• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    pH對(duì)重組CHO細(xì)胞生長(zhǎng)、單抗表達(dá)及質(zhì)量的影響

    2015-10-28 09:09:49肖尚鄧崇飛柯軍鄢成偉孫文正楊彬
    生物技術(shù)通報(bào) 2015年12期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞培養(yǎng)糖基化純度

    肖尚 鄧崇飛 柯軍 鄢成偉 孫文正 楊彬

    (廣東東陽(yáng)光藥業(yè)有限公司,東莞 523000)

    pH對(duì)重組CHO細(xì)胞生長(zhǎng)、單抗表達(dá)及質(zhì)量的影響

    肖尚 鄧崇飛 柯軍 鄢成偉 孫文正 楊彬

    (廣東東陽(yáng)光藥業(yè)有限公司,東莞 523000)

    在1 L反應(yīng)器中探究pH對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)、單抗表達(dá)及質(zhì)量的影響。在1 L反應(yīng)器中對(duì)pH進(jìn)行探究,實(shí)驗(yàn)研究表明當(dāng)pH為7.05時(shí)最適合CHO細(xì)胞生長(zhǎng)和抗體表達(dá),在此條件下培養(yǎng)時(shí)第9天獲得最高細(xì)胞密度1.54×107cells/mL,在第11天獲得最高抗體濃度1 355.71 mg/L。pH對(duì)pCO2、乳酸積累、抗體的單體含量、電荷異質(zhì)性和糖基化也有較大影響,當(dāng)pH在6.95至7.25之間時(shí),高pH培養(yǎng)能夠降低乳酸積累和pCO2,但是會(huì)導(dǎo)致抗體的堿性峰增加。pH兩項(xiàng)培養(yǎng)能夠降低細(xì)胞活力,從而提高抗體表達(dá)量。

    pH;CHO細(xì)胞;抗體;pCO2;電荷異質(zhì)性

    單抗類藥物的出現(xiàn)為人類一些自身免疫病、癌癥等疑難病的診斷與治療開辟了廣闊前景,在為人類健康作出突出貢獻(xiàn)的同時(shí)也為企業(yè)帶來(lái)非??捎^的收入,已成為近年來(lái)銷售額最高的一類生物技術(shù)藥物[1-3]。雖然哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)要求高、抗體表達(dá)能力低、生產(chǎn)成本高,但具有其它表達(dá)系統(tǒng)無(wú)法取代的優(yōu)勢(shì):能夠準(zhǔn)確的完成糖基化、折疊、鏈內(nèi)及鏈間二硫鍵的形成等一系列翻譯后修飾,因此其表達(dá)的抗體在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面更接近天然產(chǎn)物[4]。自1996年以來(lái),F(xiàn)DA批準(zhǔn)的生物技術(shù)產(chǎn)品中,有2/3以上是通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)生產(chǎn)的[5]。中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary,CHO)由于具有抗剪切力,易于放大培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì),是目前使用最廣泛的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)[6]。目前使用最廣泛的CHO表達(dá)系統(tǒng)是二氫葉酸還原酶(DHFR)和谷氨酰胺合成酶(Glutaminesynthetase,GS)表達(dá)系統(tǒng)。

    目前國(guó)內(nèi)很多科研院校和企業(yè)的宿主細(xì)胞抗體表達(dá)水平都很低,抗體濃度多處于1 000 mg/L以內(nèi)[7],很難用于實(shí)際生產(chǎn)。而在發(fā)達(dá)國(guó)家,宿主細(xì)胞抗體表達(dá)量往往都在1 000 mg/L以上[8-10]。其次,我國(guó)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)還不成熟,與發(fā)達(dá)國(guó)家差距較大。目前我國(guó)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)更多的工作是為了提高抗體的表達(dá)量而很少關(guān)注抗體的質(zhì)量。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已成為我國(guó)抗體類藥物走向產(chǎn)業(yè)化、實(shí)現(xiàn)其經(jīng)濟(jì)價(jià)值,滿足市場(chǎng)需求的瓶頸[3]。

    目前動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的主流方式是利用攪拌式生物反應(yīng)器進(jìn)行流加培養(yǎng),相應(yīng)的反應(yīng)器放大設(shè)計(jì)和操作成為新的挑戰(zhàn),這其中的主要關(guān)鍵技術(shù)涉及剪切力、氧傳遞、均一性、二氧化碳分壓(pCO2)控制、pH控制、滲透壓及抗體的質(zhì)量等問(wèn)題[11-15]。本研究主要探究pH對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)、抗體表達(dá)及質(zhì)量、pCO2等的影響,以期為國(guó)內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)工藝和QbD方法運(yùn)用時(shí)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 CHO細(xì)胞 所用CHO細(xì)胞為GS-CHO,表達(dá)抗TNFα抗體,由本實(shí)驗(yàn)自主構(gòu)建并保藏。

    1.1.2 培養(yǎng)基 所用基礎(chǔ)培養(yǎng)基為CD EfficientFeedTMB,購(gòu)買至Gibco公司。所用流加培養(yǎng)基為Acti CHO Feed-A CD和Acti CHO Feed-B CD,均購(gòu)買至PAA公司。

    1.1.3 主要儀器 細(xì)胞活力分析儀(上海睿鈺生物科技有限公司);1 L生物反應(yīng)器(荷蘭Applikon生物技術(shù)公司);NOVA多參數(shù)生化分析儀(美國(guó)Nova生物有限公司);高效液相色譜安(安捷倫科技有限公司)。

    1.2方法

    1.2.1 培養(yǎng)方法 將液氮冷凍保藏的CHO細(xì)胞復(fù)蘇后,裝入一次性搖瓶在37℃、130 r/min、8%的CO2條件下進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),每3 d傳代1次,傳代密度為5×105個(gè)/mL。最后將細(xì)胞以10×105個(gè)/ mL的密度接入1 L反應(yīng)器進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

    1.2.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力分析 臺(tái)盼藍(lán)染色后由細(xì)胞活力分析儀自動(dòng)計(jì)數(shù)及分析活力。

    1.2.3 葡萄糖、谷氨酸、管氨酰胺、乳酸、銨根、pCO2測(cè)定 使用NOVA多參數(shù)生化分析儀測(cè)定。

    1.2.4 HPLC法檢測(cè)抗TNFα抗體濃度 用0.1 mol/L磷酸緩沖液以2 mL/min流速平衡HPLC系統(tǒng)15 min至基線平穩(wěn),于系統(tǒng)程序中設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線法程序。進(jìn)樣50 μL于進(jìn)樣器,以2 mL/min流速洗脫,記錄有關(guān)數(shù)據(jù),并進(jìn)行處理。

    1.2.5 HPLC法檢測(cè)抗TNFα抗體電荷異質(zhì)性 進(jìn)樣體積100 μL,流速1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm,樣品盤溫度8℃,柱溫40℃,運(yùn)行時(shí)間22 min。

    1.2.6 毛細(xì)管電泳測(cè)定抗TNFα單抗純度 毛細(xì)管電泳系統(tǒng)分別用1 mol/ L NaOH 洗5 min、水洗5 min及分離緩沖液洗10 min。每次進(jìn)樣前,分別用0.1 mol/L NaOH 及分離緩沖液洗1 min 后即可進(jìn)樣。毛細(xì)管長(zhǎng)30.2 cm,有效長(zhǎng)度20 cm,檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm,柱溫25℃,樣品盤15℃。

    1.2.7 HPLC-MS檢測(cè)抗TNFα抗體糖基化 色譜條件(色譜柱:Agilent-C8,75×2.1 mm,5 μm,300埃):進(jìn)樣體積2 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm,流速0.5 mL/min,柱溫75℃,樣品盤溫度8℃;

    質(zhì)譜條件:儀器模式Auto MS/MS,離子模式Dual AJS ESI源,陽(yáng)離子,干燥氣體N2,12 L/min,325℃;碰撞電壓260 V;工作電壓65 V;毛細(xì)管電壓4 000 V;夾套氣體溫度(流速):350℃,12 L/min;氣體溫度325℃;VCap:3 500 V;噴頭電壓1 000 V;分離器電壓65 V;OCT 1 RF Vpp電壓750 V;質(zhì)量范圍500-3 200 m/z。

    1.2.8 HPLC法檢測(cè)抗TNFα抗體多聚體含量 取25 μL樣品加緩沖液1 mL稀釋,上樣10 μL,流速0.5 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。

    2 結(jié)果

    2.1 單相pH培養(yǎng)對(duì)CHO細(xì)胞的影響

    在1 L反應(yīng)器中探究pH對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)、抗體表達(dá)等生理代謝的影響,選擇研究的pH范圍為6.95至7.25,用CO2和7.5%的碳酸氫鈉來(lái)控制pH,pH控制的死區(qū)范圍為±0.05,實(shí)驗(yàn)平行數(shù)為2。1 L反應(yīng)器初始培養(yǎng)體積為400 mL,接種密度為1.0E+ 06 cells/mL,OD控制在40%;轉(zhuǎn)速第0天到第5天為150 r/min,之后為196 r/min,培養(yǎng)溫度均為37℃恒溫。培養(yǎng)初期用空氣調(diào)節(jié)OD,當(dāng)通入的空氣量超過(guò)0.1V VM之后改通純氧。培養(yǎng)至第3天后每隔24 h流加9.6 mL cti CHO Feed-A CD和0.96 mL Acti CHO Feed-B CD。共培養(yǎng)11 d,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

    圖1 pH對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

    一般pH低于6.8或者大于7.3不適于CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)。通過(guò)圖2發(fā)現(xiàn)隨著pH的增加活細(xì)胞密度和抗體表達(dá)量都呈現(xiàn)出先增大后降低的趨勢(shì)。對(duì)于本實(shí)驗(yàn)所用CHO細(xì)胞,最優(yōu)pH為7.05,在此條件下培養(yǎng)第9天獲得最大細(xì)胞密度1.54×107個(gè)/mL,第11天獲得最高抗體濃度1 355.71 mg/L,但當(dāng)pH為6.95時(shí)在第9天獲得最大的每天單細(xì)胞抗體表達(dá)量(SPR)為26.04 pg。

    圖2 pH對(duì)CHO細(xì)胞抗體表達(dá)的影響

    動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)pCO2受各種因素的影響:pH、通氣、培養(yǎng)基成分、細(xì)胞代謝等。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的過(guò)程中pCO2呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)(圖3),這主要是由于CHO細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)前期產(chǎn)生乳酸,中和培養(yǎng)基中堿性物質(zhì),導(dǎo)致pCO2降低(圖4)。后期由于營(yíng)養(yǎng)需求較大,乳酸產(chǎn)生的速率較低甚至被消耗,且細(xì)胞密度較高,細(xì)胞代謝產(chǎn)生大量CO2,無(wú)法及時(shí)排出,導(dǎo)致pCO2上升。對(duì)于相同的培養(yǎng)基,當(dāng)培養(yǎng)時(shí)設(shè)定的pH值越低,pCO2值越大,可能是由于需要更多的CO2去降低培養(yǎng)基的pH。

    從表1中可以看出pH對(duì)抗體的非還原純度和電荷異質(zhì)性有影響,對(duì)多聚體影響不大。隨著pH的增大,抗體非還原純度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),在pH為7.05時(shí)獲得最大抗體非還原純度96.85%;隨著pH的增加,抗體主峰在下降,堿性峰在上升,酸性峰總體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),但變化量很小。表2說(shuō)明pH對(duì)抗體的糖基化有影響,隨著pH的增大G2F、G1F含量在下降,G0F、G1F-GN含量在上升。

    2.2 兩相pH對(duì)CHO細(xì)胞的影響

    在1 L反應(yīng)器中探究在第9天將pH從初始7.05轉(zhuǎn)成6.95時(shí)對(duì)細(xì)胞抗體表達(dá)的影響,結(jié)果如圖5所示。pH能夠影響許多酶的活性,從而對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、抗體表達(dá)、抗體質(zhì)量等有比較大的影響。圖6顯示出當(dāng)pH從7.05調(diào)至6.95,活細(xì)胞密度和細(xì)胞活率都有所下降,但由于pH變化幅度比較小,所以對(duì)細(xì)胞沒(méi)有造成嚴(yán)重的損傷,活細(xì)胞密度和細(xì)胞活率下降程度不大。

    圖3 pH對(duì)pCO2的影響

    圖4 pH對(duì)乳酸積累的影響

    表1 pH對(duì)抗體純度及電荷異質(zhì)性的影響

    表2 pH對(duì)抗體糖基化的影響

    圖5 pH兩項(xiàng)培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

    圖6 pH兩項(xiàng)培養(yǎng)對(duì)抗體表達(dá)的影響

    pH調(diào)整后SPR值有所上升,使得最后獲得的抗體濃度比單項(xiàng)pH培養(yǎng)時(shí)要高。這些可能是由于細(xì)胞自身的代謝和抗體表達(dá)都需要消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量,而抗體在后期大量表達(dá),導(dǎo)致后期營(yíng)養(yǎng)和能量需求比較大,流加的營(yíng)養(yǎng)和細(xì)胞自身所產(chǎn)生的能量不能同時(shí)滿足細(xì)胞生長(zhǎng)和抗體表達(dá)所需。當(dāng)pH調(diào)至6.95后細(xì)胞密度和活率有所降低,減少了由于細(xì)胞自身生理代謝所消耗的營(yíng)養(yǎng)和能量,就使得有更多的營(yíng)養(yǎng)和能量用于抗體合成。

    3 討論

    以動(dòng)物細(xì)胞為載體生產(chǎn)單克隆抗體已越來(lái)越受到重視,但目前國(guó)內(nèi)的研究更多的停留在培養(yǎng)基開發(fā)[20]和工藝開發(fā)[7]上,很少關(guān)注單抗的質(zhì)量屬性。目前國(guó)際制藥巨頭已經(jīng)深入理解和實(shí)施QbD 理論,將工藝與藥品的質(zhì)量聯(lián)系起來(lái),做到藥品的質(zhì)量是生產(chǎn)出來(lái)的而不是檢測(cè)出來(lái)。而國(guó)內(nèi)的企業(yè)對(duì)工藝與產(chǎn)品質(zhì)量之間的聯(lián)系研究不夠深入,不能很好的實(shí)施QbD理論。本研究考察了pH對(duì)CHO的生長(zhǎng)、活力及單抗的表達(dá)量、非還原純度(純化后)、電荷異質(zhì)性、糖基化、多聚體的影響,將生產(chǎn)工藝與單抗質(zhì)量建立聯(lián)系。

    pH設(shè)定點(diǎn)的不同會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)許多酶的活性產(chǎn)生重要影響從而對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、活力以及單抗表達(dá)有很大的影響,這在國(guó)內(nèi)外有很多文獻(xiàn)報(bào)道。pH兩相培養(yǎng)能夠降低細(xì)胞活力,從而將更多地營(yíng)養(yǎng)和能量提供給抗體合成,提高單抗表達(dá)量。

    由于CHO細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)前期產(chǎn)生大量乳酸,中和培養(yǎng)基中堿性物質(zhì),使得CO2溢出培養(yǎng)基,導(dǎo)致pCO2降低。后期細(xì)胞培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)需求大,乳酸從積累變成消耗,且細(xì)胞密度較高,細(xì)胞代謝產(chǎn)生大量CO2,無(wú)法及時(shí)排出,導(dǎo)致pCO2上升,所以pCO2呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。

    研究結(jié)果表明pH對(duì)單抗的電荷異質(zhì)性和半乳糖糖基化有較大影響,半乳糖糖基化對(duì)抗體的ADCC和CDC效應(yīng)有重要影響。隨著pH的增加,抗體主峰在下降,堿性峰在上升,酸性峰總體呈現(xiàn)較小趨勢(shì)的下降,G2F、G1F含量在下降,G0F、G1F-GN含量在上升??贵w非還原純度對(duì)單抗的免疫源性有重要影響,pH對(duì)單抗的非還原純度(純化后)有影響,隨著pH的增大,呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),在pH為7.05時(shí)獲得最大抗體非還原純度96.85%。

    由于pH對(duì)單抗的質(zhì)量有重要影響,并且細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)pH值偏離設(shè)計(jì)空間的可能性較大,因此在運(yùn)用QbD方法生產(chǎn)單抗藥物時(shí),對(duì)pH進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估可將pH列為關(guān)鍵工藝參數(shù)。

    4 結(jié)論

    當(dāng)pH為7.05時(shí)最適合本實(shí)驗(yàn)室CHO細(xì)胞生長(zhǎng)和抗體表達(dá)。在本研究的pH范圍內(nèi),高pH培養(yǎng)能夠降低pCO2,但是卻促進(jìn)了乳酸的積累;抗體的非還原純度隨著pH的增加呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì);較高的pH會(huì)導(dǎo)致堿性峰增高,主峰降低,但對(duì)酸性峰影響不大;當(dāng)培養(yǎng)的pH增加時(shí)G2F、G1F含量在下降,G0F、G1F-GN含量在上升。pH兩項(xiàng)培養(yǎng)能夠降低后期細(xì)胞活力和促進(jìn)抗體表達(dá)。。

    [1]胡顯文, 陳惠鵬, 張數(shù)庸. 全球生物制藥產(chǎn)業(yè)概況[J]. 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2009, 4(2):85-89.

    [2]張潔, 張松. 單克隆抗體藥物的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)藥業(yè),2006, 15(14):61-62.

    [3] 張?jiān)d. 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工程[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社. 2007.

    [4]Lim Y, Wong NSC, Lee YY, et al. Engineering mammalian cells in bioprocessing-current achievements and future perspectives[J]. Biotechnology and Applied Biochemistry, 2010, 55(4):175-189.

    [5]Chu L, Robinson DK. Industrial choices for protein production by large-scale cell culture[J]. Curr Opin Biotechnol, 2001, 12:180-187.

    [6]Birch JR, Racher AJ. Antibody production[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2006, 58:671-685.

    [7]范里, 趙亮, 孫亞婷, 等. 表達(dá)TNFR-Fc融合蛋白的GS-CHO細(xì)胞動(dòng)態(tài)流加培養(yǎng)過(guò)程的設(shè)計(jì)[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 2010, 26(2):216-222.

    [8]Li J, Wong CL, Vijayasankaran N, et al. Feeding lactate for CHO cell culture processes:Impact on culture metabolism and performance[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2012, 109(5):1173-1186.

    [9]Kshirsagar R, McElearney K, Gilbert A, et al. Controlling trisulfide modification in recombinant monoclonal antibody produced in fed batch cell culture[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2012,109(10):2523-2532.

    [10] Gilbert A, McElearney K, Kshirsagar R, et al. Investigation of metabolic variability observed in extended fed batch cell culture[J]. Biotechnology Progress, 2013, 29(6):1519-1527.

    [11] Berrios J, Altamirano C, Osses N, et al. Continuous CHO cell cultures with improved recombinant protein productivity by using mannose as carbon source:Metabolic analysis and scale-up simulation[J]. Chemical Engineering Science, 2011, 66(11):2431-2439.

    [12] Garcia-Ochoa F, Gomez E. Bioreactor scale-up and oxygen transfer rate in microbial processes:an overview[J]. Biotechnology Advances, 2009, 27(2):153-176.

    [13] Martínez VS, Dietmair S, Quek LE, et al. Flux balance analysis of CHO cells before and after a metabolic switch from lactate production to consumption[J]. Biotechnology and Bioengineering,2013, 110(2):660-666.

    [14] Takuma S, Hirashima C, Piret JM. Dependence on glucose limitation of the pCO2 influences on CHO cell growth, metabolism and IgG production[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2007, 97(6):1479-1488.

    [15] Xing Z, Kenty BM, Li ZJ, et al. Scale-up analysis for a CHO cell culture process in large-scale bioreactors[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2009, 103(4):733-746.

    [16]Takuma S, Hirashima C, Piret JM. Dependence on glucose limitation of the pCO2influences on CHO cell growth, metabolism and IgG production[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2007,97(6):1479-1488.

    [17]Gray DR, Chen S, Howarth W, et al. CO2in large-scale and highdensity CHO cell perfusion culture[J]. Cytotechnology, 1996, 22(1-3):65-78.

    [18] Kimura R, Miller WM. Effects of elevated pCO2and/or osmolality on the growth and recombinant tPA production of CHO cells[J]. Biotechnology and Bioengineering, 1996, 52(1):152-160.

    [19] Goudar CT, Matanguihan R, Long E, et al. Decreased pCO2 accumulation by eliminating bicarbonate addition to high celldensity cultures[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2007, 96(6):1107-1117.

    [20] 馬愛瑛, 周棟, 李敏. CHO 工程細(xì)胞株低血清培養(yǎng)的初探[J].生物技術(shù)通報(bào), 2009(11):154-157.

    (責(zé)任編輯李楠)

    The Effects of pH on Cell Growth,Monoclonal Antibody Expression and Quality of a Recombinant CHO Strain

    Xiao Shang Deng Chongfei Ke Jun Yan Chengwei Sun Wenzheng Yang Bin
    (Sunshine Lake Pharma Co.,Ltd,Dongguan 523000)

    It was to study the effect of pH on the growth, monoclonal antibody expression and produce quality of a rewmbinant CHO strain. The results showed that the optimal pH for cell growth and the production of monoclonal antibody(mAb)was 7.05. Under this pH, a peak viable cell density was 1.54×107cells/mL at day 9 and the highest harvested antibody concentration was 1 355.71 mg/L after cultivating for 11 days. In addition, pH significantly affected the accumulation of pCO2and lactate in cell cultures, as well as the expressed product’s quality including its monomer ratio, charge variant species, and glycosylation pattern. While pH ranging from 6.95 to 7.25, cell cultures at higher pH reduced pCO2and the accumulation of lactate, but led the alkaline peak of antibody increase. Cultures at 2 sets of pH decreased the cell activity,therefore increased the expression of antibody.

    pH;CHO cell;antibody;pCO2;charge variants

    10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.037

    2015-03-10

    廣東省引進(jìn)創(chuàng)新科研團(tuán)隊(duì)計(jì)劃(201101Y0104990178)

    肖尚,男,碩士研究生,研究方向:動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng);E-mail:xiaoshang@hecpharm.com

    楊彬,男,工程師,碩士研究生,研究方向:?jiǎn)慰股a(chǎn);E-mail:547860796@qq.com

    猜你喜歡
    細(xì)胞培養(yǎng)糖基化純度
    退火工藝對(duì)WTi10靶材組織及純度的影響
    酶解大豆蛋白的制備工藝研究及其在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用研究
    色彩的純度
    童話世界(2017年29期)2017-12-16 07:59:32
    間接滴定法測(cè)定氯化銅晶體的純度
    3種陰離子交換色譜固定相捕獲細(xì)胞培養(yǎng)上清液中紅細(xì)胞生成素的效果比較
    色譜(2015年6期)2015-12-26 01:57:32
    糖基化終末產(chǎn)物與冠脈舒張功能受損
    采用PCR和細(xì)胞培養(yǎng)方法比較流感樣病例不同標(biāo)本的流感病毒檢出觀察
    對(duì)氯水楊酸的純度測(cè)定
    油炸方便面貯藏過(guò)程中糖基化產(chǎn)物的變化規(guī)律
    糖基化終末產(chǎn)物對(duì)糖尿病慢性并發(fā)癥的早期診斷價(jià)值
    最新中文字幕久久久久| av专区在线播放| 桃红色精品国产亚洲av| 国产精品久久视频播放| 日本a在线网址| 亚洲无线在线观看| 成人特级av手机在线观看| 亚洲内射少妇av| 免费高清视频大片| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产探花极品一区二区| 乱码一卡2卡4卡精品| 色av中文字幕| 日本a在线网址| 亚洲国产欧美人成| 欧美又色又爽又黄视频| 小说图片视频综合网站| 国产黄片美女视频| h日本视频在线播放| 亚洲av二区三区四区| 精品福利观看| 成人欧美大片| 免费人成在线观看视频色| 国产高清三级在线| 亚洲美女搞黄在线观看 | 熟女人妻精品中文字幕| 免费看美女性在线毛片视频| 久久久久久久午夜电影| 国产精品三级大全| 少妇的逼好多水| 久久精品国产清高在天天线| 国产私拍福利视频在线观看| 精品午夜福利在线看| 我的女老师完整版在线观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 五月玫瑰六月丁香| 国国产精品蜜臀av免费| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 舔av片在线| 国产精品无大码| 欧美又色又爽又黄视频| 一个人看的www免费观看视频| 一个人看视频在线观看www免费| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 男女下面进入的视频免费午夜| 日本五十路高清| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久99热这里只有精品18| 国产精品人妻久久久影院| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 综合色av麻豆| 69av精品久久久久久| 欧美色视频一区免费| 又爽又黄无遮挡网站| 成人亚洲精品av一区二区| 久久国产精品人妻蜜桃| 色综合婷婷激情| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲成人免费电影在线观看| 91久久精品电影网| 国产av在哪里看| 国产不卡一卡二| 波多野结衣巨乳人妻| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产伦精品一区二区三区四那| 在线观看舔阴道视频| 婷婷亚洲欧美| 成人特级黄色片久久久久久久| 日本黄大片高清| 嫩草影视91久久| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产真实伦视频高清在线观看 | 色吧在线观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产日本99.免费观看| 亚洲七黄色美女视频| 久久这里只有精品中国| 色哟哟哟哟哟哟| 国产精品99久久久久久久久| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 1024手机看黄色片| 黄色视频,在线免费观看| 久久这里只有精品中国| 日韩人妻高清精品专区| 国产精品99久久久久久久久| 在线播放无遮挡| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久亚洲精品不卡| 久久精品国产清高在天天线| 淫秽高清视频在线观看| 岛国在线免费视频观看| 春色校园在线视频观看| 亚洲欧美激情综合另类| 欧美另类亚洲清纯唯美| 淫妇啪啪啪对白视频| 中文字幕高清在线视频| 精品福利观看| 嫩草影视91久久| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产高清视频在线观看网站| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 欧美黑人巨大hd| 毛片女人毛片| 欧美丝袜亚洲另类 | 成人av一区二区三区在线看| 最好的美女福利视频网| 我的女老师完整版在线观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 啪啪无遮挡十八禁网站| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 久久久国产成人免费| 国产久久久一区二区三区| 男人狂女人下面高潮的视频| 级片在线观看| 特级一级黄色大片| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲自拍偷在线| 88av欧美| 欧美在线一区亚洲| 一进一出抽搐动态| 亚洲久久久久久中文字幕| 99精品在免费线老司机午夜| 国产午夜精品论理片| 国产高清不卡午夜福利| 日韩一本色道免费dvd| 高清日韩中文字幕在线| 国产伦人伦偷精品视频| 男插女下体视频免费在线播放| 欧美中文日本在线观看视频| 淫妇啪啪啪对白视频| 免费看光身美女| 91久久精品电影网| 国产高清激情床上av| 嫩草影院精品99| 日韩亚洲欧美综合| 欧美极品一区二区三区四区| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产高清不卡午夜福利| 无遮挡黄片免费观看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 欧美成人a在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 午夜久久久久精精品| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲av美国av| а√天堂www在线а√下载| 男人和女人高潮做爰伦理| 中出人妻视频一区二区| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产精品久久久久久久电影| 国产av在哪里看| 天堂动漫精品| av视频在线观看入口| 亚洲成人久久爱视频| 内地一区二区视频在线| 波多野结衣巨乳人妻| 动漫黄色视频在线观看| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 春色校园在线视频观看| 国产精品人妻久久久久久| 看十八女毛片水多多多| 免费观看在线日韩| 热99在线观看视频| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲精华国产精华精| xxxwww97欧美| 欧美潮喷喷水| 中文亚洲av片在线观看爽| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲精品粉嫩美女一区| 午夜福利在线观看吧| 美女高潮的动态| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲经典国产精华液单| 国产精品无大码| 国产一区二区在线av高清观看| 国产精华一区二区三区| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲无线观看免费| 三级国产精品欧美在线观看| 99热网站在线观看| 啪啪无遮挡十八禁网站| 美女高潮的动态| 搡老熟女国产l中国老女人| 午夜福利高清视频| 亚洲自偷自拍三级| 在线观看午夜福利视频| 久久草成人影院| a级一级毛片免费在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 日韩中字成人| 深爱激情五月婷婷| 午夜精品在线福利| 成年女人毛片免费观看观看9| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 欧美三级亚洲精品| 久久人人精品亚洲av| 成人特级av手机在线观看| 一本一本综合久久| 国产综合懂色| 亚洲av二区三区四区| 精品人妻视频免费看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 日韩亚洲欧美综合| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 伦精品一区二区三区| 久久欧美精品欧美久久欧美| 久久人人爽人人爽人人片va| 禁无遮挡网站| 精品久久久久久成人av| 欧美+日韩+精品| 亚洲专区中文字幕在线| 黄片wwwwww| 嫩草影院精品99| 简卡轻食公司| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲经典国产精华液单| 一a级毛片在线观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产日本99.免费观看| 看黄色毛片网站| 国产高清视频在线播放一区| 日日撸夜夜添| 听说在线观看完整版免费高清| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产av一区在线观看免费| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 亚洲黑人精品在线| 可以在线观看的亚洲视频| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产免费一级a男人的天堂| 国产91精品成人一区二区三区| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产精品久久久久久精品电影| 一个人观看的视频www高清免费观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 欧美中文日本在线观看视频| 日韩国内少妇激情av| 久久国产乱子免费精品| 嫩草影院新地址| 99热这里只有是精品在线观看| 日韩欧美在线乱码| 在线观看av片永久免费下载| 免费高清视频大片| 一本久久中文字幕| 日韩欧美国产在线观看| 波野结衣二区三区在线| 国产成年人精品一区二区| 午夜精品久久久久久毛片777| a级一级毛片免费在线观看| 大型黄色视频在线免费观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 熟女人妻精品中文字幕| 国产精品一区二区免费欧美| 一个人看的www免费观看视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 俄罗斯特黄特色一大片| xxxwww97欧美| 国产免费男女视频| www日本黄色视频网| 日韩欧美免费精品| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 中文资源天堂在线| 国产真实伦视频高清在线观看 | 美女被艹到高潮喷水动态| 两个人的视频大全免费| 成年女人永久免费观看视频| 一进一出抽搐动态| 在线观看舔阴道视频| 国产色爽女视频免费观看| 看黄色毛片网站| 日韩精品青青久久久久久| 国产精品女同一区二区软件 | 日本与韩国留学比较| 免费观看人在逋| 如何舔出高潮| 成人国产综合亚洲| 国产高清激情床上av| videossex国产| 精品一区二区三区av网在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 国产av不卡久久| 国内精品久久久久久久电影| 91在线观看av| 色在线成人网| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 欧美成人免费av一区二区三区| 网址你懂的国产日韩在线| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 日本一二三区视频观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产精品综合久久久久久久免费| 欧美一区二区国产精品久久精品| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产精品国产高清国产av| avwww免费| 性色avwww在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 观看美女的网站| 日本在线视频免费播放| 日本黄色视频三级网站网址| 床上黄色一级片| 中文字幕精品亚洲无线码一区| av在线亚洲专区| 色噜噜av男人的天堂激情| 午夜福利在线观看吧| 国产色婷婷99| 此物有八面人人有两片| 日本免费a在线| 日本在线视频免费播放| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产精品一区二区三区四区久久| 日本免费a在线| 久久99热6这里只有精品| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 午夜a级毛片| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 日韩国内少妇激情av| 此物有八面人人有两片| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 色5月婷婷丁香| www日本黄色视频网| 中国美女看黄片| 欧美最黄视频在线播放免费| 在线观看av片永久免费下载| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 美女被艹到高潮喷水动态| 日韩欧美国产一区二区入口| 18禁在线播放成人免费| 免费黄网站久久成人精品| 国产熟女欧美一区二区| 国产成人福利小说| 免费看av在线观看网站| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲人成伊人成综合网2020| 欧美精品啪啪一区二区三区| 色噜噜av男人的天堂激情| 午夜免费激情av| 中文字幕高清在线视频| 久久人人精品亚洲av| 午夜福利在线观看吧| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 搡老岳熟女国产| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产成人a区在线观看| 一级黄色大片毛片| 色吧在线观看| 国产真实乱freesex| 国产成人一区二区在线| 日韩中字成人| 春色校园在线视频观看| 免费人成在线观看视频色| 成人毛片a级毛片在线播放| 日韩强制内射视频| 国产精品伦人一区二区| 在线a可以看的网站| 亚洲精品粉嫩美女一区| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 日本熟妇午夜| 国产免费av片在线观看野外av| 日本一二三区视频观看| 看片在线看免费视频| 国产一区二区在线观看日韩| videossex国产| 免费人成在线观看视频色| 精品久久久久久,| 中国美女看黄片| 波多野结衣巨乳人妻| 美女免费视频网站| 亚洲欧美清纯卡通| 免费人成在线观看视频色| 久久欧美精品欧美久久欧美| 岛国在线免费视频观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 婷婷精品国产亚洲av在线| 日韩欧美免费精品| 亚洲图色成人| 日本成人三级电影网站| 99久久中文字幕三级久久日本| 嫁个100分男人电影在线观看| a级一级毛片免费在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久久久久大精品| 亚洲精品456在线播放app | 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲精品456在线播放app | 性插视频无遮挡在线免费观看| 亚洲avbb在线观看| 国产极品精品免费视频能看的| 高清日韩中文字幕在线| 日韩欧美精品免费久久| 男女那种视频在线观看| 久久久久久九九精品二区国产| 露出奶头的视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 性色avwww在线观看| 尾随美女入室| 久久这里只有精品中国| 好男人在线观看高清免费视频| 伦精品一区二区三区| 久久国产乱子免费精品| 午夜久久久久精精品| 22中文网久久字幕| or卡值多少钱| 亚洲美女搞黄在线观看 | 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 美女 人体艺术 gogo| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 国产黄a三级三级三级人| 婷婷丁香在线五月| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 日韩欧美在线二视频| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲不卡免费看| 国产高清不卡午夜福利| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 久久午夜福利片| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 嫩草影视91久久| 亚洲欧美清纯卡通| 99久久精品一区二区三区| 久久国产乱子免费精品| 亚洲精品影视一区二区三区av| 久久久精品大字幕| 一级a爱片免费观看的视频| videossex国产| 国产综合懂色| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产高清视频在线观看网站| 又爽又黄a免费视频| 99热这里只有是精品50| eeuss影院久久| 日韩高清综合在线| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲美女黄片视频| 日本一二三区视频观看| 看免费成人av毛片| 色综合亚洲欧美另类图片| 乱系列少妇在线播放| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 精品久久国产蜜桃| 国产日本99.免费观看| 国产老妇女一区| 国产成人福利小说| 免费黄网站久久成人精品| 午夜福利高清视频| 97热精品久久久久久| 日韩欧美在线乱码| 免费电影在线观看免费观看| xxxwww97欧美| 99久久九九国产精品国产免费| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲电影在线观看av| 欧美在线一区亚洲| 少妇的逼水好多| 精品久久久久久,| 国产淫片久久久久久久久| 色5月婷婷丁香| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产高清视频在线播放一区| 日韩欧美精品免费久久| 啦啦啦韩国在线观看视频| 色噜噜av男人的天堂激情| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 一级黄色大片毛片| 成人午夜高清在线视频| 成人一区二区视频在线观看| 久久精品国产自在天天线| 51国产日韩欧美| 国产视频一区二区在线看| 超碰av人人做人人爽久久| 午夜视频国产福利| 国产主播在线观看一区二区| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲第一区二区三区不卡| 日韩强制内射视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 色在线成人网| 1024手机看黄色片| 一区二区三区激情视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产成人a区在线观看| 精品久久久久久久久亚洲 | 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久久精品综合一区二区三区| 乱码一卡2卡4卡精品| av在线观看视频网站免费| 简卡轻食公司| 国产免费一级a男人的天堂| 欧美激情在线99| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲18禁久久av| 级片在线观看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产午夜福利久久久久久| 国模一区二区三区四区视频| 国产精品99久久久久久久久| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 男女那种视频在线观看| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 午夜福利成人在线免费观看| 日本五十路高清| 乱系列少妇在线播放| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 一个人免费在线观看电影| 真人做人爱边吃奶动态| 国产亚洲91精品色在线| 欧美成人免费av一区二区三区| 午夜福利18| bbb黄色大片| 色哟哟哟哟哟哟| 国产亚洲精品久久久com| 搞女人的毛片| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 亚洲午夜理论影院| 亚洲国产欧美人成| 国产色婷婷99| 国产精品久久久久久精品电影| 中出人妻视频一区二区| 91av网一区二区| 女人被狂操c到高潮| 欧美又色又爽又黄视频| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲经典国产精华液单| 俄罗斯特黄特色一大片| 中文字幕av在线有码专区| 淫秽高清视频在线观看| 看片在线看免费视频| 变态另类丝袜制服| 亚洲人成网站高清观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 真实男女啪啪啪动态图| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 免费黄网站久久成人精品| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产精品综合久久久久久久免费| 男插女下体视频免费在线播放| 麻豆久久精品国产亚洲av| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲美女黄片视频| 99热这里只有精品一区| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 午夜久久久久精精品| 亚洲内射少妇av| 在线国产一区二区在线| 免费大片18禁| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 99九九线精品视频在线观看视频| 亚洲国产精品合色在线| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 成人欧美大片| 精品久久国产蜜桃| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国内精品久久久久精免费| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 淫妇啪啪啪对白视频| 久久精品综合一区二区三区| 特级一级黄色大片| 国产成人影院久久av| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 亚洲自拍偷在线| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 日韩欧美三级三区| 日韩一区二区视频免费看| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲在线观看片| 国产av不卡久久| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 欧美成人一区二区免费高清观看| 不卡视频在线观看欧美| 久久久久久久精品吃奶| 国产精品一区二区性色av| 在线免费观看不下载黄p国产 | 最新在线观看一区二区三区| 少妇丰满av| 亚洲不卡免费看| 深夜精品福利| 亚洲人成网站高清观看| 美女黄网站色视频| 99热这里只有是精品50| 精品久久久久久久久av| 真人做人爱边吃奶动态| 丰满人妻一区二区三区视频av|