煙草環(huán)斑病毒抗體及DAS-ELISA試劑盒的研制

李桂芬 魏梅生 馬潔 張永江

（中國檢驗檢疫科學研究院 北京 100121）

煙草環(huán)斑病毒抗體及DAS-ELISA試劑盒的研制

李桂芬 魏梅生 馬潔 張永江

（中國檢驗檢疫科學研究院 北京 100121）

將純化的煙草環(huán)斑病毒免疫家兔獲得多克隆抗體；免疫BALB/c小鼠，用雜交瘤細胞技術獲得1株分泌煙草環(huán)斑病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株并制備腹水抗體。以戊二醛為交聯(lián)劑，采用兩步法將煙草環(huán)斑病毒單克隆抗體用堿性磷酸酯酶標記，研制了煙草環(huán)斑病毒DAS-ELISA試劑盒。

煙草環(huán)斑病毒；多克隆抗體；單克隆抗體；DAS-ELISA試劑盒

1 前言

煙草環(huán)斑病毒（Tobacco ringspot virus，TRSV）是豇豆花葉病毒科線蟲傳多面體病毒屬的代表種，是我國的進境檢疫性有害生物。它可侵染54科300多種植物，自然寄主有豆類、瓜類、花卉、果樹和煙草等重要的經(jīng)濟作物。TRSV侵染造成的損失非常嚴重，大豆產(chǎn)量損失50%以上，菜豆減產(chǎn)30%-50%，茄子可達55%-70%［1］。

TRSV可通過種子、嫁接、機械接種、媒介等多種途徑傳播，大豆種傳率達到100%。此外，病毒還可通過種子和無性繁殖材料的貿(mào)易進行遠距離傳播，我國檢疫部門多次從進境植物種子和無性繁殖材料中截獲該病毒［2-7］。

TRSV的檢測方法國內外研究較多，如斑點免疫金和免疫金/銀染色法［8］、膠體金免疫層析法［9］、番茄環(huán)斑病毒和TRSV復合型膠體金免疫層析試紙條［10］、磁免疫層析試紙條［11］、一步法RT-PCR檢測TRSV試劑盒［12］、巢式PCR［13］、RT-Realtime PCR［14］和ICRT-Realtime PCR檢測方法［15］。在TRSV實際的檢測工作中，由于酶聯(lián)免疫方法快速、簡單而被廣泛應用。目前國內TRSV檢測試劑盒主要依賴國外進口，本研究通過常規(guī)方法純化TRSV，制備多克隆和單克隆抗體，采用堿性磷酸酯酶標記單克隆抗體方法，以期研制靈敏度高、特異性好的TRSV DAS-ELISA試劑盒。

2 材料與方法

2.1材料

2.1.1毒源

TRSV：從ATCC引進5株毒源，編號分別為PV-97、PV-98、PV-125、PV-157、PV-172，接種在白肋煙（Nicotiana tobacum cv.White Burley）上，放置在隔離溫室中。

南芥菜花葉病毒（Arabis mosaic virus，ArMV）：從ATCC引進，編號PV-192，接種在昆諾藜（Chenopodium quinoa）上，放置在隔離溫室中。

番茄環(huán)斑病毒（Tomato ringspot virus，ToRSV）：從ATCC引進，編號PV-239，接種在番杏（Tetragonia expansa）上，放置在隔離溫室中。

番茄黑環(huán)病毒（Tomato black ring virus，TBRV）：從DSMZ引進，編號PV-0070，接種在昆諾藜上，放置在隔離溫室中。

2.1.2試劑

巰基乙醇：購自AMRESCO，化學純；硼酸、四硼酸鈉：均購自國藥集團化學試劑有限公司，分析純；Tritonx-100：購自Sigma，分析純；PEG：日本進口，化學純，MW6000；氯化鈉：購自國藥集團化學試劑有限公司，分析純；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）：購自國藥集團化學試劑有限公司，分析純；蔗糖：購自AMRESCO，純度≥99.9%。A蛋白柱、G蛋白柱：GE公司；堿性磷酸酯酶：Sigma公司，產(chǎn)品目錄號為P6774-10KU；戊二醛：Alfa Aesar公司，產(chǎn)品目錄號為：A17876。

2.1.3儀器設備

組織搗碎機：Waring；Avanti J-26XPI離心機、Optima L-100XP離心機：BECKMAN。

2.2方法

2.2.1病毒繁殖與純化

將PV-125接種在白肋煙上，20 d采收病葉。200 g病葉加600 mL 0.5 mol/L硼酸鹽緩沖液（pH 8.4，含0.2%巰基乙醇），用組織搗碎機勻漿，雙層紗布過濾后離心（Avanti J-26XPI離心機，9605×g、10min），取上清緩慢加入Tritonx-100至1%，PEG至8%，氯化鈉至3%；4℃攪拌3 h，靜置1 h，離心（Avanti J-26XPI離心機，15008×g、30 min；沉淀懸浮于0.01 mol/L硼酸鹽緩沖液（pH 8.4，含0.001 mol/L EDTA）中，4℃攪拌過夜后離心（Avanti J-26XPI離心機，9605×g、10 min）；棄沉淀，上清離心（Optima L-100XP離心機，160070×g、210 min），沉淀懸浮于0.01 mol/L硼酸鹽緩沖液（pH 8.4，含0.001 mol/L EDTA）中，4℃攪拌過夜后離心（Avanti J-26XPI離心機，2860×g、10 min）；棄沉淀，上清經(jīng)10%-40%蔗糖密度梯度離心（Optima L-100XP離心機，160070×g、160 min），吸取病毒帶，即為病毒純化制劑，測紫外。用免疫誘捕方法制作電鏡片觀察純化病毒［16］（用Agdia公司TRSV酶聯(lián)檢測試劑盒中的包被抗體稀釋20倍后使用）。

2.2.2家兔免疫、多克隆抗體效價測定及純化

用純化的TRSV制劑免疫家兔，免疫方法見文獻［17］；效價測定采用間接ELISA方法，包被抗原為濃度4 μg/mL純化的TRSV；用A蛋白柱進行抗體純化。

2.2.3單克隆抗體制備及純化

將純化的TRSV制劑免疫8周齡的BALB/c小鼠，具體方法和TRSV純化病毒用量參見文獻［18］；細胞融合、雜交瘤細胞的篩選和克隆化、腹水抗體的制備按常規(guī)方法［19］；腹水抗體用G蛋白柱進行純化。

2.2.4DAS-ELISA檢測方法的建立

2.2.4.1堿性磷酸酯酶標記的TRSV單克隆抗體的制備

取100 μL堿性磷酸酯酶加入到300 μL的0.01M PBS（pH 7.2）中，再加入10 μL 25%的戊二醛混勻，室溫（25℃）孵育活化1h，再加入0.5 mg TRSV單克隆抗體室溫反應2 h，即獲得堿性磷酸酯酶標記的TRSV單克隆抗體。

2.2.4.2DAS-ELISA檢測方法的建立

TRSV多克隆抗體濃度和酶標單克隆抗體稀釋度的確定：分別以TRSV多克隆抗體1 μg/mL、2 μg/ mL為包被抗體，與TRSV酶標單抗1∶250、1∶500、1∶1000稀釋度組合成DAS-ELISA檢測試劑盒，以確定最佳使用濃度。

2.2.4.3DAS-ELISA試劑盒檢測靈敏度

將TRSV提純病毒按一定濃度稀釋以確定試劑盒檢測提純病毒靈敏度；將感染TRSV（PV-125）的白肋煙病葉做一定比例稀釋以確定試劑盒檢測病汁液的靈敏度。

2.2.4.4DAS-ELISA試劑盒的特異性

用DAS-ELISA試劑盒檢測ArMV、TBRV、ToRSV以確定是否與上述病毒有交叉反應。

2.2.4.5DAS-ELISA試劑盒與ATCC毒源的反應

用DAS-ELISA試劑盒檢測ATCC毒源PV-97、PV-98、PV-125、PV-157、PV-172。

2.2.4.5DAS-ELISA試劑盒的穩(wěn)定性

試劑盒在4℃保存12個月后檢測PV-97、PV-98、PV-125、PV-157、PV-172、PV-0070、PV-192、PV239。

3 結果與討論

3.1結果

3.1.1病毒純化

純化的TRSV病毒經(jīng)紫外測定，呈典型的核蛋白吸收曲線，OD260nm=12.337，OD280nm=6.933，OD260nm/ OD280nm=1.78（見圖1）；濃度1.23 mg/mL；透射電子顯微鏡下可見28 nm的球狀病毒粒體（見圖2）。

圖1　純化TRSV的紫外吸收曲線

圖2　純化TRSV球狀病毒粒體

3.1.2多克隆抗體效價

TRSV兔多克隆抗體效價為1∶64000。

3.1.3雜交瘤細胞株及腹水效價

3次克隆化得到1株分泌TRSV單克隆抗體的雜交瘤細胞株2A9，腹水抗體效價為1∶106。

3.1.4DAS-ELISA檢測方法的建立

3.1.4.1多抗包被濃度和酶標單抗稀釋度的確定

酶聯(lián)結果見表1（加入底物后60 min OD405nm值）。經(jīng)比較，當多克隆抗體包被濃度2 μg/mL、單抗酶標稀釋度為1∶500時，病汁液OD405nm值與健康汁液OD405nm值比值24，且健康汁液OD405nm值較低，因此包被濃度2 μg/mL、單抗酶標稀釋度1∶500確定為試劑盒最佳組合濃度。

表1　DAS-ELISA試劑盒抗體濃度確定實驗

3.1.4.2DAS-ELISA試劑盒靈敏度

檢測純化病毒靈敏度見圖3。當純化病毒為15.625 ng/mL時的OD405nm值與健康白肋煙OD405nm值比值大于2，為陽性反應，因此檢測純化病毒靈敏度為15.625 ng/mL。

圖3　DAS-ELISA試劑盒檢測純化病毒靈敏度

試劑盒檢測病汁液靈敏度見圖4。當TRSV白肋煙病汁液稀釋倍數(shù)為1∶3200時的OD405nm值與健康白肋煙OD405nm值比值大于2，反應為陽性，因此檢測白肋煙病汁液的靈敏度為病汁液1∶3200稀釋。

圖4　DAS-ELISA試劑盒檢測TRSV白肋煙病汁液靈敏度

3.1.4.3DAS-ELISA試劑盒特異性

TRSV試劑盒的特異性反應見表2，從表2可看出，ArMV、TBRV、ToRSV與試劑盒反應均為陰性，不發(fā)生交叉反應。

表2　試劑盒的特異性

3.1.4.4DAS-ELISA試劑盒與ATCC毒源的反應

試劑盒與ATCC TRSV毒源反應見表3，從表3可看出，試劑盒與5種毒源均呈強陽性反應。

表3　試劑盒與ATCC毒源的反應

3.1.4.5DAS-ELISA試劑盒的穩(wěn)定性

試劑盒4℃保存12個月后與各病毒的反應見表4，從表4可看出，試劑盒與5個TRSV分離物均呈強陽性反應，與TBRV（PV-0070）、ArMV（PV-192）、ToRSV（PV-239）均呈陰性反應，試劑盒穩(wěn)定性好。

表4　試劑盒的穩(wěn)定性

3.2討論

在檢測試劑盒研制的過程中，以TRSV多克隆抗體為包被抗體、單克隆抗體為檢測抗體的三抗體夾心酶聯(lián)（TAS-ELISA）方法，其本底較高，效果不好；以單克隆抗體為包被抗體、多克隆抗體為檢測抗體的TAS-ELISA方法，其陽性樣品的讀數(shù)較低，容易出現(xiàn)假陰性。而把單克隆抗體用堿性磷酸酯酶標記的DAS-ELISA方法的本底低，陽性讀數(shù)高，檢測效果好。

4 結論

本研究用差速離心和蔗糖梯度離心方法得到了純化的TRSV病毒粒體，然后用純化病毒制劑免疫家兔和BALB/c小鼠制備了特異性好和效價高的多克隆和單克隆抗體，并研制了檢測TRSV的DASELISA試劑盒。該試劑盒能檢測濃度為15.625 ng/ mL純化病毒和稀釋3200倍的白肋煙病汁液，靈敏度高；與同屬的ArMV、TBRV、ToRSV不發(fā)生交叉反應，本底低；與5種TRSV毒源均為強陽性反應。因此，該試劑盒可應用于TRSV實際檢測中。

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Preparation of Antibody against Tobacco ringspot virus and DAS-ELISA Kit

Li Guifen，Wei Meisheng，Ma Jie，Zhang Yongjiang
（Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing，100121）

The purified virus of TRSV was used to immunize rabbit and polyclonal antibody was produced.One hybridoma cell line secreting monoclonal antibody against TRSV was produced by hybridoma technology.Alkaline phosphatase was conjugated with the monoclonal antibody by bifunctional linker glutaraldehyde，DAS-ELISA kit were produced.

Tobacco ringspot virus；Polyclonal Antibody；Monoclonal Antibody；DAS-ELISA Kit

S435.72

E-mail：liguifen2002@163.com

質檢公益性行業(yè)科研專項（201310071）

2015-03-16