。但是我們都知道，單因素試驗(yàn)考慮的因素比較單一，可信度不高，故設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn)，通過對正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)的極差以及方差處理分析，從而得出多糖的超聲波輔助最佳提取工藝。然后通過利用0.500 0 mg/mL葡萄糖溶液配制的不同濃度對照品系溶液繪制的工作曲線求得回歸方程A=0.007 097X-0.050 23，r=0.999 0；此步驟要求試驗(yàn)操作十分細(xì)致，所得r值須十分精確，不然會影響試驗(yàn)結(jié)果。之后通過蕨菜多糖超聲波提取的最佳工藝提取樣液作顯色反應(yīng)本試驗(yàn)以六盤水野生蕨菜為材料，通過單因素設(shè)計(jì)以及正交試驗(yàn)對蕨菜多糖超聲波輔助提取的最佳工藝進(jìn)行探索，并采用苯酚硫酸法對六盤水野生蕨菜多糖的含量進(jìn)行測定。最終研究結(jié)果表明：蕨菜多糖的超聲波輔助提取最佳工藝為料液比1∶100（g/mL）、功率70%（420 W）、時間50 min、溫度35℃；蕨菜多糖的含量為245.751 67 mg/g。

后測得吸光度，3次重復(fù)試驗(yàn)后取吸光度均值帶入回歸方程，從而求得多糖濃度。

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Ultrasonic-assisted Extraction and Determination of Polysaccharide in Liu Panshui Wild Pteridium Revolutum

FANG Yu-mei，ZHANG Ping，WANG Yi-hong，TAN Ping，WANG Pan，ZHAO Jin-jun
（Liu Panshui Normal College，Shuicheng 553004，Guizhou，China）

Liu Panshui wild Pteridium revolutum as materials，the best technology of single factor and orthogonal experiment design of polysaccharides in Pteridium revolutum by ultrasonic-assisted extraction，and by phenol sulfuric acid method on the content of polysaccharide was determined in Liu Panshui wild Pteridium revolutum.The result showed that：the optimum ultrasonic-assisted extraction of polysaccharide in Pteridium revolutum as solid-liquid ratio was 1∶100（g/mL），power of 70%（420 W），extraction time was 50 min，temperature 35℃；content of polysaccharide in Pteridium revolutum was 245.751 67 mg/g.To provide theoreticalbasis for further development and utilization of Liu Panshui wild Pteridium revolutum.

pteridium revolutum；ultrasonic extraction-assisted；polysaccharide

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.16.028

2014-06-04

六盤水師范學(xué)院自然科學(xué)科研計(jì)劃（lpssy201204）

方玉梅（1982—），女，副教授，碩士研究生，從事植物生理學(xué)與分子生物學(xué)的教學(xué)與研究。