產(chǎn)D-乳酸重組大腸桿菌ptsG基因的敲除及其混合糖同步發(fā)酵

丁小云 顧健健 王永澤 趙錦芳 王金華 趙筱

（湖北工業(yè)大學(xué)輕工學(xué)部 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430068）

產(chǎn)D-乳酸重組大腸桿菌ptsG基因的敲除及其混合糖同步發(fā)酵

丁小云 顧健健 王永澤 趙錦芳 王金華 趙筱

（湖北工業(yè)大學(xué)輕工學(xué)部 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430068）

為構(gòu)建能夠同時(shí)高效利用五碳糖和六碳糖發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的重組大腸桿菌工程菌，以能高效利用五碳糖發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的大腸桿菌工程菌E.coli JH13為出發(fā)菌株，通過(guò)Red同源重組技術(shù)敲除葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)基因ptsG。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ptsG缺陷菌株E.coli JH15在10%混合糖（5%葡萄糖和5%木糖）培養(yǎng)基中發(fā)酵，可同時(shí)利用五碳糖和六碳糖以完成發(fā)酵；而對(duì)照菌葡萄糖消耗完才利用木糖，發(fā)酵結(jié)束還有 18 g/L木糖殘留；JH15乳酸產(chǎn)量為83.04 g/L，相比于對(duì)照菌株提高了25.86%；在稻草秸稈水解液中發(fā)酵，JH15同時(shí)利用葡萄糖、木糖和L-阿拉伯糖，乳酸產(chǎn)量為25.15 g/L，轉(zhuǎn)化率為86.42%。JH15 作為能利用混合糖同步發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的大腸桿菌工程菌，它的成功構(gòu)建為利用廉價(jià)的木質(zhì)纖維素水解物為原料發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸提供參考依據(jù)。

重組大腸桿菌工程菌；D-乳酸；ptsG基因；Red同源重組；混合糖

D-乳酸是一種重要的手性中間體，其聚合物具有較高的熱穩(wěn)定性，可制成生物可降解材料，因此其生產(chǎn)和應(yīng)用受到廣泛關(guān)注，成為目前研究的熱點(diǎn)［1，2］。微生物發(fā)酵法由于原料來(lái)源廣泛、生產(chǎn)成本低、光學(xué)純度高、安全性高等優(yōu)點(diǎn)已成為國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)D-乳酸的主要方法［3］。目前D-乳酸的生產(chǎn)主要以葡萄糖作為底物。自然界中生物質(zhì)種類繁多，分布廣泛，且數(shù)量巨大，價(jià)格低廉。木質(zhì)纖維素的水解產(chǎn)物富含大量糖類，包括葡萄糖、木糖、阿拉伯通和半乳糖等［4］。這些混合糖可以作為碳源用以微生物發(fā)酵生產(chǎn)。如果能以木質(zhì)纖維素水解后的混合糖替代葡萄糖作為碳源用于微生物發(fā)酵就能夠節(jié)省生產(chǎn)成本，同時(shí)將如秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物加以利用，變廢為寶，有益于保護(hù)環(huán)境。但是利用混合糖進(jìn)行發(fā)酵面臨著兩個(gè)難題：（1）混合糖中的六碳糖較容易被微生物利用，但木糖等五碳糖很少有微生物能夠利用；（2）利用混合糖發(fā)酵時(shí)大腸桿菌優(yōu)先利用六碳糖，待六碳糖消耗完才利用五碳糖，而利用五碳糖特別是木糖前有一段很長(zhǎng)的停滯期，相比于純木糖其利用速度較慢，且通常木糖沒(méi)能利用完［5］。

在兩種混合碳源環(huán)境中大腸桿菌通常優(yōu)先利用其中容易代謝的一種（通常是葡萄糖），待前一種耗盡和一段停滯期后再開(kāi)始利用另一種碳源，這種葡萄糖代謝對(duì)其他碳源利用的抑制作用被稱為分解代謝產(chǎn)物阻遏（Carbon catabolite repression，CCR），有時(shí)也稱為葡萄糖效應(yīng)（Glucose effect）［6-8］。大量研究表明，CCR的產(chǎn)生與糖類磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)）有關(guān)［9］。PTS系統(tǒng)負(fù)責(zé)特異性地將葡萄糖從細(xì)胞外跨膜主動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞，并在此過(guò)程中，將葡萄糖磷酸化為葡萄糖-6-磷酸，進(jìn)入糖酵解途徑［10］。PTS系統(tǒng)包括EⅠ、HPr以及EIIs，前兩者是非特異性的可溶性胞質(zhì)蛋白，后者為蛋白復(fù)合體，包括EIIMan、EIIFru、EIIBgl、EIIAGlc、EIICBGlc等，其中crr 基因編碼的EIIAGlc以及ptsG基因編碼的EIICBGlc在葡萄糖磷酸化轉(zhuǎn)運(yùn)中起主要作用［11，12］。通過(guò)敲除ptsG基因可以降低葡萄糖由胞外向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的速度，提高胞內(nèi)EIIAGlc的磷酸化水平，降低葡萄糖抑制效應(yīng)。

本研究選用糖類代謝范圍廣的大腸桿菌工程菌E.coli JH13為出發(fā)菌株，該菌是在能利用五碳糖產(chǎn)高純度L-乳酸的大腸桿菌基因工程菌E.coli JH12［13-16］的基礎(chǔ)上通過(guò)Red同源重組技術(shù)將乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）的L-乳酸脫氫酶（L-lactatedehydrogenase，L-ldh）基因置換成D-乳酸脫氫酶（ldhA）基因，構(gòu)建的一株能利用五碳糖產(chǎn)D-乳酸的大腸桿菌基因工程菌。在該菌的基礎(chǔ)上通過(guò)Red同源重組技術(shù)敲除葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)基因ptsG，降低葡萄糖抑制效應(yīng)，構(gòu)建一株能夠同時(shí)高效利用五碳糖和六碳糖發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的重組大腸桿菌工程菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 出發(fā)菌株E.coli JH13是能夠高效利用五碳糖發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的工程菌，其來(lái)源于野生菌株E.coli B，菌株JH13敲除了丙酮酸甲酸裂解酶（focA-pflB）、延胡索酸還原酶（frdABCD）、乙酸激酶（ackA）、乙醇脫氫酶（adhE）基因，并通過(guò)無(wú)氧啟動(dòng)子融合表達(dá)技術(shù)倍增了NADH還原力，能夠在無(wú)氧條件下良好生長(zhǎng)，由本實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒pKD46（溫度敏感型復(fù)制子，Ampr）和pKD4（含有卡那霉素抗性基因Kanr）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 DNA marker，PCR Master Mix購(gòu)自Fermentas公司，氨芐青霉素和卡那霉素購(gòu)自Mersco公司，D-乳酸標(biāo)樣購(gòu)于Sigma公司，PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，分析純葡萄糖、木糖及其他無(wú)機(jī)鹽等購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)。

Sartorius BB-8846880發(fā)酵罐（德國(guó)Sartorius Stedim Biotech公司），Waters e2695型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），mycycler PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司），MicroPluser 電轉(zhuǎn)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉5 g/L；種子培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基加2%葡萄糖；發(fā)酵培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基加5%葡萄糖和5%木糖；選擇培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基加2%葡萄糖加抗生素（50 mg/L氨芐青霉素或卡那霉素）。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物設(shè)計(jì) 根據(jù)質(zhì)粒pKD4及ptsG的基因序列設(shè)計(jì)敲除引物P1、P2，這對(duì)引物為兩側(cè)帶ptsG同源臂的卡那霉素抗性基因片段的擴(kuò)增引物，靠近5'端未加下劃線的序列與ptsG基因序列相同，靠近3'段加下劃線的序列與質(zhì)粒pKD4上卡那霉素抗性基因序列一致；P3、P4為ptsG基因敲除后的驗(yàn)證引物，該引物序列與擴(kuò)增引物上ptsG同源臂序列一致，如表 1所示。

1.2.2 ptsG基因的敲除 根據(jù)ptsG基因序列設(shè)計(jì)特異性引物P1和P2，該對(duì)引物一端與ptsG基因序列一致，另一端為卡那霉素抗性基因序列。以pKD4質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到兩端帶有ptsG 同源臂的卡那霉素抗性基因片段。擴(kuò)增條件為：95℃3 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。用CaCl2法將pKD46轉(zhuǎn)化到E.coli JH13細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)氨芐青霉素抗性平板篩選后得到陽(yáng)性菌落。通過(guò)電轉(zhuǎn)方法將擴(kuò)增的卡那霉素抗性基因片段電轉(zhuǎn)到L-阿拉伯糖誘導(dǎo)過(guò)的E.coli JH13/pKD46感受態(tài)細(xì)胞中，30℃復(fù)蘇培養(yǎng)2 h，立刻涂布于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基抗性平板上。37℃培養(yǎng)24 h，挑選生長(zhǎng)較大的單菌落在卡那霉素抗性平板上轉(zhuǎn)接2-3次，以P3、P4為引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。將ptsG基因成功敲除的菌株命名為E.coli JH15。

表1 敲除基因的擴(kuò)增引物和鑒定引物

1.2.3 發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng) 從LB平板上挑一個(gè)單菌落，接種于含有10 mL種子培養(yǎng)液的無(wú)氧管中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。取2 mL菌液接種于300 mL種子液中，37℃下150 r/min培養(yǎng)至OD600= 1.0-1.5。以10%的接種量將菌液接種至3 L發(fā)酵培養(yǎng)基（5%葡萄糖加5%木糖）中，置于帶自動(dòng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的7 L發(fā)酵罐中，37℃下150 r/min培養(yǎng)發(fā)酵，流加3 mol/L Ca（OH）2控制pH為7.0。定時(shí)取樣，測(cè)定菌體濃度、葡萄糖、木糖、乳酸及其它代謝產(chǎn)物的濃度。

1.2.4 秸稈水解液發(fā)酵 稱取300 g粉碎后的秸稈，按10%（W/V）固液比加入2%（W/V）H2SO4，混勻后置于高壓滅菌鍋中處理1 h，冷卻后添加Ca（OH）2至pH達(dá)到10。置于90℃水浴鍋保持30 min，待其冷卻至室溫，用6 mol/L的H2SO4或HCl將pH調(diào)至中性，離心或?yàn)V紙過(guò)濾除去不溶性固體，液體部分裝入發(fā)酵罐滅菌。稱取10 g/L蛋白胨和5 g/L酵母粉，單獨(dú)滅菌后加入發(fā)酵罐。以10%的接種量進(jìn)行接種，并用無(wú)菌水定容至3 L。37℃下150 r/min培養(yǎng)發(fā)酵，流加3 mol/L Ca（OH）2控制pH為7.0。定時(shí)取樣，測(cè)定葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及乳酸的濃度。

1.2.5 發(fā)酵產(chǎn)物檢測(cè)與分析 菌體濃度測(cè)定時(shí)先用3 mol/L HCl溶液酸解，再在可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)600 nm下OD值。葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和有機(jī)酸采用高效液相色譜法分析，色譜柱為Bio-Rad HPX 87H，流動(dòng)相為4 mmol/L H2SO4，流速0.5 mL/min，柱溫40℃，檢測(cè)器為PDA、ELS檢測(cè)器。

2 結(jié)果

2.1 ptsG基因缺陷菌株JH15的鑒定

用鑒定引物P3、P4對(duì)ptsG缺失菌株JH15進(jìn)行PCR驗(yàn)證，以出發(fā)菌株JH13為對(duì)照。由于鑒定引物P3、P4的基因序列與卡那霉素抗性基因擴(kuò)增引物上ptsG同源臂的基因序列一致，所以敲除成功菌株擴(kuò)增出來(lái)的片段大小應(yīng)與卡那霉素抗性基因擴(kuò)增片段的大小相同。結(jié)果如圖 1所示，以JH13為底物擴(kuò)增的ptsG片段大小為1 434 bp；JH15和卡那霉素抗性基因的擴(kuò)增片段大小均為1 550 bp，與ptsG自身長(zhǎng)度相差116 bp，表明ptsG基因已成功敲除。

2.2 混合糖發(fā)酵

2.2.1 JH13和JH15菌體生長(zhǎng)曲線 為了測(cè)試ptsG缺陷菌株JH15利用混合糖發(fā)酵的情況，本實(shí)驗(yàn)在帶有pH 自動(dòng)調(diào)節(jié)功能的7 L發(fā)酵罐中進(jìn)行。JH13和JH15菌體生長(zhǎng)曲線如圖2所示，出發(fā)菌JH13發(fā)酵到24 h時(shí)OD600達(dá)到4.6，之后進(jìn)入穩(wěn)定期；工程菌JH15在36 h進(jìn)入穩(wěn)定期，OD600值為5.3。在0-24 h之間JH13的OD600值比JH15大；但隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵24 h后JH15的OD600值反而超過(guò)了JH13。JH15的最大OD600值是JH13的1.15倍。

2.2.2 葡萄糖和木糖消耗曲線 JH13和JH15耗糖情況如圖 3 所示，在114 h的發(fā)酵過(guò)程中，ptsG缺陷菌株JH15在混合糖發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖和木糖同時(shí)消耗；而對(duì)照菌JH13優(yōu)先利用葡萄糖，待葡萄糖消耗完才開(kāi)始利用木糖。說(shuō)明ptsG基因的敲除確實(shí)能夠降低葡萄糖抑制效應(yīng)，同時(shí)利用葡萄糖和木糖進(jìn)行發(fā)酵。

JH15在發(fā)酵36 h時(shí)葡萄糖消耗完，發(fā)酵114 h木糖利用完，發(fā)酵結(jié)束；JH13發(fā)酵21 h葡萄糖消耗完才開(kāi)始利用木糖，發(fā)酵114 h時(shí)還有18 g/L木糖殘留。表 2 所示，JH15葡萄糖的消耗速率為1.39 g/（L·h），木糖消耗速率為0.44 g/（L·h）；JH13葡萄糖消耗速率為2.38 g/（L·h），木糖消耗速率為0.34 g/（L·h）。與JH13相比JH15葡萄糖消耗速率降低了41.6%，但是木糖的消耗速率提高了29.41%。這是由于ptsG基因的敲除阻斷了葡萄糖的主要運(yùn)輸途徑（PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)），導(dǎo)致葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)速度降低，但是敲除ptsG基因降低了代謝產(chǎn)物阻遏效應(yīng)，在利用葡萄糖的同時(shí)利用木糖，這樣就提高了木糖的利用率。

圖1 ptsG基因敲除驗(yàn)證

圖2 ptsG缺陷菌JH15和出發(fā)菌JH13在混合糖培養(yǎng)基中的菌體生長(zhǎng)曲線

2.2.3 乳酸產(chǎn)量 圖 4 和表2所示，發(fā)酵30 h以前對(duì)照菌JH13的乳酸產(chǎn)量高于ptsG缺陷菌株JH15，發(fā)酵30 h后JH15的乳酸產(chǎn)量反而高于JH13；發(fā)酵114 h，JH15乳酸產(chǎn)量為83.04 g/L，轉(zhuǎn)化率為83.04%；而JH13乳酸產(chǎn)量為66.02 g/L，轉(zhuǎn)化率為80.51%。實(shí)驗(yàn)表明ptsG基因的敲除使得JH15相比于JH13最大生產(chǎn)強(qiáng)度提高了2.37%，平均生產(chǎn)強(qiáng)度提高了25.86%。

圖3 ptsG缺陷菌JH15和對(duì)照菌JH13混合糖發(fā)酵（7 L發(fā)酵罐，50 g/L葡萄糖，50 g/L木糖）糖消耗曲線

圖4 ptsG缺陷菌JH15和對(duì)照菌JH13混合糖發(fā)酵（7 L發(fā)酵罐，50 g/L葡萄糖，50 g/L木糖）的乳酸產(chǎn)量曲線

2.3 稻草秸稈水解液發(fā)酵

為了驗(yàn)證ptsG缺陷菌株JH15利用木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵的情況，本實(shí)驗(yàn)以稻草秸稈為原料經(jīng)過(guò)2%的H2SO4酸解和Ca（OH）2脫毒處理后得到秸稈水解液。以秸稈水解液為碳源，添加10 g/L蛋白胨和5 g/L酵母粉，配制成3 L發(fā)酵培養(yǎng)基。水解液中主要含有葡萄糖、木糖和L-阿拉伯糖，其中葡萄糖濃度為16.5 g/L、木糖9.8 g/L、L-阿拉伯糖2.8 g/L。

表2 JH13和JH15在混合糖（5%葡萄糖和5%木糖）發(fā)酵中的比較

JH15利用秸稈水解液發(fā)酵情況如圖5所示，JH15生長(zhǎng)速度逐漸加快，12 h時(shí)OD600達(dá)到2.5，隨后生長(zhǎng)速度減慢。JH15在發(fā)酵過(guò)程中同時(shí)利用葡萄糖、木糖和L-阿拉伯糖，15 h時(shí)發(fā)酵結(jié)束。其中葡萄糖在12 h消耗完，消耗速率為1.37 g/（L·h）；木糖和L-阿拉伯糖15 h消耗完，木糖消耗速率為0.65 g/（L·h），L-阿拉伯糖消耗速率為0.19 g/（L·h）。發(fā)酵結(jié)束時(shí)乳酸產(chǎn)量為25.12 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.67 g/（L·h），轉(zhuǎn)化率為86.42%。

圖5 JH15利用稻草秸稈水解液發(fā)酵菌體生長(zhǎng)、糖消耗和乳酸產(chǎn)量曲線

3 討論

國(guó)內(nèi)外關(guān)于利用ptsG缺陷菌株進(jìn)行混合糖發(fā)酵的研究已有報(bào)道。Nichols等［17］敲除了產(chǎn)乙醇大腸桿菌工程菌的ptsG基因，獲得的ptsG缺陷菌株能夠同時(shí)利用8%混合糖（葡萄糖、木糖和阿拉伯糖）進(jìn)行發(fā)酵，乙醇產(chǎn)率達(dá)到理論值87%-94%。嚴(yán)濤等［18］構(gòu)建的ptsG缺陷菌株E.coli SZ470P在5%混合糖（2.5%木糖和2.5%葡萄糖）培養(yǎng)基中能同時(shí)利用葡萄糖和木糖進(jìn)行發(fā)酵，木糖消耗量是對(duì)照菌株的3.8倍，乙醇產(chǎn)量提高了14.32%。但是關(guān)于同時(shí)利用五碳糖和六碳糖發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的文獻(xiàn)尚未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以能夠高效利用木糖產(chǎn)D-乳酸的重組大腸桿菌工程菌JH13為出發(fā)菌株，利用Red同源重組技術(shù)敲除ptsG基因，成功構(gòu)建一株能夠同時(shí)利用五碳糖和六碳糖發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的工程菌E.coli JH15。在混合糖培養(yǎng)基中，在前24 h，JH15生長(zhǎng)的比JH13緩慢，是因?yàn)榍贸似咸烟强缒まD(zhuǎn)運(yùn)的主要基因ptsG，葡萄糖的攝取速度降低；24 h后JH15的菌體密度超過(guò)了JH13，是因?yàn)閜tsG缺陷菌JH15降低了葡萄糖效應(yīng)，在混合糖培養(yǎng)基中能更好的利用碳源來(lái)維持菌體的生長(zhǎng)。在10%混合糖（5%葡萄糖和5%木糖）發(fā)酵中，JH15由于ptsG基因的敲除降低了葡萄糖效應(yīng)，因此能夠完全利用葡萄糖和木糖，并且完成發(fā)酵，最終乳酸產(chǎn)量為83.04 g/L；對(duì)照菌株JH13先利用葡萄糖，待葡萄糖消耗完才利用木糖，發(fā)酵結(jié)束時(shí)還有18 g/L木糖殘留，乳酸產(chǎn)量為66.02 g/L。相比于對(duì)照菌，JH15木糖消耗速度提高了29.41%，乳酸產(chǎn)量提高了25.86%。因此ptsG基因的敲除能夠降低葡萄糖抑制效應(yīng)，提高木糖的利用率，提高D-乳酸的產(chǎn)量。在稻草秸稈水解液發(fā)酵中，JH15同時(shí)利用葡萄糖、木糖和L-阿拉伯糖，15 h發(fā)酵結(jié)束，乳酸產(chǎn)量為25.15 g/L，轉(zhuǎn)化率為86.42%。稻草秸稈水解液發(fā)酵實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了菌株JH15能夠很好的利用秸稈水解液發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸，為利用廉價(jià)的木質(zhì)纖維素水解物為原料發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸提供參考依據(jù)。

4 結(jié)論

通過(guò)Red 同源重組技術(shù)敲除ptsG基因而成功構(gòu)建的D-乳酸工程菌E.coli JH15，具有同時(shí)利用五碳糖和六碳糖發(fā)酵的能力。該菌經(jīng)證實(shí)在10%的混合糖（5%葡萄糖和5%木糖）發(fā)酵過(guò)程中能有效的利用完葡萄糖和木糖，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到83.04%；并且能夠很好的利用稻草秸稈水解液發(fā)酵。

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（責(zé)任編輯李楠）

The Knockout of Gene ptsG of Recombinant Escherichia coli Producing D-lactic Acid and the Simultaneous Fermentation of Mixed Sugars

Ding Xiaoyun Gu Jianjian Wang Yongze Zhao Jinfang Wang Jinhua Zhao Xiao
（Key Laboratory of Fermentation Engineering of Ministry of Education，Hubei University of Technology，Wuhan 430068）

In order to construct a recombinant engineering Escherichia coli strain that yields D-lactic acid in the simultaneous efficient fermentation of pentose and hexose， having an engineering E. coli JH13 that efficiently ferment the pentose to produce D-lactic acid as an original strain， a glucose transmembrane transporter gene ptsG was knocked out by the technique of Red homologous recombination. The fermentative results showed that in the 10% mixed sugars（5% glucose and 5% xylose）， the ptsG-deleted strain E. coli JH15 simultaneously utilized pentose and hexose to complete the fermentation；however， the control strain started to utilize the xylose only after glucose was consumed up，and 18 g/L xylose still remained after the fermentation completed. The production of D-lactic acid by JH15 reached 83.04 g/L， and 25.86% higher than that by control strain JH13. The JH15 as a E. coli strain of producing D-lactic acid during simultaneous fermentation with mixed sugars， its construction provides a reference for producing the D-lactic acid in fermentation while utilizing the low-cost hydrolyzed components of lignocelluloses materials as raw material.

recombinant Escherichia coli；D-lactic acid；ptsG；Red homologous recombination；mixed sugars

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.032

2014-12-17

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（NSFC31070094），湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2011CDA008，2011CDB076），湖北工業(yè)大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（BSQD12143）

丁小云，男，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程；E-mail：858709213@qq.com

趙筱，女，博士，研究方向：生物質(zhì)能源與生物質(zhì)材料；E-mail：elaine82_82@hotmail.com