不同磷酸氫二鈉濃度對(duì)谷氨酸發(fā)酵的影響

臧傳剛，梁恒宇，*，王宏齡，郝小明，王曉健，林海龍，陳博

（1.中糧營養(yǎng)健康研究院，北京100020；2.中糧生化能源（龍江）有限公司，黑龍江齊齊哈爾161100）

不同磷酸氫二鈉濃度對(duì)谷氨酸發(fā)酵的影響

臧傳剛1，梁恒宇1，*，王宏齡2，郝小明1，王曉健2，林海龍1，陳博1

（1.中糧營養(yǎng)健康研究院，北京100020；2.中糧生化能源（龍江）有限公司，黑龍江齊齊哈爾161100）

以谷氨酸工業(yè)菌株S9114為研究對(duì)象，在搖瓶培養(yǎng)條件下，研究不同濃度磷酸鹽對(duì)谷氨酸發(fā)酵的影響，找到更適合該菌株產(chǎn)酸的磷酸氫二鈉濃度范圍，然后對(duì)該范圍內(nèi)磷酸氫二鈉濃度谷氨酸發(fā)酵過程中主要指標(biāo)進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究。結(jié)果表明，2.095 mmol/L的磷酸氫二鈉濃度與工業(yè)上普遍采用的磷酸氫二鈉濃度6.280 mmol/L相比，生物量、谷氨酸產(chǎn)酸濃度和轉(zhuǎn)化率均得到顯著提高。

谷氨酸；磷酸氫二鈉；谷氨酸棒桿菌；S9114；發(fā)酵

磷主要以正磷酸鹽（Pi）、焦磷酸（PPi）或聚磷酸（polyPi）等無機(jī)化合物，以及核酸、磷酸糖、磷酸化蛋白和磷脂等有機(jī)磷形式存在于細(xì)胞內(nèi)［1］。細(xì)胞中主要的含磷組分是DNA、RNA和polyPi等多聚化合物。但是，最易于細(xì)胞吸收的磷源是正磷酸鹽。許多微生物進(jìn)化出根據(jù)可利用磷源物質(zhì)的實(shí)際情況而進(jìn)行細(xì)胞代謝的調(diào)控機(jī)制［2］。例如，當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境中Pi足量時(shí)，微生物會(huì)大量生成polyPi。在微生物細(xì)胞內(nèi)合成polyPi的關(guān)鍵酶是多聚磷酸激酶（PPK）。PPK催化ATP的末端磷酸殘基連接到polyPi分子一端。而當(dāng)Pi源不足時(shí)，PPK酶同樣可以polyPi為底物，逆向反應(yīng)生成ATP、GTP等含高能磷酸鍵物質(zhì)［3］。

谷氨酸棒桿菌是一種革蘭氏陽性短桿菌，其基因組具有較高的G+C含量。磷是谷氨酸棒桿菌細(xì)胞中主要組成元素之一，約占其細(xì)胞干重的1.5%～2.1%［1］。磷在谷氨酸棒桿菌中心碳代謝和能量代謝過程中扮演核心角色，這是因?yàn)樵S多酶反應(yīng)，如3-磷酸甘油醛脫氫酶和F1F0-ATP合酶，需要以磷酸鹽為底物［4］。而許多反應(yīng)所需的關(guān)鍵酶活性受到磷濃度的調(diào)控，如磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油酸激酶和丙酮酸激酶。同時(shí)，由底物磷酸化獲得的自由能將貯存在由ADP和Pi合成的ATP中。此外，許多重要的細(xì)胞調(diào)控機(jī)制依靠磷元素，例如在雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)中［1］。

有關(guān)谷氨酸棒桿菌中磷代謝的研究起步較晚，在國內(nèi)這方面的研究更為有限。培養(yǎng)條件中磷酸鹽的濃度會(huì)顯著影響谷氨酸棒桿菌的生長及基因的轉(zhuǎn)錄水平。谷氨酸棒桿菌磷（磷酸或磷酸鹽）的半速率常數(shù)約為0.10 mmol/L［4］。在磷受限（0.10 mmol/L）和磷充足（13.00 mmol/L）的條件下，谷氨酸棒桿菌的轉(zhuǎn)錄組圖譜明顯不同［4］。磷在谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中同樣起著重要作用，但僅有少數(shù)研究對(duì)磷酸鹽種類［5-6］和用量［7］對(duì)谷氨酸發(fā)酵的影響進(jìn)行了優(yōu)化。

本研究首先考察了不同磷酸鹽濃度（從谷氨酸棒桿菌磷源受限濃度0.10 mmol/L到磷源充足濃度13.00 mmol/L）對(duì)谷氨酸發(fā)酵的影響，從中找到更適合谷氨酸發(fā)酵磷酸鹽濃度的理想范圍。然后對(duì)該濃度范圍內(nèi)磷酸鹽對(duì)谷氨酸發(fā)酵影響與目前工業(yè)發(fā)酵所用濃度進(jìn)行了動(dòng)態(tài)比較研究。

1材料與方法

1.1菌株和試劑

谷氨酸生產(chǎn)菌株S9114：由中糧生化能源（龍江）有限公司味精生產(chǎn)部提供；葡萄糖、尿素、Na2HPO3· 12H2O、氯化鉀、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、（NH4）2SO4、苯酚紅和氨水等均為分析純：購自北京化工廠；玉米漿和糖蜜：由中糧生化能源（龍江）有限公司提供。

1.2培養(yǎng)基

1.2.1種子培養(yǎng)基

葡萄糖，0.222 mol/L（40g/L）；（NH4）2SO4，0.114mol/L（約15g/L）；Na2HPO3·12H2O，4.190 mmol/L；KCl，17.785 mmol/L；MgSO4·7H2O，2.029 mmol/L；玉米漿，8.3 mL/L；糖蜜，2.5 g/L；MnSO4·H2O，7.4×10-6mmol/L；用20%NaOH調(diào)節(jié)pH至7.2±0.20。分裝30 mL于250 mL帶擋板三角搖瓶中，121℃-15 min滅菌后冷卻備用。

1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)基

初步優(yōu)化培養(yǎng)基：葡萄糖，0.444 mol/L（80 g/L）；KCl，60.402mmol/L；MgSO4·7H2O，3.287mmol/L；玉米漿，560 μL/L；糖蜜，0.4 g/L；MnSO4·H2O，7.4×10-6mmol/L；在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0.100、0.628、2.095、4.190、6.280、8.380、13.000 mmol/L的Na2HPO3·12H2O；用濃度為25%的氨水將pH調(diào)至7.20±0.20。

生產(chǎn)驗(yàn)證培養(yǎng)基：葡萄糖，0.777 mol/L（140 g/L）；KCl，60.402mmol/L；MgSO4·7H2O，3.287mmol/L；玉米漿，560μL/L；糖蜜，0.4g/L；MnSO4·H2O，7.4×10-6mmol/L；在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0.628、1.254、2.095、6.280 mmol/L的Na2HPO3·12H2O；用濃度為25%的氨水將pH調(diào)至7.20±0.20。

以上培養(yǎng)基吸取15 mL加入到250 mL帶擋板的三角搖瓶內(nèi)，121℃滅菌15 min后冷卻備用。

1.3儀器與設(shè)備

PT-15型手持式數(shù)顯pH計(jì)：德國Satorius；ZWY-2102C型恒溫振蕩搖床：上海智誠；SW-CJ-IFD型凈化工作臺(tái)：蘇凈安泰；SBA-40E型生物傳感分析儀：山東濟(jì)南；UV-1750型分光光度計(jì)：日本Shimadzu；Centrifuge 5418型高速離心機(jī)：德國Eppendorf；Milli-Q型超純水分析儀：美國Millipore；CX31型顯微鏡：日本Olympus；9400V型超低溫冰箱：美國Thermofisher；SX-700型全自動(dòng)高壓滅菌鍋：日本Tomy。

1.4方法

1.4.1種子培養(yǎng)

從低溫冰箱中取出一支S9114谷氨酸生產(chǎn)菌種凍存管，融化后將菌液加入滅菌后的種子培養(yǎng)基中。種子培養(yǎng)液于（32±0.5）℃下150 r/min振蕩培養(yǎng)8 h，初始pH為7.20±0.20；在發(fā)酵過程中每隔2小時(shí)流加20 μL稀氨水（濃氨水∶水=1∶1）。

1.4.2發(fā)酵培養(yǎng)

將1.5 mL種子液加入無菌的2 mL離心管中，4 000 r/min離心5 min后去除上清液，再接種到初步優(yōu)化培養(yǎng)基中，然后將搖瓶放在搖床中振蕩培養(yǎng)，初始溫度為32℃，初始轉(zhuǎn)速為180 r/min，培養(yǎng)過程中不同發(fā)酵時(shí)間培養(yǎng)溫度和轉(zhuǎn)速設(shè)定見表1。

表1　不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵溫度及搖床轉(zhuǎn)速Table 1Fermentation temperature and shaker speed at different time

每隔1 h用精密pH試紙檢測(cè)發(fā)酵液pH，并適當(dāng)流加20%濃度的尿素溶液，以維持近中性的培養(yǎng)條件并增加氮源，直至培養(yǎng)24 h后至發(fā)酵終點(diǎn)。每組試驗(yàn)作2次重復(fù)，每次重復(fù)試驗(yàn)做2個(gè)平行。

將1.5 mL種子液接種到生產(chǎn)驗(yàn)證培養(yǎng)基中。然后將搖瓶放在搖床中振蕩培養(yǎng)，初始溫度為32℃，初始轉(zhuǎn)速為180 r/min，隨著發(fā)酵時(shí)間培養(yǎng)溫度和轉(zhuǎn)速不同設(shè)定見表1。每隔1 h用精密pH試紙檢測(cè)發(fā)酵液pH，并適當(dāng)流加20%濃度的尿素溶液，以維持近中性的培養(yǎng)條件并增加氮源，直至培養(yǎng)32 h后至發(fā)酵終點(diǎn)。每組試驗(yàn)作2次重復(fù)，每次重復(fù)試驗(yàn)做3個(gè)平行。

1.4.3OD值的測(cè)定

采用比濁法，樣品稀釋25倍后在620 nm條件下利用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

1.4.4谷氨酸濃度的測(cè)定

采用生物傳感分析儀法，樣品稀釋25倍后12 000 r/min離心5 min取上清測(cè)定。

1.4.5葡萄糖濃度的測(cè)定

采用生物傳感分析儀法，樣品稀釋25倍后12 000 r/min離心5 min取上清測(cè)定。

1.4.6轉(zhuǎn)化率的計(jì)算

式中：C酸t(yī)h為t小時(shí)時(shí)發(fā)酵液中谷氨酸的濃度；Vth為t小時(shí)時(shí)發(fā)酵液的體積；C糖0h為發(fā)酵液中初始葡萄糖濃度；V0h為發(fā)酵液的初始體積；C糖th為t小時(shí)時(shí)發(fā)酵液中葡萄糖的濃度。

1.4.7數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理及ANOVA統(tǒng)計(jì)分析由SPSS 17.0軟件完成。

2結(jié)果與分析

2.1不同濃度磷酸鹽對(duì)谷氨酸發(fā)酵的影響

2.1.1不同濃度磷酸鹽對(duì)OD值的影響

某種微生物磷的半速率常數(shù)指的是微生物比生長速率等于該微生物最大比生長速率一半時(shí)磷的濃度，即Monod常數(shù)。谷氨酸棒桿菌磷的半速率常數(shù)約為0.10 mmol/L［4］。不同濃度磷酸氫二鈉對(duì)谷氨酸生產(chǎn)菌株OD值的影響見圖1所示。

圖1　不同試驗(yàn)組OD值的比較Fig.1Comparison of OD in different experimental groups

由圖1可知，磷酸鹽濃度為0.100 mmol/L時(shí)，谷氨酸棒桿菌生長受到顯著抑制，與其他試驗(yàn)組OD值（OD24h=17.49±0.21）相比明顯較低。隨著磷元素濃度的增加，OD值起初呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢(shì)，且在2.095 mmol/L試驗(yàn)組出現(xiàn)OD的峰值（OD24h=21.61± 0.51）；但在4.190 mmol/L時(shí)，OD值出現(xiàn)了一個(gè)比較顯著的下降，與磷添加量2.095 mmol/L試驗(yàn)組相比，其均值僅略高于磷元素0.100 mmol/L試驗(yàn)組；而6.280、8.380 mmol/L和13.000、2.095 mmol/L試驗(yàn)組出現(xiàn)峰值相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果表明磷的添加量過低會(huì)抑制生長，但OD的變化與磷的用量持續(xù)增長并不同步。

2.1.2不同濃度磷酸鹽對(duì)葡萄糖消耗的影響

當(dāng)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中含有0.444 mol/L（80 g/L）葡萄糖時(shí)，正常條件下24 h達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)，見圖2。

圖2　不同試驗(yàn)組葡萄糖消耗量的比較Fig.2Comparison of glucose consumptions in different experimental groups

從圖2中可以看出，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中磷濃度為谷氨酸棒桿菌半速率常數(shù)0.100 mmol/L時(shí)，菌株的耗糖能力顯著低于其他試驗(yàn)組，發(fā)酵到16 h和24 h時(shí)，培養(yǎng)基中還殘存（55.86±1.07）g/L和（41.71±0.94）g/L的葡萄糖，這與不同磷酸濃度對(duì)尿素使用量的影響情況相對(duì)應(yīng)（數(shù)據(jù)未列出）；當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中磷濃度為工業(yè)添加量的1/10（0.628 mmol/L）時(shí)，耗糖速率也低于除0.100 mmol/L的其他組，發(fā)酵16 h和24 h時(shí)，培養(yǎng)基中還殘存（26.51±0.18）g/L和（4.28±0.41）g/L的葡萄糖；然而，當(dāng)磷濃度為工業(yè)添加量的1/3（2.095 mmol/L）時(shí)，發(fā)酵16 h時(shí)培養(yǎng)基殘存的葡萄糖濃度卻顯著低于其他所有試驗(yàn)組，為（14.25±0.43）g/L，與工業(yè)添加量試驗(yàn)組相比（17.67±1.54 g/L）低了3.00 g/L左右；發(fā)酵24 h后，除磷酸添加量為0.100 mmol/L的試驗(yàn)組外，其他試驗(yàn)組發(fā)酵液中葡萄糖基本耗盡，且均低于5 g/L。

2.1.3不同濃度磷酸鹽對(duì)谷氨酸產(chǎn)量的影響

不同濃度磷酸鹽對(duì)谷氨酸產(chǎn)量的影響見圖3。

圖3　不同試驗(yàn)組谷氨酸產(chǎn)量的比較Fig.3Comparison of glutamate productions in different experimental groups

如圖3所示，與2.1.2中的試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)應(yīng)，糖耗速率快的試驗(yàn)組，其谷氨酸生成量較大。S9114菌株在磷酸氫二鈉添加量為2.095 mmol/L時(shí)，發(fā)酵16 h和24 h時(shí)谷氨酸產(chǎn)量分別為（30.69±0.91）g/L和（38.10± 1.13）g/L，顯著高于其他試驗(yàn)組。在磷元素受限濃度（0.100 mmol/L）實(shí)驗(yàn)條件下的谷氨酸產(chǎn)酸濃度不足或僅為最佳試驗(yàn)組的1/2，在16 h和24 h時(shí)分別為（9.69±0.27）g/L和（19.10±0.58）g/L。其他試驗(yàn)組發(fā)酵16 h和24 h結(jié)果均值雖不同，但相互間并無顯著差異。

從以上試驗(yàn)結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，磷酸鹽濃度受限不僅使谷氨酸棒桿菌生物量降低，同時(shí)也會(huì)影響糖耗及產(chǎn)酸。適當(dāng)提高磷酸鹽的濃度不僅促進(jìn)菌株增殖，而且促進(jìn)糖耗和產(chǎn)酸加速。然而，進(jìn)一步增加磷酸鹽的濃度并不能進(jìn)一步提高谷氨酸的產(chǎn)量，反而會(huì)使糖耗和產(chǎn)酸有所下降，在生產(chǎn)上也會(huì)增加額外的生產(chǎn)成本。因此，選擇0.628 mmol/L至2.095 mmol/L為最佳磷酸鹽添加濃度，對(duì)其在工業(yè)發(fā)酵條件下產(chǎn)酸的動(dòng)態(tài)與目前磷酸鹽工業(yè)添加量（6.280 mmol/L）進(jìn)行比較研究。

2.2不同磷酸鹽濃度培養(yǎng)條件下谷氨酸發(fā)酵主要參數(shù)的動(dòng)態(tài)變化

2.2.1不同磷酸鹽濃度培養(yǎng)條件下OD值的動(dòng)態(tài)變化

不同磷酸鹽濃度培養(yǎng)條件下OD值的動(dòng)態(tài)變化見圖4。

圖4　不同磷酸鹽濃度條件下OD值的動(dòng)態(tài)變化Fig.4Dynamic changes of OD values under different phosphate concentrations

圖4展示了在含有不同濃度磷酸氫二鈉的發(fā)酵培養(yǎng)基中，整個(gè)發(fā)酵過程中谷氨酸生產(chǎn)菌種OD值的變化。在發(fā)酵的前8 h，不同試驗(yàn)組生物量增長的趨勢(shì)比較相似，但8h以后各試驗(yàn)組OD值的變化逐漸顯現(xiàn)出差異。從圖上看出發(fā)酵12 h后各試驗(yàn)組進(jìn)入穩(wěn)定期，OD值增長趨于平緩。與其他試驗(yàn)組相比，磷酸氫二鈉添加量為2.095 mmol/L時(shí)OD值較大，而其他三組之間差異不顯著。

2.2.2不同磷酸鹽濃度培養(yǎng)條件下葡萄糖濃度的動(dòng)態(tài)變化

不同磷酸鹽濃度培養(yǎng)條件下葡萄糖濃度的動(dòng)態(tài)變化見圖5。

圖5　不同磷酸鹽濃度條件下葡萄糖濃度的動(dòng)態(tài)變化Fig.5Dynamic changes of glucose concentrations under different phosphate concentrations

從圖5中可以清晰看出，在谷氨酸發(fā)酵條件下，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長葡萄糖的濃度逐漸下降，但不同磷酸氫二鈉的濃度會(huì)影響耗糖速率。與工業(yè)生產(chǎn)條件（6.280 mmol/L）相比，將磷酸氫二鈉用量降低至1/3（2.095 mmol/L）可以從發(fā)酵中期（8 h后）提高耗糖速率。圖5表明，在發(fā)酵的前16 h磷酸氫二鈉1.254、2.095、6.280 mmol/L三個(gè)試驗(yàn)組葡萄糖濃度曲線無顯著差別；20 h后1.254、2.095 mmol/L試驗(yàn)組的葡萄糖濃度開始顯著低于工業(yè)對(duì)照組，但1.254 mmol/L試驗(yàn)組葡萄糖殘留濃度高于2.095 mmol/L試驗(yàn)組；發(fā)酵28 h時(shí)1.254 mmol/L和2.095 mmol/L試驗(yàn)組的葡萄糖濃度已經(jīng)降至（6.97±0.73）g/L和（1.37±0.26）g/L，顯著低于對(duì)照組的（17.12±5.31）g/L；發(fā)酵32 h后，1.254 mmol/L和2.095 mmol/L試驗(yàn)組的葡萄糖已經(jīng)耗盡，而對(duì)照組還殘留（2.36±0.53）g/L殘?zhí)恰?/p>

與1.254、2.095、6.280 mmol/L 3個(gè)試驗(yàn)組相比，將磷酸氫二鈉的濃度降至工業(yè)對(duì)照組用量的1/10（0.628 mmol/L）卻可以降低葡萄糖的糖耗速度，這一點(diǎn)從圖中可以明顯看出，直至32 h發(fā)酵終止時(shí)，該組仍殘留（10.98±0.86）g/L葡萄糖。

2.2.3不同磷酸鹽濃度培養(yǎng)條件下谷氨酸濃度的動(dòng)態(tài)變化

在發(fā)酵的前4 h，谷氨酸濃度增長比較平穩(wěn)；4 h后谷氨酸濃度開始快速增加，直至發(fā)酵結(jié)束，見圖6。

圖6　不同磷酸鹽濃度條件下谷氨酸濃度的動(dòng)態(tài)變化Fig.6Dynamic changes of glutamate concentrations under different phosphate concentrations

由圖6可知，發(fā)酵第8 h的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，6.280 mmol/L試驗(yàn)組與2.095 mmol/L試驗(yàn)組無顯著差異，卻顯著高于1.254 mmol/L試驗(yàn)組，三組谷氨酸濃度分別為（11.79±0.62）、（10.87±0.67）、（9.64±0.29）g/L；0.628 mmol/L試驗(yàn)組發(fā)酵8 h時(shí)谷氨酸濃度僅達(dá)到5.58g/L，顯著低于其他3個(gè)試驗(yàn)組數(shù)據(jù)。而從12 h開始工業(yè)對(duì)照組（6.280 mmol/L）的產(chǎn)酸濃度開始顯著低于1.254 mmol/L和2.095mmol/L試驗(yàn)組，甚至在20 h后工業(yè)對(duì)照組谷氨酸產(chǎn)酸濃度開始顯著低于0.628 mmol/L試驗(yàn)組。以上結(jié)果表明，磷元素量的微弱變化可以對(duì)谷氨酸生產(chǎn)菌株S9114的谷氨酸產(chǎn)量造成較大的影響。目前所采用的磷酸鹽濃度雖然在發(fā)酵初期有利于產(chǎn)酸，但從中后期開始，產(chǎn)酸能力卻開始下降。32 h發(fā)酵結(jié)束后0.628、1.254、2.095、6.280 mmol/L試驗(yàn)組谷氨酸產(chǎn)酸濃度分別為（61.28±0.86）、（69.50±0.87）、（69.77±1.61）、（54.63±1.90）g/L。與原工業(yè)生產(chǎn)所采用的磷酸氫二鈉濃度6.280 mmol/L相比，相對(duì)較低的磷酸氫二鈉濃度可以將S9114產(chǎn)酸濃度提高20%以上。

2.2.4不同磷酸鹽濃度培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)化率的動(dòng)態(tài)變化

不同磷酸鹽濃度培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)化率的動(dòng)態(tài)變化見圖7。

圖7　不同磷酸鹽濃度條件下轉(zhuǎn)化率的動(dòng)態(tài)變化Fig.7Dynamic changes of conversions of glucose to glutamate under different phosphate concentrations

通過圖7可以看出，磷酸鹽的添加量可以影響谷氨酸棒狀桿菌S9114的谷氨酸轉(zhuǎn)化率。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，各試驗(yàn)組轉(zhuǎn)化率持續(xù)增加，但增長情況有所差別。在發(fā)酵的前8 h轉(zhuǎn)化率隨著磷酸鹽濃度的增大而增加，發(fā)酵8 h時(shí)磷酸氫二鈉添加量為6.280、2.095、1.254、0.628 mmol/L 4個(gè)試驗(yàn)組谷氨酸轉(zhuǎn)化率均值分別為20.75%、18.29%、15.92%和12.69%；但發(fā)酵12 h后，工業(yè)添加量試驗(yàn)組（6.280 mmol/L）轉(zhuǎn)化率僅為21.45%，與8 h相比增長率急劇下降，其均值甚至低于0.628 mmol/L試驗(yàn)組（22.13%），此后工業(yè)對(duì)照組轉(zhuǎn)化率雖仍然持續(xù)增長，但轉(zhuǎn)化率均值始終顯著低于其他三個(gè)試驗(yàn)組；與工業(yè)對(duì)照組相似，發(fā)酵16 h后，磷酸鹽添加量為2.095 mmol/L的試驗(yàn)組轉(zhuǎn)化率增量顯著下降，顯著低于1.254 mmol/L而略高于0.628 mmol/L試驗(yàn)組，此后添加量為2.095 mmol/L的試驗(yàn)組轉(zhuǎn)化率始終低于1.254 mmol/L試驗(yàn)組；發(fā)酵20 h時(shí)，6.280、2.095、1.254和0.628 mmol/L 4個(gè)試驗(yàn)組谷氨酸轉(zhuǎn)化率均值分別為30.46%、36.71%、41.00%和39.55%；發(fā)酵24 h時(shí)的趨勢(shì)與20 h時(shí)一致；發(fā)酵28 h時(shí)，2.095、1.254、0.628 mmol/L3個(gè)試驗(yàn)組之間轉(zhuǎn)化率差距進(jìn)一步縮小，2.095 mmol/L試驗(yàn)組轉(zhuǎn)化率均值略低于1.254 mmol/L試驗(yàn)組，但略高于0.628 mmol/L試驗(yàn)組；32 h發(fā)酵終止后，6.280、2.095、1.254、0.628 mmol/L 4個(gè)試驗(yàn)組谷氨酸轉(zhuǎn)化率均值分別為40.28%、50.56%、50.36%和48.24%。

3結(jié)論與討論

以生物素濃度亞適量為誘導(dǎo)谷氨酸高產(chǎn)的條件時(shí)，谷氨酸生產(chǎn)菌株在整個(gè)發(fā)酵過程中將經(jīng)歷兩種明顯不同的細(xì)胞形態(tài)，即生長型和產(chǎn)酸型。生長型菌體是粗壯的短桿狀細(xì)胞。發(fā)酵7 h～10 h后，生物素處于貧乏狀態(tài)，生長型細(xì)胞開始向產(chǎn)酸型細(xì)胞轉(zhuǎn)變，此時(shí)細(xì)胞開始伸長、膨大，并伴隨產(chǎn)酸速率逐漸增加。到發(fā)酵的12 h～20 h，生物素基本耗盡，完成了生長型細(xì)胞向產(chǎn)酸型細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，此時(shí)OD值穩(wěn)定，谷氨酸產(chǎn)量仍持續(xù)增加直至發(fā)酵結(jié)束［8］。

在整個(gè)谷氨酸發(fā)酵過程中，磷源的量與菌體形變及生長速度有很大關(guān)系［9］。作為EMP途徑的必須元素，磷與谷氨酸棒桿菌ATP的形成直接相關(guān)；而胞內(nèi)ATP的周轉(zhuǎn)速度和細(xì)胞能量水平?jīng)Q定了EMP途徑中的葡萄糖消耗速率［10］。因此，在培養(yǎng)基中必需添加一定量的磷酸鹽才能保證菌體的正常生長。

在磷元素充足（13 mmol/L）和不足（0.13 mmol/L）條件下，谷氨酸棒桿菌ATCC13032的生長速率分別為0.30 h-1和0.16 h-1［4］。在缺乏無機(jī)磷源時(shí)，微生物細(xì)胞中的Pi、ADP和ATP濃度會(huì)迅速下降，這會(huì)降低與糖酵解相關(guān)的酶活性和代謝流以及磷酸烯醇式丙酮酸的含量，進(jìn)而導(dǎo)致葡萄糖消耗速率的降低［11］。與此同時(shí)谷氨酸棒桿菌胞內(nèi)開始生成5'-核苷酸酶UshA，該酶以AMP和UDP-葡萄糖為唯一磷源維持菌體的生長［2］。這就會(huì)影響細(xì)胞的碳代謝及能量代謝。轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究表明，當(dāng)磷源不足時(shí)谷氨酸棒桿菌細(xì)胞中有14個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降，其中包括12個(gè)核糖體蛋白編碼基因和1個(gè)轉(zhuǎn)錄起始因子基因［4］。這可以部分解釋在磷元素濃度受限情況下，谷氨酸生產(chǎn)菌株耗糖較慢的原因。本研究中當(dāng)磷元素為0.100 mmol/L時(shí)，葡萄糖消耗的情況與文獻(xiàn)報(bào)道的情況基本相同。

發(fā)酵培養(yǎng)基中磷源的量不僅影響谷氨酸生產(chǎn)菌株的生長，而且影響谷氨酸的代謝［1］。磷源不足會(huì)嚴(yán)重抑制谷氨酸生產(chǎn)菌株的生長和產(chǎn)物代謝；但如果磷源過量，雖有利于糖代謝的進(jìn)行，卻會(huì)抑制6-磷酸葡萄糖脫氫酶的活性，將胞內(nèi)代謝流轉(zhuǎn)向合成纈氨酸的方向，從而降低谷氨酸產(chǎn)量［6］。因此，培養(yǎng)基中磷酸鹽濃度適中是谷氨酸高產(chǎn)的重要條件之一。谷氨酸棒桿菌在胞內(nèi)最高可以吸收600 mmol/L的磷，并以polyPi的形式將無機(jī)磷貯存于細(xì)胞內(nèi)，以應(yīng)對(duì)可能遇到的極端生存環(huán)境［12］。有研究表明過表達(dá)多聚磷酸合成關(guān)鍵基因ppnK可以顯著提高賴氨酸產(chǎn)量［13］。但有報(bào)道稱谷氨酸的產(chǎn)量與細(xì)胞中polyPi的含量并不相關(guān)［14］。

本研究表明，與谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基原磷酸氫二鈉添加量6.280 mmol/L相比，當(dāng)搖瓶培養(yǎng)基中磷的濃度為1.254 mmol/L～2.095 mmol/L時(shí)更有利于谷氨酸生產(chǎn)菌株S9114的合成代謝，而2.095 mmol/L試驗(yàn)組最有利于菌株的生長。繼續(xù)增加磷酸鹽的濃度并不能提高谷氨酸的產(chǎn)量，甚至有些降低。尤其是在谷氨酸發(fā)酵的中后期，6.280 mmol/L磷酸氫二鈉濃度在發(fā)酵8 h后產(chǎn)酸濃度和轉(zhuǎn)化率開始低于其他試驗(yàn)組。這是否由于谷氨酸生產(chǎn)菌株胞內(nèi)積累過多polyPi會(huì)影響胞內(nèi)的電荷平衡，進(jìn)而影響谷氨酸產(chǎn)量還需進(jìn)一步研究。

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Effects of Different Levels of Disodium Hydrogen Phosphate on Glutamate Fermentation

ZANG Chuan-gang1，LIANG Heng-yu1，*，WANG Hong-ling2，HAO Xiao-ming1，WANG Xiao-jian2，LIN Hai-long1，CHEN Bo1
（1.COFCO Nutrition&Health Research Institude，Beijing 100020，China；2.COFCO Bio-chemical Energy（Longjiang）CO.，Ltd.，Qiqihar 161100，Heilongjiang，China）

Under flask culture conditions，the effects of different phosphate concentrations on industrial strain S9114 glutamate fermentation were discussed in this work.A more suitable range of disodium hydrogen phosphate concentration for glutamate yield was developed，then the dynamics of major indexes during glutamate fermentation processes were compared.Results showed that the concentration of glutamate and conversion rates of glucose to glutamate had been improved significantly under 2.095 mmol/L disodium hydrogen phosphate condition compared with 6.280 mmol/L，level commonly used in industrial production.

glutamate；disodium hydrogen phosphate；Corynebacterium glutamicum；S9114；fermentation

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.14.031

2014-06-05

國家973計(jì)劃項(xiàng)目子課題（工業(yè)和環(huán)境微生物抗酸和抗高溫元器件的構(gòu)建與性能評(píng)估，2013CB733901）；中糧集團(tuán)技術(shù)開發(fā)研究項(xiàng)目（龍江生化谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)水平的提升，2013-C2-T011）作者簡介：臧傳剛（1987—），男（漢），碩士，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。

梁恒宇（1980—），男（漢），工程師，博士，研究方向：食品生物技術(shù)、生物化工。