高效解磷菌的篩選及其促生機(jī)制的初步研究

銀婷婷王敬敬柳影梁亞杰王興彪韓一凡王夏程美娟黃志勇

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過(guò)程工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津300308；3.黃山中科新佳生物科技有限公司，黃山 245000；4.黃山市徽州區(qū)農(nóng)業(yè)委員會(huì)，黃山 245061）

高效解磷菌的篩選及其促生機(jī)制的初步研究

銀婷婷1，2王敬敬2柳影2梁亞杰2王興彪2韓一凡2王夏3程美娟4黃志勇2

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過(guò)程工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津300308；3.黃山中科新佳生物科技有限公司，黃山 245000；4.黃山市徽州區(qū)農(nóng)業(yè)委員會(huì)，黃山 245061）

旨在研制出可替代化學(xué)肥料的新型肥料。利用無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基從環(huán)境中篩選到27株解無(wú)機(jī)磷菌；采用鉬銻抗比色法進(jìn)行溶磷能力分析，發(fā)現(xiàn)27株解磷菌中qzr14的解磷能力最高（270 mg/L）；盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明27株解磷菌中qzr14對(duì)黃瓜苗的促生效果較好，與對(duì)照相比，可提高黃瓜苗株高27.71%、干重98.46%、鮮重57.01%；通過(guò)對(duì)qzr14發(fā)酵液中的有機(jī)酸進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)qzr14主要通過(guò)分泌葡糖酸溶解不溶性磷；通過(guò)對(duì)盆栽土壤中磷組分的分析，發(fā)現(xiàn)接種qzr14 4 d后的土壤中有效磷占總磷的百分比（19.62%-22.57%）均顯著高于空白對(duì)照的百分比（12.53%-17.35%），說(shuō)明qzr14可溶解土壤中不溶性磷；生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明qzr14還具有固氮和解鉀能力；通過(guò)16S rDNA序列分析初步鑒定qzr14為葡糖醋桿菌屬。從環(huán)境中篩選到一株高效解磷的葡糖醋桿菌qzr14，并首次報(bào)道了其促生機(jī)制。糖醋桿菌qzr14可能通過(guò)分泌葡糖酸溶解土壤中的磷，為黃瓜苗提供較多的有效磷，從而促進(jìn)黃瓜苗生長(zhǎng)，還可能通過(guò)解鉀和固氮作用促進(jìn)黃瓜苗生長(zhǎng)，是一種潛在的微生物肥料。

菌種篩選；高效解磷菌；促生機(jī)制

土壤中的磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的營(yíng)養(yǎng)元素，然而約95%以上的磷以不能被植物吸收的形式存在于土壤中。因此，磷成為限制作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的主要元素之一。磷肥的當(dāng)季利用率低于25%，肥料中70%以上的水溶性磷與土壤中的Ca2+、Fe3+、Al3+等結(jié)合，轉(zhuǎn)化為難溶性磷酸鹽［1］。我國(guó)約有74%的耕地土壤缺磷，為了減緩磷匱乏對(duì)植物生長(zhǎng)的影響，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上主要依靠施用磷肥來(lái)增加磷素供應(yīng)［2］。近年來(lái)對(duì)磷肥的需求量越來(lái)越大，每年都有過(guò)量的磷肥施入可耕地中。過(guò)量磷肥的施用不僅會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，還會(huì)造成土壤板結(jié)、水污染等，因此急需發(fā)展化學(xué)磷肥的可替代產(chǎn)品。解磷菌是一類(lèi)能夠溶解土壤中的不溶性磷，并能通過(guò)產(chǎn)胞外酶和有機(jī)酸來(lái)刺激植物的生長(zhǎng)的土壤微生物［3，4］，在土壤中，解磷菌的施用可提高土壤中磷的利用率，從而減少磷化肥的使用量［5］。故從環(huán)境中分離篩選高效解磷菌，研制微生物解磷菌肥對(duì)調(diào)節(jié)土壤中磷的供需矛盾具有重要意義。

早在1908年，Goldstein［6］在植物根際發(fā)現(xiàn)了解磷菌，迄今為止，已有很多學(xué)者對(duì)解磷菌的篩選做了大量工作，篩選到的解磷菌分屬不同的種類(lèi)，包括勒克氏菌屬、腸桿菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、克雷伯氏菌屬和節(jié)桿菌屬等。解磷菌的解磷作用普遍被認(rèn)為是由其生長(zhǎng)過(guò)程中的代謝產(chǎn)物決定的，代謝產(chǎn)物包括有機(jī)酸、質(zhì)子和多糖等。有機(jī)酸通過(guò)羥基和羧基對(duì)不溶性磷酸鹽進(jìn)行螯合使其溶解；質(zhì)子通過(guò)降低周?chē)膒H來(lái)溶解不溶性磷酸鹽；多糖可通過(guò)與有機(jī)酸的協(xié)同效應(yīng)來(lái)推動(dòng)不溶性磷酸鹽的溶解。近年來(lái)，解磷菌的應(yīng)用成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，其在小麥、玉米等植物上的應(yīng)用已有諸多報(bào)道［7］，但是解磷菌在黃瓜的應(yīng)用卻鮮有報(bào)道。

本研究從土壤中篩選出對(duì)黃瓜苗有促生作用的高效解磷菌，并對(duì)其促生機(jī)制進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 本研究篩菌所用采用的土壤來(lái)自遼寧鞍山葡萄根際土、遼寧鞍山葡萄根周土、遼寧鞍山茄子根際土、遼寧鞍山茄子根周土、安徽黃山土壤和天津草坪根際土。

1.1.2 培養(yǎng)基 無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基：NaCl 0.3 g，MgSO4· 7H2O 0.3 g，KCl 0.3 g，（NH4）2SO40.5 g，F(xiàn)eSO4· 7H2O 0.003 g，MnSO4·4H2O 0.003 g，Ca3（PO4）25.0 g，葡萄糖10 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 L，pH7.0-7.5［8］。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 L，pH7.4-7.6。

阿須貝固氮菌培養(yǎng)基：KH2PO40.2 g，MgSO4· 7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaCO35.0 g，甘露醇10.0 g，CaSO4·2H2O 0.1 g，瓊脂粉18-20 g，蒸餾水1 L，pH7.0［9］。

解鉀培養(yǎng)基：Na2HPO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eCl30.005 g，CaCO30.1 g，蔗糖5.0 g，鉀長(zhǎng)石粉1.0 g，瓊脂粉15-20 g，pH7.0-7.5，蒸餾水1 L［10］。

Salkowski’s反應(yīng)液：12 mg/L FeCl3，7.9 mol/L H2SO4，加蒸餾水至1 L［11］。

CAS（鉻天青）檢測(cè)平板的配制：每100 mL含20%蔗糖溶液1 mL，10 %酸水解酪素3 mL，1 mmol/L CaCl2100 μL，1 mmol/L MgSO42 mL，瓊脂1.8 g。在60℃時(shí)緩慢加入0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液和CAS染液各5 mL，混合均勻即得藍(lán)色檢測(cè)平板。

CAS染 液 配 制：1 mmol/L CAS，0.1 mmol/L FeCl3，4 mmol/L十六烷基三甲基溴化胺（HDTMA），0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH6.8（每100 mL含Na2HPO4·12H2O 2.427 g，NaH2PO4·2H2O 0.590 5 g，KH2PO40.075 g，NH4Cl 0.250 g，NaCl 0.125 g，使用時(shí)10倍稀釋?zhuān)?2］。

1.2 方法

1.2.1 解磷菌的分離與篩選 稱(chēng)取1 g土壤樣品，置于9 mL無(wú)菌水中高速震蕩制成土壤菌懸液，將梯度稀釋的土壤懸液涂布在無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，倒置于生化培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)3 d。挑取平板上透明圈較明顯的菌落在無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基上進(jìn)行重復(fù)劃線分離純化。將分離純化的純菌菌落轉(zhuǎn)至牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行4℃保存。將分離純化的純菌菌液浸濕濾紙片，并放置在無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基平板上，對(duì)其解磷能力進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.2 解磷菌解磷能力和pH測(cè)定及分析 將初篩的解磷菌在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中30℃，180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基將菌濃度稀釋至1×108個(gè)/mL，以10%接種量接入無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中。以接入10%牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。30℃，180 r/min在搖床上培養(yǎng)4 d后，將發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min，取上清在波長(zhǎng)690 nm下，采用鉬銻抗比色法測(cè)定上清液中可溶性磷含量［13］。用pH計(jì)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行pH進(jìn)行檢測(cè)。

利用SPSS 17.0中的皮爾遜相關(guān)分析對(duì)解磷菌的解磷能力和pH進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.2.3 盆栽實(shí)驗(yàn) 選取遼寧鞍山土壤作為供試土壤，土壤性質(zhì)：pH6.8；有機(jī)質(zhì) 2.35%；總氮142 mg/kg；總磷107 mg/kg；總鉀310 mg/kg；速效氮147 mg/ kg；有效磷6 mg/kg；有效鉀376 mg/kg。

將供試土壤在陰涼避光處晾干，過(guò)1 mm篩。每200 g土壤與1.1 g磷酸三鈣混勻。供試植株采用黃瓜中農(nóng)8號(hào)。將黃瓜種子育種7 d后，選取大小一致的植株作為實(shí)驗(yàn)植株。

將所篩到的解磷菌進(jìn)行盆栽實(shí)驗(yàn)，以此篩選出對(duì)植物有促生作用的高效解磷菌。每200 g供試土壤裝入直徑為8 cm的花盆中，每個(gè)盆中種植1株黃瓜苗。將在牛肉膏蛋白胨中培養(yǎng)24 h的27株解磷菌進(jìn)行菌體收集，用無(wú)菌生理鹽水稀釋至1×108個(gè)/mL。取20 mL菌懸液添加到黃瓜根際，20 mL生理鹽水作為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

將黃瓜放置于人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)（28℃，14 h光照，12℃，16 h無(wú)光照），并進(jìn)行統(tǒng)一管理（每48 h澆水30 mL），培養(yǎng)20 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)黃瓜苗株高、鮮重和干重進(jìn)行測(cè)量。

1.2.4 解磷菌的促生機(jī)制研究

1.2.4.1 解磷機(jī)制研究 將在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)24 h的解磷菌，用生理鹽水將制成菌懸液（菌數(shù)約1×108個(gè)/mL），以10%的接種量接種到無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，30℃搖床培養(yǎng)（200 r/min）96 h，每12 h取樣一次；發(fā)酵液中菌數(shù)利用細(xì)菌計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)；發(fā)酵液pH用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)量；取10 mL發(fā)酵液在12 000 r/min進(jìn)行離心10 min，采用鉬銻抗比色法測(cè)定上清液中可溶性磷含量；上清液經(jīng)0.22 μm濾膜進(jìn)行過(guò)濾，利用津島LC-20A高效液相色譜儀對(duì)有機(jī)酸進(jìn)行分析（色譜柱為美國(guó)Bio-Rad的HPX-87H，進(jìn)樣器為SIL-20AC，紫外檢測(cè)器為SPD-20A，進(jìn)樣器為SIL-20AC，柱溫箱為CTO-20AC，泵為L(zhǎng)C-20AD）。色譜分離條件：柱溫為60℃；流動(dòng)相為0.5 mmol/L的H2SO4；流速為0.6 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm。

利用SPSS 17.0中的皮爾遜相關(guān)分析對(duì)發(fā)酵液中菌數(shù)、pH、可溶性磷和有機(jī)酸進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.2.4.2 盆栽土壤的磷組分分析 針對(duì)盆栽實(shí)驗(yàn)，每4 d取盆中土樣一次，每次3個(gè)重復(fù)，在陰涼處陰干，過(guò)篩（100目）后，用鉬銻抗比色法對(duì)土壤有效磷進(jìn)行測(cè)定［14］，用土壤總磷試劑盒（蘇州科銘生物有限公司）對(duì)土壤全磷進(jìn)行測(cè)定。

利用SPSS 17.0中的配對(duì)T檢驗(yàn)對(duì)盆栽土壤中有效磷、總磷和有效磷與總磷比值進(jìn)行顯著性分析。

1.2.4.3 3-吲哚乙酸的測(cè)定 將解磷菌接到King培養(yǎng)基［15］中，30℃，200 r/min搖床培養(yǎng)24 h。取3 mL的菌液12 000 r/min離心15 min，去沉淀。取1 mL的上清夜加入2 mL的Salkowski’s 反應(yīng)液。在暗處混合反應(yīng)30 min后，觀察其變色情況，顏色變?yōu)榉奂t色，則視其產(chǎn)3-吲哚乙酸，顏色越深表示分泌3-吲哚乙酸的能力越強(qiáng)；不變色即為不產(chǎn)3-吲哚乙酸。

1.2.4.4 鐵載體的檢測(cè) 將解磷菌在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)24 h，吸取2 μL菌液點(diǎn)在CAS平板上，30℃培養(yǎng)3 d，觀察其菌落周?chē)欠裼谐赛S色透明圈。

1.2.4.5 固氮能力的檢測(cè) 從無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基平板上挑取解磷菌菌落，用無(wú)菌水制成菌懸液，取5 μL菌懸液點(diǎn)在阿須貝固體培養(yǎng)基上，來(lái)檢測(cè)其是否有固氮能力。

1.2.4.6 解鉀能力的檢測(cè) 從無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基平板上挑取解磷菌落，用無(wú)菌水制成菌懸液，取5 μL菌懸液點(diǎn)在解鉀固體培養(yǎng)基上，檢測(cè)其解鉀能力。

1.2.5 高效解磷促生菌16S rDNA的測(cè)定 使用細(xì)菌總DNA提取試劑盒提取高效解磷促生菌的DNA。利用PCR對(duì)16S rRNA基因片段進(jìn)行擴(kuò)增。50 μL反應(yīng)體系中包括1 μL DNA模板，1 μL上游引物27F，1 μL下 游 引 物1492R［16］，25 μL PCR Master-Mix（2×），19 μL無(wú)菌水。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性45 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。將PCR產(chǎn)物在金維智進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序得到的菌株16S rRNA基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)和分析。

2 結(jié)果

2.1 解磷菌的篩選

利用無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基平板法從土壤樣品中篩選到68個(gè)菌株。在無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基平板上，經(jīng)反復(fù)劃線培養(yǎng)后，得到27株溶磷能力較強(qiáng)且可穩(wěn)定遺傳的解磷菌，由表1可見(jiàn)，27株解磷菌的溶磷圈直徑在0.80-2.55 cm，其中分離自鞍山茄子根際土的菌株qzr14的解磷圈最明顯，直徑為2.55 cm。

圖1 解磷菌液體培養(yǎng)基中的解磷能力和pH

表1 解磷菌的透明圈直徑

圖2 解磷菌解磷能力和pH值相關(guān)性

2.2 解磷菌的解磷能力和pH測(cè)定

將篩選到的27株解磷菌在無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)4 d后，發(fā)現(xiàn)除qzr12外其余26株解磷菌發(fā)酵液中可溶性磷濃度均顯著高于對(duì)照（14.9 mg/L）（P＜0.05），介于44.4-270.0 mg/L范圍內(nèi)（圖1）。菌株qzr14的解磷能力最高，發(fā)酵液上清中可溶性磷濃度為270 mg/L，約是對(duì)照組的18倍。菌株qzr12的解磷能力最低，發(fā)酵液上清中可溶性磷濃度僅為44.4 mg/L。27株解磷菌發(fā)酵液的pH均低于對(duì)照，介于3.2-5.9，菌株qzr14的pH最低，為3.2。菌株P(guān)18的pH最高，為5.9。

對(duì)27株解磷菌發(fā)酵液的溶磷能力和pH值進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)pH與溶磷量存在顯著的負(fù)相關(guān)性（r= -0.671，P＜0.01），但溶磷量和pH之間沒(méi)有線性關(guān)系（圖2）。如解磷菌qzr11的發(fā)酵液pH為5.7，發(fā)酵液上清中可溶性磷濃度為151.0 mg/L，解磷菌qzr12的發(fā)酵液pH為5.7，而發(fā)酵液上清中可溶性磷濃度為44.4 mg/L。即pH相近時(shí)，不同菌株的溶磷能力相差較大。

2.3 盆栽實(shí)驗(yàn)

將篩選到的27株解磷菌作用于黃瓜苗，培養(yǎng)20 d后，測(cè)量黃瓜苗的株高、干重和鮮重，結(jié)果（表2）顯示，通過(guò)與對(duì)照相比，發(fā)現(xiàn)有15株解磷菌對(duì)黃瓜苗的株高有促生作用（3.49%-37.18%），其中p10對(duì)黃瓜苗的株高促生效果最明顯，可提高株高37.18%；有20株菌對(duì)黃瓜苗干重有促生作用（6.15%-98.46%），其中qzr14對(duì)黃瓜苗的干重提高效果最明顯為98.46%；有16株菌對(duì)黃瓜苗鮮重有促生作用（4.21%-61.39%），其中ppt4對(duì)黃瓜苗的鮮重提高效果最明顯為61.39%。菌株qzr14對(duì)株高、干重和鮮重的增長(zhǎng)率分別為27.71%、98.46%和57.01%。通過(guò)對(duì)黃瓜苗的株高、干重和鮮重?cái)?shù)據(jù)的綜合分析，發(fā)現(xiàn)菌株qzr14對(duì)黃瓜苗的促生作用優(yōu)于其他菌株。

表2 解磷菌對(duì)黃瓜苗株高、干重和鮮重的促生作用

2.4 高效促生解磷菌的促生機(jī)制研究

通過(guò)對(duì)高效促生解磷菌qzr14發(fā)酵液中菌數(shù)的監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)0-24 h解磷菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌數(shù)快速增加到1.40×1010個(gè)/mL；24-36 h菌數(shù)小幅度下降到1.09×109個(gè)/mL；36 h之后，菌數(shù)維持在5.54×108-1.09×109個(gè)/mL。通過(guò)對(duì)發(fā)酵液中有機(jī)酸進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該菌在發(fā)酵液中分泌的有機(jī)酸以葡糖酸為主，12-36 h葡糖酸的產(chǎn)量快速增加到1.72 g/L；36-96 h，葡糖酸的產(chǎn)量在1.03-1.78 g/L內(nèi)波動(dòng)，且從36 h開(kāi)始有少量甲酸的分泌，96 h分泌微量的乙酸。發(fā)酵液pH在0-24 h從6.0快速下降到3.6，在24-60 h從3.6緩慢下降到3.2，60 h后一直維持在3.2。發(fā)酵液中的可溶性磷在0-24小時(shí)快速增加到247.07 mg/L，36-96 h可溶性磷緩慢上升至265.08 mg/L（圖3）。通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)溶磷量與pH（r= -0.977，P＜0.01）、菌數(shù)（r=0.806，P＜0.01）和葡糖酸（r=0.759，P＜0.05）均有顯著相關(guān)性。

圖3 解磷菌qzr14的解磷機(jī)制

對(duì)高效促生解磷菌qzr14的促生機(jī)制進(jìn)行研究。在黃瓜苗生長(zhǎng)的20 d內(nèi)，對(duì)土壤中磷組分進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，結(jié)果（表3，圖4）表明，接種qzr14 4 d后，接種qzr14的土壤中有效磷含量（172.56-196.84 mg/kg）均高于對(duì)照（145.63-170.73 mg/kg）；接種qzr14的土壤中總磷含量（764.67-1004.4 mg/kg）均低于對(duì)照（958.93-1161.47 mg/kg）；解磷菌qzr14處理的盆栽土壤中有效磷占總磷的百分比（19.62%-22.57%）始終顯著（P ＜ 0.05）高于空白對(duì)照（12.53%-17.35%）。與對(duì)照相比，經(jīng)qzr14處理的盆栽土壤中總磷減少，有效磷增多，比值增高，說(shuō)明qzr14可溶解土壤中的不溶性磷，促進(jìn)植株對(duì)有效磷的吸收。

解磷菌qzr14的發(fā)酵液與Salkowski’s 反應(yīng)液反應(yīng)后未變色，說(shuō)明該菌不產(chǎn)3-吲哚乙酸。解磷菌qzr14在CAS平板上形成的菌落周?chē)鸁o(wú)黃色暈圈，表明該菌不產(chǎn)鐵載體。在阿須貝固體培養(yǎng)基和解鉀固體培養(yǎng)基上，qzr14均能生長(zhǎng)（圖5），說(shuō)明該菌有固氮和解鉀的能力。

表3 土壤磷組分檢測(cè)

圖4 有效磷占總磷的比值變化

圖5 解磷菌qzr14的促生機(jī)制

2.5 高效解磷促生菌16s rDNA的測(cè)定

將測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST，結(jié)果表明解磷菌qzr14與葡糖醋桿菌Gluconacetobacter sp.相似度為99%。解磷菌qzr14在無(wú)機(jī)磷平板上的菌落形態(tài)呈白色，不透明，表面光滑。顯微鏡下觀察解磷菌qzr14細(xì)胞呈短桿狀，與文獻(xiàn)［17］中描述相似。因此初步鑒定解磷菌qzr14為葡糖醋桿菌屬，故命名為葡糖醋桿菌qzr14。

3 討論

國(guó)內(nèi)外已有較多關(guān)于解磷菌篩選的報(bào)道，解磷菌的解磷能力一般在31.5-519.7 mg/L范圍內(nèi)，多為芽孢桿菌和假單胞菌，其中一株節(jié)桿菌屬細(xì)菌解磷能力最高（519.7 mg/L）［18，19］。在已報(bào)道文獻(xiàn)中，葡糖醋桿菌培養(yǎng)14 d后解磷能力最高可達(dá)323.0 mg/L［20］。本研究從環(huán)境中篩選到27株解磷菌，其中葡糖醋桿菌qzr14解磷能力最高，為270.3 mg/L，在已發(fā)現(xiàn)的解磷菌中居中等水平。葡糖醋桿菌較多的應(yīng)用在食品發(fā)酵和醫(yī)藥中［17］。1989年，Gillis等［21］發(fā)現(xiàn)了固氮葡糖醋桿菌的固氮功能，隨后發(fā)現(xiàn)其還具有解磷（解磷圈直徑25-31 mm）、分泌激素、拮抗病原菌等能力，近年來(lái)該菌作為固氮微生物已被廣泛應(yīng)用，并對(duì)甘蔗苗、 豇豆等具有較好的促生效果［22］。除固氮葡糖醋桿菌外，其他葡糖醋桿菌促生機(jī)制的研究還鮮有報(bào)道。

溶磷菌普遍被認(rèn)為主要通過(guò)分泌有機(jī)酸、質(zhì)子和多糖等機(jī)制溶解不溶性磷。不同解磷菌的解磷機(jī)制不同，有些菌通過(guò)其中的一種機(jī)制，有些菌通過(guò)多種機(jī)制導(dǎo)致磷礦粉的溶解［23］。解磷菌對(duì)不溶性磷的溶解往往伴隨著發(fā)酵液中pH的降低。本研究發(fā)現(xiàn)27株解磷菌的發(fā)酵液中溶磷量和pH值有顯著的負(fù)相關(guān)性，說(shuō)明培養(yǎng)基酸度的升高在溶磷中發(fā)揮著重要的作用，但是溶磷量和pH值不成線性關(guān)系，說(shuō)明解磷菌的溶磷作用還可能與有機(jī)酸種類(lèi)和多糖等有關(guān)。趙小蓉等［24］研究結(jié)果也表明培養(yǎng)介質(zhì)酸度升高是溶解磷礦粉的重要條件。本研究通過(guò)對(duì)葡糖醋桿菌qzr14的解磷機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，該菌的解磷能力與pH相關(guān)性接近1，說(shuō)明pH的降低是葡糖醋桿菌qzr14溶磷的主要原因。葡糖醋桿菌qzr14的解磷能力還與菌數(shù)和葡糖酸顯著相關(guān)。隨著菌數(shù)的上升，葡萄酸產(chǎn)量也明顯提高，pH顯著降低，解磷量明顯增加，說(shuō)明pH、菌數(shù)和葡糖酸在溶磷過(guò)程中均發(fā)揮著重要的作用。葡糖酸是微生物解磷過(guò)程中分泌的常見(jiàn)的有機(jī)酸之一［25，26］。葡糖酸在搖瓶中可直接溶解不溶性磷［27］，Hameeda等［28］的研究也表明葡糖酸和微生物的解磷能力存在正相關(guān)性。本研究結(jié)果還表明解磷菌數(shù)量與解磷能力存在顯著正相關(guān)性。Chen等［29］的研究也證明解磷菌生長(zhǎng)速率、活性等和解磷能力密切相關(guān)。因此推斷葡糖醋桿菌qzr14的數(shù)量在解磷過(guò)程中發(fā)揮著尤為重要的作用，可能是其解磷的必要條件。

關(guān)于解磷菌對(duì)小麥的促生作用已有較多報(bào)道，其中Schoebitz［30］的研究表明熒光假單胞菌的解磷能力高于沙雷氏菌，但對(duì)小麥的促生作用卻低于沙雷氏菌。本研究通過(guò)分析27株解磷菌對(duì)黃瓜苗的促生作用也發(fā)現(xiàn)解磷菌的解磷能力和其對(duì)植物的促生作用沒(méi)有必然聯(lián)系。這可能是因?yàn)椋?）受環(huán)境因素的影響，不同解磷菌在土壤中的定殖能力和溶磷能力不同，從而造成其對(duì)植物提供的速效磷不同；（2）不同的解磷菌對(duì)土壤中微生物群落的影響不同，造成植物生長(zhǎng)的微生態(tài)環(huán)境不同；（3）一些解磷菌不但可通過(guò)提供較多的有效磷及金屬元素，而且還可通過(guò)產(chǎn)生生物素、鐵載體、HCN等物質(zhì)促生植物生長(zhǎng)［31］。齊海季等［32］的研究表明，土壤速效磷含量在213 mg/kg時(shí)對(duì)黃瓜苗仍有顯著的促生作用。本研究篩選到的葡糖醋桿菌qzr14與對(duì)照相比，可使土壤中總磷量減少，有效磷增多，有效磷占總磷的比例提高，并可顯著提高黃瓜苗的鮮重、干重和株高。本研究篩選到的葡糖醋桿菌qzr14與對(duì)照相比，可使土壤中總磷量減少，有效磷增多，有效磷占總磷的比例提高，并可顯著提高黃瓜苗的鮮重、干重和株高，說(shuō)明葡糖醋桿菌qzr14可將土壤中不溶性磷轉(zhuǎn)化為有效磷，為植物提供充足的磷及其他營(yíng)養(yǎng)元素，從而促進(jìn)黃瓜苗的生長(zhǎng)。葡糖醋桿菌qzr14在平板上具有固氮和解鉀能力，說(shuō)明葡糖醋桿菌qzr14還可能通過(guò)固氮和解鉀作用促進(jìn)黃瓜苗生長(zhǎng)，但這有待于我們進(jìn)一步的研究和證明。

4 結(jié)論

從環(huán)境中篩選到27株解磷菌，其中葡糖醋桿菌qzr14解磷能力最高（270 mg/L）。葡糖醋桿菌qzr14對(duì)黃瓜苗具有較好的促生效果，與對(duì)照相比，可提高黃瓜苗干重98.46%，鮮重57.01%，株高27.71%。葡糖醋桿菌qzr14可能主要通過(guò)分泌葡糖酸分解土壤不溶性磷，提高黃瓜苗對(duì)有效磷的吸收，促進(jìn)黃瓜苗生長(zhǎng)。葡糖醋桿菌qzr14還可能通過(guò)固氮和解鉀作用促進(jìn)黃瓜苗生長(zhǎng)。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

The Screening of Efficient Phosphorus-solubilizing Bacteria and the Primary Study on Its Mechanism of Plant-growth-promoting

Yin Tingting1，2Wang Jingjing2Liu Ying2Liang Yajie2Wang Xingbiao2Han Yifan2Wang Xia3Cheng Meijuan4Huang Zhiyong2
（1. College of Biology Engineering，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457；2. Tianjin Key Laboratory for Industrial Biological Systems and Bioprocessing Engineering，Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308；3. Huangshan Zhongke Xinjia Biological Technology Co.， Ltd.，Huangshan 245000；4. Commission of Agriculture in Huizhou District of Huangshan City，Huangshan 245061）

With the increasing use of chemical fertilizer， problems such as soil hardening and water pollution become more and more serious. In order to invent a new type of fertilizer to replace chemical fertilizer， 27 bacterial strains were screened from environment by inorganicphosphorus solid medium. Mo-Sb colorimetry was used to evaluate the phosphorus-solubilizing capacity of 27 bacterial strains， and strain qzr14 had the highest capacity of phosphorus-solubilizing（270 mg/L）. The growth-promoting effect of 27 bacterial strains were studied by pot experiments， qzr14 showed higher capacity on growth-promoting effect than others， increasing the height， dry weight and fresh weight of cucumber seedlings 27.7%， 98.4% and 57.0% than CK， respectively. The real-time monitoring organic acids in medium inoculated with qzr14 indicated that this strain mainly secreted gluconic acid to solubilize phosphorus. According to the analysis of phosphorus fractions in the soil of pot experiment， available P accounted 19.62%-22.57% of total P in the soil after 4 days treated by qzr14， while 12.53%-17.35% in the soil of CK， thus qzr14 solubilized insoluble-phosphorous in the soil. The results of biochemical testing demonstrated that qzr14 had the capacity of K-solubilizing and N-fixing；qzr14 was identified as Gluconacetobacter sp. by 16s rDNA analysis. In this article， Gluconacetobacter sp. qzr14 thatmay efficiently solubilize phosphorus is screened from the environment， and its growth-promoting mechanism is firstly reported. qzr14 solubilizes phosphorus in the soil by secreting gluconic acid， consequently more organic phosphorus is supplied to cucumber seedlings and therefore their growth is promoted. Also it probably has the ability of K-solubilizing and N-fixing to promote the growth of cucumber seedlings， conclusively this strain would be a potential microbial fertilizer.

screening of strain；efficient phosphorus-solubilizing bacteria；mechanism of plant-growth-promoting

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.034

2014-10-09

天津市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（12ZCZDSY15300）

銀婷婷，女，碩士研究生，研究方向：微生物生態(tài)；E-mail：yintingbisheng@126.com

黃志勇，男，研究員，研究方向：微生物生態(tài)；E-mail：huang_zy@tib.cas.cn