質(zhì)譜圖篩選紅曲紅色素純化方法

劉立增，孟憲昉，白正晨，王莉

（天津商業(yè)大學(xué)理學(xué)院，天津300134）

質(zhì)譜圖篩選紅曲紅色素純化方法

劉立增，孟憲昉，白正晨，王莉

（天津商業(yè)大學(xué)理學(xué)院，天津300134）

以商品化的紅曲米為原料，利用質(zhì)譜圖定性分析，考察在紅曲紅色素提取過程中冷凍，索氏提取，溶劑，柱色譜，薄層色譜等因素對分離效果的影響，篩選并分離得到一種分子離子峰為332.6紅曲紅色素分子。研究結(jié)果表明該紅曲紅色素分子的純化條件依次為：以甲醇為淋洗劑對紅曲米進(jìn)行柱色譜分離，以正己烷、乙酸乙酯和甲醇為萃取劑進(jìn)行一次索氏提取，以CH2Cl2∶CH3OH=1∶1為展開劑進(jìn)行薄層色譜分離，收集Rf=0.8的色帶，以CH3CH2OH∶CCl4= 9∶1為展開劑進(jìn)行第二次薄層色譜分離，收集Rf=0.8的色帶為目標(biāo)分子，收率為0.012 6%。

紅曲紅色素；分離；質(zhì)譜；薄層色譜法

紅曲色素符合食品著色劑-天然、營養(yǎng)、多功能的發(fā)展方向，是我國傳統(tǒng)的食用紅色色素之一，為我國特有的產(chǎn)品，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景［1-3］。紅曲米是采用把紅曲霉屬（Monascus）菌種接種在大米上繁殖而成的。作為一種天然色素制品，紅曲色素是從紅色或紫紅色米曲中提取得到的。使用不同的紅曲菌株、培養(yǎng)基、發(fā)酵條件所產(chǎn)生的紅曲色素組成有較大差異，同時在發(fā)酵過程中，由紅曲色素與發(fā)酵基質(zhì)中的氨基酸、肽、蛋白質(zhì)等發(fā)生反應(yīng)形成紅曲衍生色素，使其組成和呈色效果更加復(fù)雜。從紅曲米中提取的紅曲色素實(shí)際上是混合物，一般含有多種雜質(zhì)。其中有些成分會影響天然色素的穩(wěn)定性和著色度，有些成分甚至存在使用安全性的問題。目前WHO、FAO及其歐美等19個國家使用的48種天然色素中沒有包括紅曲色素。為明確紅曲色素混合物的組成成分、明確各組分的溶解性、穩(wěn)定性等，以及為篩選高產(chǎn)色素菌株、優(yōu)化發(fā)酵條件、優(yōu)化色素的提取工藝、改變提取技術(shù)等研究，需要對食品生產(chǎn)所用的紅曲色素進(jìn)行分離。故此，尋找較好的提取純化方法是為了進(jìn)一步開發(fā)紅曲色素、推廣使用紅曲食用色素的關(guān)鍵之一。

目前紅曲色素的分離主要采用薄層色譜（Thin-Layer Chromatography，TLC）［4］、柱層析法［5］、樹脂吸附分離法、高速逆流色譜法（High-speed countercurrent chromatography，HSCCC）、HPLC法等方法［6］。然后需要采用薄層色譜法、分光光度法、高效液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等方法輔助，對所分離得到的紅曲色素進(jìn)行檢測。其中薄層色譜法，分光光度法，高效液相色譜法雖然可以建立紅曲色素中各單色調(diào)特征組分的定性定量檢測方法，但是由于沒有紅曲中各單一色素的標(biāo)準(zhǔn)品的出售，使其用于定性定量檢測紅曲色素各單一組分受到限制［7-10］。TLC法可以較好的分離、分析紅曲色素的級分，結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)可鑒定紅曲色素的組成及純度。綜上所述，本研究采用薄層色譜方法為分離提純方法，以電噴霧質(zhì)譜（ESI）為定性分析輔助手段，對山東中惠食品有限公司生產(chǎn)的紅曲紅中所含的紅曲色素進(jìn)行了快速、有效分離。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

紅曲紅：山東中惠食品有限公司；薄層層析硅膠板GF254（20 cm×20 cm）、柱層析硅膠（200目～300目）：青島海洋化工有限公司；無水甲醇、無水乙醇、石油醚（30℃～60℃）、二氯甲烷、四氯化碳、正己烷、乙酸乙酯（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA型：上海亞榮生化儀器廠；LCQ DECA XP MAX離子肼質(zhì)譜儀：美國Thermofisher公司。

1.2方法

1.2.1分離紅曲色素中的紅曲紅色素的方法

按照圖1所示工藝流程進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)：

圖1　分離紅曲色素中的紅色素2種工藝流程Fig.1Two processes of separation and purification of the commercial monascus red pigments

實(shí)驗(yàn)I和II：將市售紅曲紅20 g溶于600 mL 45℃水中。然后置于冰箱中進(jìn)行24 h冷凍。常溫下解凍后，200 r/min下對解凍液進(jìn)行離心，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。100℃烘干。對所得色素進(jìn)行1次（I）或2次（II）索氏提取，萃取溶劑依次為正己烷、乙酸乙酯和甲醇（各150 mL）。將所得甲醇提取液濃縮后，采用薄層色譜進(jìn)行分離［CH2Cl2∶CH3OH=1∶1（體積比）］。

實(shí)驗(yàn)III和IV：將市售紅曲紅20 g溶于300 mL甲醇中，過200目～300目硅膠快速柱（直徑45 mm，淋洗劑為甲醇）。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。對所得色素進(jìn)行1次索氏提取，萃取溶劑依次為正己烷、乙酸乙酯和甲醇（各150 mL）。將所得甲醇提取液濃縮后，采用薄層色譜進(jìn)行分離［CH2Cl2∶CH3OH=1∶1（體積比）］。收集第一主色帶，采用三種不同展開劑進(jìn)行第二次薄層色譜分離［展開劑1∶CH2Cl2∶CH3OH=1∶1（體積比）；展開劑2∶CH3CH2OH∶石油醚=3∶7（體積比）；展開劑3∶CH3CH2OH∶CCl4=9∶1（體積比）］。

1.2.2質(zhì)譜圖測試條件

本文質(zhì)譜掃描采用電噴霧（ESI）離子源，樣品由注射泵直接進(jìn)樣。正離子掃描模式；鞘氣和輔助器均為高純氮?dú)猓兌却笥?9.999%），鞘氣流量15個任意值單位（arb unit），電噴霧電壓4.5 kV，毛細(xì)管溫度200℃。

2結(jié)果與討論

2.1質(zhì)譜方法的選擇

質(zhì)譜法是將被測物質(zhì)離子化，按離子的質(zhì)荷比分離，測量各種離子譜峰的強(qiáng)度而實(shí)現(xiàn)分析目的的一種分析方法。組成質(zhì)譜儀的四部分（進(jìn)樣系統(tǒng)、離子源、質(zhì)量分析器、檢測器）中，我們常根據(jù)離子源的不同將質(zhì)譜分為EI源質(zhì)譜，ESI源質(zhì)譜、FAB源質(zhì)譜等等。其中電子轟擊電離（EI）對于固體樣品，通過進(jìn)樣桿將待測樣品直接導(dǎo)入進(jìn)行測試，操作簡便。其缺點(diǎn)在于70eV的電子轟擊，使樣品碎片離子峰較多，而且對于難揮發(fā)和熱穩(wěn)定性差的樣品不適用。電噴霧電離源（ESI）是一種軟電離方式，比EI容易得到比較強(qiáng)的分子離子或準(zhǔn)分子離子，即便是分子量大，穩(wěn)定性差的化合物，也不會在電離過程中發(fā)生分解。目前已知結(jié)構(gòu)的紅曲色素是一系列聚酮化合物：紅色色素（Rubropunctamine紅斑胺素、Monascorubramine紅曲紅胺素）、橙色色素（Rubropunctatine紅斑素、Monascorubrine紅曲紅素）和黃色色素（Monascine紅曲素、Ankaflavine紅曲黃素），其分子量，分子式，結(jié)構(gòu)見圖2［11］。

圖2　六種主要紅曲色素分子結(jié)構(gòu)和分子量Fig.2The molecular structure and molecular weight of six major monascus

由圖2可以看出紅曲色素是由一個五元內(nèi)酯、六元環(huán)酮和六元環(huán)醚或環(huán)胺組成其主體結(jié)構(gòu)，此種結(jié)構(gòu)不易分解，具有一定的熱穩(wěn)定性。對提取得到的同一樣品EI和ESI比對，本實(shí)驗(yàn)采用ESI源進(jìn)行質(zhì)譜測試為更好的定性表征手段。

2.2索氏提取、冷凍、快速柱色譜的作用

本文所研究的原色素提取，方法Ⅰ-Ⅳ流程中（圖1），采用了文獻(xiàn)報道中常見的冷凍、索氏提取和柱色譜等提純手段［12-13］。

分別用正己烷索氏提取出黃色色素、乙酸乙酯提取橙色色素，最后甲醇提取得到較純的紅曲紅色素。

低溫冷凍降低了蛋白或水溶性多肽在水中溶解度，從而可除去色素載體中所含有的蛋白雜質(zhì)。

快速柱層析能直接過濾掉紅曲色素中不溶性雜質(zhì)和發(fā)酵過程中存在的極性偏高的物質(zhì)，如氨基酸，各種鹽類，以及淀粉等大分子化合物。

采用上述方法，可以在進(jìn)行薄層色譜分離前，快速、有效的除去原色素中的非色素成分，有利于提高薄層色譜的分離效率。

2.3質(zhì)譜輔助不同提取方法篩選紅曲紅色素

2.3.1ESI-MS輔助方法I和II篩選紅曲紅色素

按方法I和II所得初級品進(jìn)行1次TLC展開。刮取Rf=0.75的色帶（Bond 1），50 mL甲醇溶解，過濾。旋干。ESI質(zhì)譜測試結(jié)果見圖3。

圖3方法I和II提取紅曲紅色素TLC板和質(zhì)譜圖Fig.3Picture of TLC plate for method I and II and the corresponding mass spectroscopy

圖3（a）和（b）比較了提取過程中進(jìn)行一次和兩次索氏的質(zhì)譜。在（a）和（b）中分子離子峰為332.3和332.6，豐度為100%；核質(zhì)比為304.3和304.4的碎片離子峰，豐度分別為71%和46%。該碎片離子峰與分子離子峰相差28，應(yīng)為核質(zhì)比332.3的分子離子峰斷裂了兩個亞甲基-CH2的結(jié)果。對比圖3（a）和（b）可知，在方法II中，進(jìn)行兩次索氏提取，正己烷、乙酸乙酯兩種萃取用溶劑在提取出黃色色素、橙色色素的同時，明顯降低了核質(zhì)比大于500以上的雜質(zhì)分子的含量，提取純度優(yōu)于一次索氏提取。

2.3.2ESI-MS輔助方法III和IV篩選紅曲紅色素

按方法III和IV所得初級品進(jìn)行1次或2次TLC展開。ESI質(zhì)譜測試結(jié)果見圖4。

圖4（a）和（d）可知，分子離子峰都為332.3和332.6，豐度均為100%；各有一個核質(zhì)比為304.4和304.5的碎片離子峰，豐度分別為47%和28%。該碎片離子峰與分子離子峰相差28，應(yīng)為分子離子峰斷裂了兩個亞甲基-CH2的結(jié)果。對比圖4（a）和（d）可知，1次TLC展開，Bond 1中含分子離子峰為578.8，670.8和690.8的雜質(zhì)峰，豐度分別為33%，42%和27%。以CH3CH2OH∶CCl4=9∶1作為二次TLC展開劑，收集Rf= 0.8的色帶質(zhì)譜圖顯示分子離子峰為332.6，豐度均為100%，碎片峰核質(zhì)比為304.5，豐度為47%，雜質(zhì)峰豐度低，所提取得到的紅曲紅色素純度高。同時比較了CH2Cl2∶CH3OH=1∶1；CH3CH2OH∶石油醚=3∶7；CH3CH2OH∶CCl4=9∶1三種不同展開劑TLC分離效果。圖4（b）為CH2Cl2∶CH3OH=1∶1作二次TLC展開劑，質(zhì)譜圖顯示分子離子峰都為332.6，豐度均為100%，在400～600之間有微量雜峰存在。圖4（c）為CH3CH2OH∶石油醚=3∶7作二次TLC展開劑，由于石油醚自身是一混合物，使得該復(fù)合展開劑分離效果較差，同時核質(zhì)比為169.1，220.1的雜峰豐度較高，分別為70%和47%。經(jīng)比較三種TLC展開劑分離得到的紅曲紅色素ESI質(zhì)譜，可知CH3CH2OH∶CCl4=9∶1的分離效果優(yōu)于另外兩種展開劑。

2.3.3方法I和III篩選紅曲紅色素效果比較

圖3（a）、（b）和圖4（a）均為初級品進(jìn)行1次TLC展開分離提純后所得質(zhì)譜。對比可知，商品化的紅曲米原料進(jìn)行柱色譜分離能快速有效的除去所含有的分子量在100～800范圍內(nèi)的大部分非色素分子。相對而言，采用冷凍，離心，烘干制備初級品的工藝路線去除雜質(zhì)效果較差，又增加了分離操作步驟，增加了色素光分解可能性，降低了色素的分離收率。

2.3.4收率

稱取紅曲紅粉末總量為20 g，按法IV，經(jīng)過索氏提取，TLC等多次分離純化最終得到了2.5 mg紅曲紅色素，產(chǎn)品的收率為0.0126%。

3結(jié)論

圖4　方法III和IV提取紅曲紅色素TLC板和質(zhì)譜圖Fig.4Picture of TLC plate for method III和IV and the corresponding mass spectroscopy

雖然EI是最便捷快速的一種質(zhì)譜方法，但電子轟擊源能量較高，裂解碎片較多。用裂解碎片方式來了解化合物性質(zhì)也不是本研究的目的。軟電離ESI質(zhì)譜更適合本研究所進(jìn)行的紅曲紅色素的篩選工作。通過ESI質(zhì)譜輔助，篩選出分子離子峰為332.6的一種未見報道的紅曲紅色素，確定該色素的分離、純化實(shí)驗(yàn)條件為：甲醇為淋洗劑對紅曲米進(jìn)行柱色譜分離，以正己烷、乙酸乙酯和甲醇為萃取劑進(jìn)行一次索氏提取，然后以CH2Cl2∶CH3OH=1∶1為展開劑進(jìn)行薄層色譜分離，收集Rf=0.8的色帶，最后以CH3CH2OH∶CCl4=9∶1為展開劑進(jìn)行第二次薄層色譜分離，Rf=0.8的色帶為目標(biāo)分子，收率0.012 6%。本文的研究為今后食品加工中對分離、檢測不同品種，不同批次的紅曲米中的紅曲色素提供了參考。

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MS Methods Assist Separation and Purification of A New Kind of Monasucs

LIU Li-zeng，MENG Xian-fang，BAI Zheng-chen，WANG Li
（School of Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China）

Commercial monascus red pigments were used as the raw material，the influence of the freezing temperature，Soxhlet extraction，solvents，column chromatography and thin layer chromatography separation process assisted by the use of mass methods were studied in details.A new kind of monasucs was screened out from the raw materials，the molecular ion peak located at 332.5.The experimental conditions for the purification of the monascus was：Before the Soxhlet extraction which hexane，ethyl acetate and methanol as the separated solvents，the red yeast rice subjected to column chromatography by the methanol used as the eluent.Then CH2Cl2∶CH3OH=1∶1 were used as the eluent for the thin layer chromatography（Rf=0.8）.Finally，a second thin layer chromatography were carried out to collect the the target molecule bond（Rf=0.8）in which the CH3CH2OH∶CCl4=9∶1 were used as the corresponding eluents，yield 0.0126%.

monascus；separation；mass spectrometry；thin-layer chromatography

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.16.015

2014-09-03

劉立增（1973—），男（漢），講師，博士，研究方向：食品科學(xué)。