綠豆酯酶的固定化條件優(yōu)化

徐艷陽，呂燕婷，曾珊，于芮，付佳，李文強(qiáng)

（吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林長春130022）

綠豆酯酶的固定化條件優(yōu)化

徐艷陽，呂燕婷，曾珊，于芮，付佳，李文強(qiáng)

（吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林長春130022）

為了探索綠豆酯酶的固定化方法，對(duì)陰離子交換樹脂D261、D280、D301、D380酸堿處理后，通過離子交換吸附法來固定綠豆酯酶，篩選出固定效果較好的陰離子交換樹脂D380，并進(jìn)行固定化條件的優(yōu)化研究?？疾榱斯潭ɑ瘻囟?、固定化時(shí)間和粗酶液稀釋倍數(shù)對(duì)固定化綠豆酯酶活力的影響，通過響應(yīng)面法優(yōu)化綠豆酯酶的固定條件。結(jié)果表明較佳的固定化條件為：粗酶液稀釋25倍，固定化溫度為30℃，固定化時(shí)間為3.0 h。實(shí)際測得固定化綠豆酯酶活力為0.825 1 U/g，與理論預(yù)測值相對(duì)誤差為-1.7%，二者基本吻合。

綠豆；酯酶；陰離子交換吸附；固定化；響應(yīng)面法

固定化酶是指在一定的空間范圍內(nèi)起催化作用，并能反復(fù)和連續(xù)使用的酶［1-2］。將酶固定化之后，既保持了酶的催化特性，又克服了游離酶的不足之處，使其具有回收反復(fù)使用的優(yōu)點(diǎn)，并且在生產(chǎn)工藝上易于實(shí)現(xiàn)連續(xù)化和自動(dòng)化［3］。因此，酶的固定化技術(shù)化學(xué)、生物技術(shù)、醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)等領(lǐng)域的研究異?；钴S，在工業(yè)生產(chǎn)和分析檢測方面也得到了迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。

基于酶抑制技術(shù)的農(nóng)藥殘留檢測在有機(jī)磷農(nóng)藥檢測方面得到了應(yīng)用［4-8］，使用的酶主要有乙酰膽堿酯酶、有機(jī)磷水解酶、植物酯酶等。其中乙酰膽堿酯酶主要來源于動(dòng)物及昆蟲，如馬血、雞血、豬血及蒼蠅、棉鈴蟲等，但是動(dòng)物體中膽堿酯酶含量少，因此較難獲得、成本高。植物酯酶和乙酰膽堿酯酶具有相似的檢測限，測量精密度較好，具有取材方便、酶源豐富、制備簡單和成本低等優(yōu)點(diǎn)，成為研究的熱點(diǎn)。我國學(xué)者林素英、李建科和許學(xué)琴等［9-12］分別對(duì)植物酶源和固定化技術(shù)進(jìn)行了研究。但對(duì)綠豆酯酶的固定化技術(shù)研究較少。所以本文對(duì)綠豆酯酶的固定化條件進(jìn)行了優(yōu)化研究。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

綠豆購于長春市遠(yuǎn)方超市，陰離子交換樹脂D380、大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂D301、大孔強(qiáng)堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂D280、大孔徑強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂D261購于南開大學(xué)化工廠。

1.2儀器與設(shè)備

JB-2型恒溫磁力攪拌器：上海雷磁新徑儀器有限公司；JA3003A電子精密天平：上海精天電子儀器有限公司；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇金壇市金城固勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；PB一10數(shù)字酸度計(jì)：SAI賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；Fw177型中草藥粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；TDL一4A型臺(tái)式低速離心機(jī)：上海菲恰爾分析儀器有限公司；T22N紫外可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1綠豆酯酶的提取

準(zhǔn)確稱取綠豆粉碎樣品5.00 g置于燒杯中，加入0.2 mol/L磷酸緩沖溶液25.0 mL，用磁力攪拌器攪拌30 min，靜置12 h。然后用離心機(jī)以4 000 r/min離心20 min，取上清液于4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2綠豆酯酶的固定化條件

1.3.2.1樹脂的處理

用去離子水浸泡樹脂，使其充分溶脹，離心脫水。經(jīng)過一定濃度的酸堿溶液處理后，用去離子水洗至中性，即得Cl-型交換樹脂，加適量去離子水于4℃條件下貯存。

1.3.2.2固定化酯酶的單因素和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

分別選擇不同粗酶液稀釋倍數(shù)、固定化溫度、固定化時(shí)間為因素，進(jìn)行單因素試驗(yàn)研究。并根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以固定化酶活力為考指標(biāo)，進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)。

在試管中依次加入的不同稀釋倍數(shù)10、20、30、40、50、60、80、100倍的粗酶液，按6∶1 mL/g液料比混合樹脂，在30、40℃下，分別靜置1、3、6、9、12、15、18 h后，用濾紙進(jìn)行過濾，將固定化酶與酶液分開。用磷酸鹽緩沖液對(duì)以上固定化酶洗滌8次，最后將其浸在緩沖液中即得固定化酶。

1.3.3試驗(yàn)指標(biāo)及測定方法

1.3.3.1α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將不同濃度的α-萘酚乙醇溶液與0.5 mL 0.08%固藍(lán)B鹽溶液混合，在波長595 nm處測定其吸光度。以α-萘酚溶液濃度為縱坐標(biāo)、吸光度為橫坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為：

式（1）中：K為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；C1為α-萘酚溶液濃度，（μg/mL）；A1為反應(yīng)液在595 nm處的吸光度；n為標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度點(diǎn)數(shù)。

1.3.3.2總酯酶活力的測定

將50 μL 16 mmol/L α-乙酸萘酯乙醇溶液加入一定體積的稀釋粗酶液中，混勻，在30℃恒溫水浴中反應(yīng)5 min。然后加入0.5 mL 0.08%固藍(lán)B鹽，同時(shí)做空白試驗(yàn)，在595 nm處測吸光度?？傰ッ富盍Φ挠?jì)算式如下：

式（2）中：EA1為每毫升酶液所含的總酯酶活力，（U/mL）；D為酶液的稀釋倍數(shù)；OD595為在595 nm處測得的吸光度；kat為酶活力單位，1 U定義為在30℃下，1分鐘內(nèi)催化1 μmol α-萘酚所需的酶量。

1.3.3.3固定化酶活力的測定

稱取適量的固定化酶，按1∶20（g/mL）加人磷酸鹽緩沖溶液，再加人80 mmol/L α-乙酸萘酯乙醇溶液使其濃度達(dá)到0.4 mmol/L，混勻，在30℃的恒溫水浴中反應(yīng)5 min。在上述反應(yīng)液中加入0.5 mL 0.08%固藍(lán)B鹽，同時(shí)做空白試驗(yàn)，在595 nm處測定吸光度。固定化酶活力的計(jì)算式為：

式（3）中：EA2為每克固定化酶所含的總酯酶活力（U/g）；N為固定化樹脂與緩沖溶液的比例；W為固定化酶質(zhì)量，g。

1.3.3.4固定化酶回收率

固定化酶回收率的計(jì)算式如下：

式（4）中：ER為固定化酶回收率，%；W為固定化酶質(zhì)量，g；E2為固定化酶活力，（U/g）；V為粗酶液體積，mL；E1為粗酶液活力，（U/mL）。

2結(jié)果與分析

2.1樹脂的選擇

選擇合適的樹脂對(duì)于固定綠豆酯酶有較大的影響，本實(shí)驗(yàn)對(duì)陰離子交換樹脂D380、D301、D280、D261 4種樹脂分別進(jìn)行綠豆酯酶的固定化實(shí)驗(yàn)并測定其酶活力，以選擇出有較好固定化效果的樹脂。

由表1可得知，當(dāng)溫度和稀釋倍數(shù)固定時(shí)，4種樹脂中D380固定的綠豆酯酶活力最高，因此，選擇陰離子交換樹脂D380的固定化效果較好。

2.2影響固定化酶活力的單因素試驗(yàn)

2.2.1酶液稀釋倍數(shù)對(duì)固定化酶活力的影響

酶液稀釋倍數(shù)是影響綠豆酯酶固定化的重要因素。當(dāng)稀釋倍數(shù)較小時(shí)，固定化酶活力較低，影響對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量檢測的靈敏度；當(dāng)稀釋倍數(shù)較大時(shí)，樹脂上的結(jié)合位點(diǎn)趨向飽和，浪費(fèi)大量的酶蛋白，不僅增加成本，還使酶活力下降。酶液稀釋倍數(shù)對(duì)固定化酶活力的影響見圖1。

表1　不同樹脂固定化綠豆酯酶的活力Table 1Aactivy of immobilized mung bean esterase by different kinds of resins

圖1　稀釋倍數(shù)對(duì)固定化酶活力和回收率的影響Fig.1Effects of dilution times on the activity and recovery rate of immobilized enzyme

由圖1可知，當(dāng)酶液稀釋倍數(shù)小于30時(shí)，固定化酶活力及其回收率隨稀釋倍數(shù)的增大而增大，當(dāng)酶液稀釋倍數(shù)大于30倍時(shí)，固定化酶活力及其回收率隨稀釋倍數(shù)的增大而減小，因此，當(dāng)酶液稀釋倍數(shù)為30倍時(shí)，固定化效果較佳。

2.2.2固定化溫度對(duì)固定化酶活力的影響

酶反應(yīng)對(duì)溫度的變化非常敏感。當(dāng)溫度升高到一定程度后，會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞作用，從而使酶變性失活。固定化溫度對(duì)固定化酶活力及其回收率的影響見圖2。

圖2　固定化溫度對(duì)固定化酶活力和回收率的影響Fig.2Effects of immobilized temperature on the activity and recovery rate of immobilized enzyme

由圖2可知，固定化溫度在30℃～40℃范圍內(nèi)，30℃時(shí)固定化酶活力比40℃時(shí)固定化酶活力高。

2.2.3固定化時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響

隨著固定化時(shí)間的增加，固定化酶活力升高，且酶回收率增大。當(dāng)達(dá)到一定時(shí)間后，酶活力增加緩慢，這可能是由于一方面樹脂的結(jié)合位點(diǎn)接近飽和，另一方面可能是因?yàn)橛坞x酶在磷酸鹽緩沖溶液中放置過久使酶活力下降。固定化時(shí)間對(duì)固定化酶活力及其回收率的影響見圖3。

圖3　固定化時(shí)間對(duì)固定化酶活力和回收率的影響Fig.3Effects of immobilized time on the activity and recovery rate of immobilized enzyme

由圖3可知，從1 h～3 h固定化酶活力及其回收率隨吸附時(shí)間延長而增大，從3 h開始酶活力緩慢下降。由此可見，延長固定化時(shí)間不一定能夠增加酶活力及其回收率。

2.3響應(yīng)面法優(yōu)化與分析

2.3.1響應(yīng)面設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用Design-Expert8.05軟件對(duì)各因素及水平進(jìn)行設(shè)計(jì)，主要影響因素固定化溫度、固定化時(shí)間和稀釋倍數(shù)間分別用A、B、C表示，試驗(yàn)結(jié)果見表2和3。

表2　BBD優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果Table 2Results of BBD design

表3　二次回歸模型的方差分析Table 3ANOVA for quadratic regression model

應(yīng)用Design-Expert8.05軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，由各因素之間交互作用的顯著性都在α= 0.05水平以下，得到固定化酶活力（y）與固定化溫度（A）、固定時(shí)間（B）和稀釋倍數(shù)（C）三因素的二次模擬模型：y=0.82+0.014×A-0.025×B-0.048×C+0.030×A×B+ 0.10×A×C-0.038×B×C-0.13×A2-0.076×B2-0.15×C2

從模型可以看出，影響綠豆酯酶固定的因素大小順序?yàn)椋合♂尡稊?shù)＞固定化時(shí)間＞固定化溫度。

由表2方差分析可以看出，上述二次模擬模型模型的R2=0.994 3，該模型有非常高的顯著性（P＜0.001）。失擬性在0.05水平以上不顯著（P=0.727 6＞0.05），表明該模型能夠?qū)潭ɑG豆酯酶酶活力進(jìn)行準(zhǔn)確的預(yù)測和分析。調(diào)整確定系數(shù)為RAdj2=0.986 9，模型擬合程度良好，可以用來確定和預(yù)測綠豆酯酶固定化條件。

2.3.2響應(yīng)曲面分析

根據(jù)回歸方程來繪制交互作用較為明顯的響應(yīng)面立體分析圖和等高線圖，如圖4、圖5和圖6。

圖4　固定化溫度和固定化時(shí)間對(duì)固定化綠豆酯酶酶活力影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4Response surface and contour plots of activity of immobilized enzyme under the interaction between immobilized temperature and time

圖5　固定化溫度和稀釋倍數(shù)度固定化綠豆酯酶酶活力影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5Response surface and contour plots of activity of immobilized enzyme under the interaction between immobilized temperature and dilution times

圖6　固定化時(shí)間和稀釋倍數(shù)度固定化綠豆酯酶酶活力影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6Response surface and contour plots of activity of immobilized enzyme under the interaction between immobilized time and dilution times

固定化溫度、固定化時(shí)間和稀釋倍數(shù)均對(duì)固定化綠豆酯酶的酶活力有顯著的影響（P＜0.05）。圖4～圖6直觀地反映了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，由等高線圖可以看出存在極值的條件應(yīng)該在近圓心處。由圖4可知，固定化時(shí)間對(duì)固定化綠豆酯酶酶活力的影響比固定化溫度大，表現(xiàn)為固定化時(shí)間所對(duì)應(yīng)的曲線較固定化溫度的曲線陡。由圖4中等高線的形狀可以確定這兩個(gè)影響因素的較優(yōu)水平范圍為：固定化溫度為28℃～32℃，固定化時(shí)間為2.3 h～3.2 h。

由圖5可知，稀釋倍數(shù)對(duì)固定化綠豆酯酶酶活力的影響比固定化溫度大，表現(xiàn)為稀釋倍數(shù)所對(duì)應(yīng)的曲線較固定化溫度對(duì)應(yīng)的曲線陡。由圖5中等高線的形狀可以確定這兩個(gè)影響因素的較優(yōu)水平范圍為：固定化溫度為28℃～32℃，稀釋倍數(shù)為22倍～34倍。

由圖6可知，稀釋倍數(shù)對(duì)固定化綠豆酯酶酶活力的影響比固定化時(shí)間大，表現(xiàn)為稀釋倍數(shù)所對(duì)應(yīng)的曲線較固定化時(shí)間對(duì)應(yīng)的曲線陡。由圖6中等高線的形狀可以確定這兩個(gè)影響因素的較優(yōu)水平范圍為：固定化時(shí)間為2.2 h～3.5 h，稀釋倍數(shù)為25倍～32倍。

通過對(duì)y的回歸系數(shù)的檢驗(yàn)可知，各因素對(duì)固定化酶活力影響的大小順序?yàn)橄♂尡稊?shù)＞固定化時(shí)間＞固定化溫度。對(duì)函數(shù)進(jìn)行分析得到其最大值點(diǎn)為A= 29.90℃、B=2.87 h、C=28.55，此時(shí)固定化酶活力最大，最大值為0.835 5 U/g，即最優(yōu)綠豆酯酶固定化條件為固定化溫度為29.90℃，固定化時(shí)間為2.87 h，稀釋倍數(shù)28.55倍。

2.4驗(yàn)證試驗(yàn)

為檢驗(yàn)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)法的可靠性，按照最佳反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，重復(fù)3次，同時(shí)考慮到實(shí)際操作的便利，將綠豆酯酶固定化最佳條件調(diào)整為固定化溫度30℃、固定化時(shí)間3.0 h，酶液稀釋倍數(shù)為25倍。實(shí)際測得固定化綠豆酯酶活力為0.825 1 U/g，與模型理論預(yù)測值相比相對(duì)誤差為-1.7%。因此，綠豆酯酶固定化采用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化得到的參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3結(jié)論

1）采用響應(yīng)面法建立了固定化綠豆酯酶酶活力（y）與固定化溫度（A）、固定時(shí)間（B）和稀釋倍數(shù)（C）三因素的二次回歸模型為：y=0.82+0.014×A-0.025×B-0.048×C+0.030×A×B+0.10×A×C-0.038×B×C-0.13×A2-0.076×B2-0.15×C2

綠豆酯酶固定化的影響因素大小順序?yàn)椋合♂尡稊?shù)＞固定化時(shí)間＞固定化溫度。

2）獲得綠豆酯酶固定化的最佳工藝參數(shù)為：稀釋倍數(shù)25倍，固定化溫度為30℃，固定時(shí)間為3.0 h。

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Optimination of Immobilization Conditions for Mung Bean Esterase

XU Yan-yang，Lü Yan-ting，ZENG Shan，YU Rui，F(xiàn)U Jia，LI Wen-qiang
（College of Biological and Agricultural Engineering，Jilin University，Changchun 130022，Jilin，China）

To explore imobilization method of mung bean esterase，four types of anion exchange resins D261，D280，D301and D380 were treated using a given content acid and alkali solutions，and applied to imobilze mung bean esterase.Anion exchange resin D380 was better immobilization effect and its immobilization conditions were optimized.Based on single factor and response surface method experiments，immobilization conditions of mung bean esterase were investigated.Results showed that optimun immobilization conditions were a diluted 25 times of original enzyme solution，an immobilization temperature of 30℃，and an immobilization time of 3 hours.Under these conditions，imobilized mung bean esterase activity was 0.825 1 U/g，relative error between determined and predicted value was-1.7%，and tested and predicted value was similar basically.

mung bean；esterase；anion exchange adsorption；immobilization；response surface method

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.14.032

2014-03-12

吉林大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（2008AA100802）

徐艷陽（1972—），女（漢），副教授，博士，主要從事食品安全研究。