葡萄多酚對果蠅壽命影響和小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的研究

張愛軍 臧家業(yè)

（國家海洋局第一海洋研究所，山東青島 266061）

葡萄多酚對果蠅壽命影響和小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的研究

張愛軍 臧家業(yè)

（國家海洋局第一海洋研究所，山東青島 266061）

目的，研究葡萄多酚對果蠅壽命的影響以及降低小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的作用。方法 用葡萄多酚樣品喂食果蠅，以高、中、低三種劑量的原花青素喂食小鼠45d，對照組給予等體積的蒸餾水，測定各項(xiàng)指標(biāo)。結(jié)果，果蠅生存試驗(yàn)陽性。0.015%和0.045%的原花青素對雄性和雌性果蠅的最高壽命和平均壽命與對照比較均有顯著延長作用（P＜0.01）。0.002%和0.005%的原花青素劑量組與對照組比較最高壽命和平均壽命均無顯著差別（P＞0.05）。對小鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高劑量組與老齡對照組比較， MDA含量明顯降低，血清SOD活力明顯升高（P＜0.05）。結(jié)論，表明該物質(zhì)對果蠅的最高壽命和平均壽命都有明顯延長作用，對小鼠具有降低脂質(zhì)過氧化作用。

葡萄多酚 果蠅 壽命 脂質(zhì) 過氧化作用

葡萄多酚（Grape Proanthocyanidins， GPC）是從葡萄籽中提取的多酚類化合物［1］。主要含低聚原花青素（O l i g o m e r i c Proanthocyanidins），原花青素?fù)碛袕?qiáng)有力的抗氧化能力，在體內(nèi)其抗氧化、清除自由基能力是維生素E的50倍、維生素C的20倍［2］。國外關(guān)于原花青素的功能研究較多，在日本厚生省已于1996年批準(zhǔn)把葡萄多酚列入《天然食品劑名單中》［3，4］。近幾年，國內(nèi)葡萄多酚的研究也逐步熱起來，將葡萄多酚開發(fā)成為保健品或藥品，必需進(jìn)行相關(guān)的生物安全性分析評價(jià)。因此，本文開展了葡萄多酚毒理學(xué)研究，為葡萄多酚開發(fā)應(yīng)用保健品或藥品提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

（1）樣品，紅棕色粉劑（水分4.4%，灰分1.3%，原花青素93.62 %），青島海隆達(dá)生化科技有限公司。原花青素標(biāo)準(zhǔn)品，sigma公司提供。（2）試驗(yàn)動(dòng)物，黑腹果蠅，OreganK品系，山東師范大學(xué)生物系；健康二級昆明種雄性15月齡老齡鼠和8周少齡小鼠，山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。（3）劑量選擇，以果蠅為研究動(dòng)物的劑量選擇：設(shè)1個(gè)空白對照組和4個(gè)劑量組，各劑量組含原花青素分別為0.002%、0.005%、0.015 %、0.045%。以小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物的劑量選擇：原花青素成人推薦量為120mg/kg·b.w（成年人體重按60kg計(jì)算）。分別擴(kuò)大3、10和30倍作為低（360 mg/kg·b.w）、中（1200 mg/kg·b.w）和高劑量（3600 mg/ kg·b.w）老齡鼠實(shí)驗(yàn)組，另設(shè)老齡對照組和少齡對照組，每組動(dòng)物10只。用蒸餾水將樣品配制所需濃度，連續(xù)經(jīng)口灌胃45d，對照組給予等體積的蒸餾水，測定各項(xiàng)指標(biāo)。（4）主要儀器和試劑，生化培養(yǎng)箱（25±0.5℃，濕度60%～65%）、培養(yǎng)指管、乙醚、丙酸；960-熒光分光光度計(jì)、722分光光度計(jì)、離心機(jī)、混旋器、微量加樣器、恒溫水浴鍋；6.7g/L硫代巴比妥酸TBA－冰醋酸（1：1）混合液、10nmol/ml四乙氧基丙烷、100g/L磷鎢酸、10mmol/L鹽酸羥胺、7.5mmol/L黃嘌呤、0.023u/ml黃嘌呤氧化酶、10g/L甲萘胺、3.3g/L對氨基苯磺酸、3g/L磺基水楊酸、SOD標(biāo)準(zhǔn)品等。

表1　原花青素對果蠅生存時(shí)間的影響

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1葡萄多酚對果蠅壽命影響的研究方法

（1）果蠅飼料配制，用玉米粉、白糖、瓊脂、丙酸、干酵母粉分別以8.5%、6.5%、1.0%、0.5%、0.75%的比例用蒸餾水配制成基礎(chǔ)飼料。按劑量分組要求，稱取原花青素加入到溶化的基礎(chǔ)飼料中，充分調(diào)勻，配制成試驗(yàn)飼料。調(diào)pH值使各組一致。（2）擴(kuò)增果蠅，在裝有基礎(chǔ)飼料的指管中放入雌雄各半20只果蠅，25℃恒溫箱內(nèi)飼養(yǎng)。（3）分組試驗(yàn)，從上述指管中每日定時(shí)挑選8h內(nèi)孵出的成蟲，乙醚麻醉后稱體重，分組，每管20只，雌雄分養(yǎng)，每組雌雄各200只。在成蟲期空白對照組給予基礎(chǔ)飼料，試驗(yàn)組給予含不同劑量受試物的試驗(yàn)飼料。每天定時(shí)統(tǒng)計(jì)果蠅存活數(shù)、死亡數(shù)，直到全部死亡。每組最后死亡的20只果蠅成蟲存活天數(shù)的平均數(shù)，為該組的最高壽命。每組全部果蠅成蟲存活天數(shù)的平均數(shù)，為該組的平均壽命。試驗(yàn)結(jié)束，計(jì)算平均壽命，最高壽命及半數(shù)死亡時(shí)間。

1.2.2葡萄多酚小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的研究方法

（1）全血中過氧化脂質(zhì)降解物丙二醛（MDA）含量測定。

樣品制備：取全血50ul加入1ml生理鹽水，2000r/min離心10min，取上清液待測。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：將10nmol/ml四乙氧基丙烷，用蒸餾水稀釋成0.25、0.5、1、1.5、2和5nmol/ml，分別取1ml加入TBA－冰醋酸（1：1）混合液1ml，混勻，沸水浴75min，流水冷卻至室溫，加5ml正丁醇振蕩提取2min，3000r/min離心10min，取上清液（正丁醇層）用熒光光度計(jì)測熒光強(qiáng)度（狹縫10nm，激發(fā)光波廠515nm，發(fā)射光波長553nm）。

全血樣品測定：全血樣品上清液0.5ml，加入1/6mol/L硫酸4ml、100g/L磷鎢酸0.5ml搖勻，室溫放置5min，3000r/min離心10min，棄上清液，沉淀加1/6mol/L硫酸2ml、100g/L磷鎢酸0.3ml搖勻，室溫放置5min， 3000r/min離心10min，棄上清液，沉淀加1ml蒸餾水振搖2min，以下操作步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)以濃度0.5 nmol/ ml的四乙氧基丙烷為標(biāo)準(zhǔn)對照。

全血MDA含量計(jì)算：MDA含量（nmol/ml）=0.5×f/F×1/ 0.05×1.05/0.5

式中F：0.5nmol/ml四乙氧基丙烷熒光強(qiáng)度；

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f：樣品熒光強(qiáng)度。

（2）血清中超氧化物歧化酶（SOD）活力測定（羥胺法）。

血清樣品制備：取全血50ul，制備血清待測。

血清中SOD活力測定：依次取1/15mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.8）1.0ml，血清樣品20ul，10mmol/L鹽酸羥胺0.1ml，7.5mmol/L黃嘌呤0.1ml，0.023u/ml黃嘌呤氧化酶0.1ml，雙蒸水0.5ml加入到試管內(nèi)混勻，37℃恒溫水浴30min，再加入3.3g/L對氨基磺酸2.0ml，10g/L甲萘胺2.0ml，混勻，常溫放置15min，倒入1cm光徑比色杯，以蒸餾水調(diào)零，530nm處比色測定OD值，同時(shí)進(jìn)行空白對照測定。

SOD活力的計(jì)算：按以下公式計(jì)算SOD百分抑制率：SOD百分抑制率=（對照管OD－測定管OD）/對照管OD×100%按每ml反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對應(yīng)的SOD量為一個(gè)單位，按以下公式計(jì)算SOD的活力：

SOD活力（u/ml）=SOD百分抑制率/50%×樣品稀釋倍數(shù)（3）統(tǒng)計(jì)處理：采用方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2　結(jié)果

2.1原花青素對果蠅壽命影響的結(jié)果

2.2原花青素對小鼠全血中過氧化脂質(zhì)降解物丙二醛（MDA）含量的影響

表1顯示，經(jīng)口給予老齡小鼠原花青素45d，老齡對照組MDA236.5 ±38.9nmol/ml，少齡對照組MDA167.6±37.4nmol/ml，低劑量組MDA233.9±33.4nmol/ml，中劑量組MDA223.4±42.8nmol/ml，高劑量組MDA189.0±37.4*nmol/ml。（注：* P＜0.05，高劑量實(shí)驗(yàn)組與老齡對照組比較）

高劑量組與老齡對照組比較，全血MDA含量明顯降低（P＜0.05），低劑量組和中劑量與老齡對照組比較，全血MDA含量差異無顯著性。

注：* P＜0.05，高劑量實(shí)驗(yàn)組與老齡對照組比較

2.3原花青素對老齡小鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）活力的影響

結(jié)果顯示，老齡對照組SOD208.1±8.2u/ml，少齡對照組279.2±14.9u/ml，低劑量組215.4±11.2u/ml，中劑量組225.1 ±18.0u/ml，高劑量組247.6±22.6*u/m。（注：* P＜0.05，高劑量實(shí)驗(yàn)組與老齡對照組比較）

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)口給予老齡小鼠原花青素45d，高劑量組與老齡對照組比較，血清中超氧化物歧化酶（SOD）活力明顯增高（P＜0.05），低劑量組和中劑量與老齡對照組比較，血清中SOD活力差異無顯著性。

3　結(jié)語

（1）用不同濃度的原花青素飼喂黑腹果蠅，研究原花青素對果蠅壽命的影響。結(jié)果表明，0.015%和0.045%的劑量組和對照組比較，果蠅的最高壽命和平均壽命都有明顯延長，生存試驗(yàn)陽性。然而，0.002 %和0.005%的原花青素劑量組與對照組比較最高壽命和平均壽命均無顯著差別，說明該物質(zhì)只有達(dá)到一定含量才能起到延長壽命的作用。

（2）經(jīng)口給予小鼠原花青素45天，高劑量組與老齡對照組比較，MDA含量明顯降低，血清SOD活力明顯升高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，原花青素有降低脂質(zhì)過氧化作用。

（3）原花青素之所以能夠延長壽命，可能與其擁有強(qiáng)有力的抗氧化能力有關(guān)［5］。研究表明，原花青素在體內(nèi)其抗氧化、清除自由基能力是維生素E的50倍、維生素C的20倍［6］。原花青素制品在歐美等西方國家市場非常走俏，一瓶60粒膠囊（每粒含原花青素50毫克）售價(jià)為23.95美元，而每粒含100毫克的原花青素一瓶售價(jià)為39.95美元，原花青素在保健品中市場零售價(jià)高達(dá)4.48萬元/千克。我國目前未有以原花青素為主要有效成份的藥品、保健品的開發(fā)才剛剛開始，目前的用量很少。但由于其明顯的生物活性效應(yīng)和使用效果，必將在食品添加劑，保健品，化妝品，藥品等方面得到廣泛的應(yīng)用，需求逐漸增加，具有相當(dāng)強(qiáng)勁的市場前景和經(jīng)濟(jì)效益。

［1］王傳現(xiàn)，鐘進(jìn)義.葡多酚對活性氧自由基的清除作用研究.營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2001，23（2）：170-173.

［2］鐘進(jìn)義，栗世如.葡多酚對小鼠DNA與染色體放射性損傷的防護(hù)作用［J］.中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志，1999，17：211-213.

［3］ Ricardo-Da-Silva LM， Rigaud J， Cheynier V， et al. Procyanidin dimmers and trimers from grape seeds［J］. Phytochemistry，1991，30（4）：1259-1264.

［4］Kanner J， Frankel E， Granio R， et al. Natural antioxidants in grapes and wines ［J］. J Agric FoodChem， 1994，42：64-68.

［5］王傳現(xiàn)，鐘進(jìn)義.葡多酚對活性氧自由基的清除作用研究.營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2001，23（2）：170-173.

［6］中國制藥信息.1998，4.