紅鰭東方鲀干擾素γ基因的原核表達

馬普孫賽紅王玉芳李慧劉海映姜志強仇雪梅劉洋張濤王秀利

（1. 大連海洋大學水產(chǎn)與生命學院，大連 116023；2. 大連海洋大學海洋科技與環(huán)境學院，大連 116023；3. 大連天正實業(yè)有限公司，大連 116011）

紅鰭東方鲀干擾素γ基因的原核表達

馬普1孫賽紅1王玉芳1李慧1劉海映2姜志強1仇雪梅1劉洋1張濤3王秀利1

（1. 大連海洋大學水產(chǎn)與生命學院，大連 116023；2. 大連海洋大學海洋科技與環(huán)境學院，大連 116023；3. 大連天正實業(yè)有限公司，大連 116011）

旨在探究一種簡單高效的獲取重組紅鰭東方鲀IFNγ蛋白的方法。提取紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）腎臟組織的總RNA，并以其為模板進行RT-PCR擴增干擾素γ（IFNγ）基因序列。將IFNγ成熟肽序列與表達載體pET-32a（+）相連，成功構(gòu)建了重組表達載體PET-32a-IFNγ。將其轉(zhuǎn)化入E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞后獲得了重組表達IFNγ的基因工程菌。經(jīng)IPTG誘導，pET-32a-IFNγ在BL21中得到了表達。通過對表達產(chǎn)物的純化和Western blotting檢測，結(jié)果顯示紅鰭東方鲀IFNγ基因在大腸桿菌中的表達準確，且目的蛋白表達量較高。

紅鰭東方鲀；干擾素γ；原核表達

紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）是近海底層肉食性魚類，其生殖腺和肝臟等內(nèi)臟中產(chǎn)生的河豚毒具有潛在的醫(yī)藥開發(fā)價值，在臨床上具有廣闊的前景［1］。紅鰭東方鲀是一種重要的經(jīng)濟魚類，但水環(huán)境中存在的大量細菌和病毒使魚類的皮膚和黏膜不斷受到侵襲，特別是弧菌、愛德華氏菌等的感染給紅鰭東方鲀的大規(guī)模養(yǎng)殖造成嚴重損失。干擾素（Interferon，IFN）在1957年首次被Isaacs提出，干擾素系統(tǒng)是脊椎動物抵抗病原體侵害的天然防御系統(tǒng)之一，在先天性免疫應(yīng)答中能夠有效廣泛地抑制感染的傳播［2］。IFNs 是一個蛋白家族，由3種主要類型組成：Ⅰ型干擾素（IFN-α、-β和-ω），Ⅱ型干擾素（IFN-γ）和Ⅲ型干擾素（IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3，又分別被稱為IL-29、IL-28A和IL-28B），IFNs 對很多生物反應(yīng)有影響，包括對病原體的防御機制、對先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中效應(yīng)細胞的管理和抗腫瘤效應(yīng)［3］。IFNs 通過細胞表面受體作用使細胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，抑制病毒在宿主細胞中的復(fù)制。另外，IFNs 還可增強自然殺傷細胞（NK細胞）、巨噬細胞和T淋巴細胞的活力，從而起到免疫調(diào)節(jié)作用，增強抗病毒能力，對細胞生長和細胞分化也有很重要的調(diào)節(jié)活性［4-6］。

IFNγ主要由T細胞和NK細胞分泌，對抵抗病毒感染和胞內(nèi)細菌感染至關(guān)重要，能夠直接增強腫瘤細胞的免疫原性，激發(fā)對轉(zhuǎn)化細胞的免疫應(yīng)答［7-9］。IFNγ在免疫系統(tǒng)中的重要性除了其直接抑制病毒復(fù)制的能力外，更重要的是源于它對免疫刺激和免疫調(diào)節(jié)的影響，而且還能夠直接或間接地上調(diào)主要組織相容性復(fù)合體（MHCⅠ和MHCⅡ）的抗原提呈作用［10］。IFNγ同時還是巨噬細胞的激活劑，能夠增強巨噬細胞殺死細菌、原生動物和病毒性病原體的能力［11］。哺乳動物的IFNγ能夠保護宿主抵抗胞內(nèi)病原體，如利什曼原蟲、李斯特單核細胞增生菌和結(jié)核分枝桿菌等的侵染，這使得IFNγ在調(diào)節(jié)巨噬細胞介導的抗菌反應(yīng)中的作用更為明顯［12］。IFNγ基因已經(jīng)在許多魚類中被克隆出來。斑點叉尾鮰（Channel catfish）能夠產(chǎn)生兩種IFNγ mRNAs（IFN-γ1和IFN-γ2），這兩個mRNA在不同的組織和細胞類型中有不同的表達形式，牙鲆（Paralichthys olivaceus）同樣有兩種IFNγ轉(zhuǎn)錄本（IFN-γ1和IFN-γ2），這兩個轉(zhuǎn)錄本非常相似，僅有3個核苷酸不同［13］。紅鰭東方鲀的IFNγ基因在2004年首次被Zou［14］克隆出來。

在國內(nèi)，應(yīng)用于禽、豬、牛、犬等的基因工程干擾素抗病毒制劑已得到廣泛發(fā)展［15］。徐正中等［16］通過原核表達得到的重組牛IFNγ蛋白，有較高的抵抗病毒的能力。代麗等［17］克隆了雞IFNγ基因，并通過原核表達得到該重組蛋白，利用雞成纖維細胞—新城疫（CEF-NDV）系統(tǒng)檢測該重組蛋白的抗病毒活性發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過稀釋后的重組蛋白能有效抵抗病毒的攻擊。崔然［18］構(gòu)建了豬IFNγ基因的原核表達載體，并純化出該重組蛋白，進一步研究發(fā)現(xiàn)該蛋白具有抵抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndromt virus，PRRSV）和水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virtes，VSV）的能力。張海玲等［19］構(gòu)建了北極狐IFNγ的原核表達載體，并以包涵體的形式成功表達了該目的蛋白的成熟肽?；钚詼y定表明，在非洲綠猴腎細胞（Vero）和犬腎細胞（MDCK）細胞中復(fù)性后的重組北極狐IFNγ蛋白能夠抑制VSV病毒的繁殖。然而，有關(guān)魚類基因工程干擾素制劑的研究并不是很多，本研究通過基因重組技術(shù)將紅鰭東方鲀IFNγ基因連接到表達載體pET-32a（+），并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中表達，得到重組紅鰭東方鲀IFNγ蛋白，旨在為進一步深入研究重組紅鰭東方鲀IFNγ蛋白活性及其在紅鰭東方鲀健康養(yǎng)殖上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用健康紅鰭東方鲀采自大連天正實業(yè)有限公司。采集紅鰭東方鲀腎臟組織并迅速凍存于液氮中，存于-80℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 取-80℃冰箱中凍存的紅鰭東方鲀腎臟組織約0.1 g，按照RNAiso Plus試劑盒（TaKaRa公司）的方法提取總RNA，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 紅鰭東方鲀干擾素γ基因的擴增 根據(jù)已發(fā)表在GenBank上的紅鰭東方鲀IFNγ基因（AJ616216.2）序列，利用生物信息學軟件Primer Premier5.0 設(shè)計引物為：IFN-F：5'-CATGCCATGGG CTCCTACATCCCAGTAGAAATG-3'（下劃線部分為NcoⅠ酶切位點）；IFN-R：5'-CCGCTCGAGATGACC TCGAATCGACATCT-3'（下劃線部分為XhoⅠ酶切位點）。

將實驗提取的RNA利用PrimeScript RT reagent kit Perfect Real Time 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以該cDNA為模板用引物IFN-F/IFN-R進行PCR擴增IFNγ基因。將擴增片段與pMD19-T載體相連并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂平板（含100 μg/mL氨芐青霉素）篩選、挑取單克隆菌落，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3 IFNγ蛋白的生物信息學分析 選取紅鰭東方鲀（T. rubripes，CAE82301.2）、斜帶石斑魚（Epinephelus coioides，AFM31242.1）、綠河鲀（Tetraodon nigroviridis，AHZ62714.1）、大西洋大比目魚（Hippoglossus hippoglossus，ADP55200.1），大西洋鮭（Salmo salar，NP_001165275.1）、 虹 鱒（Oncorhynchus mykiss，NP_001118092.1）、大西洋鱈魚（Gadus morhua，ACN41957.1）、原鴿（Columba livia，EMC77-410.1），美洲旱獺（Marmota monax，AAP80574.1）和馬（Equus caballus，ABS28998.1）的IFNγ氨基酸序列，利用ClustalW和MEGA5.0軟件進行多序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 原核表達載體pET-32a-IFNγ的構(gòu)建 以重組質(zhì)粒pMD19-T-IFNγ為模板進行PCR，擴增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測后進行膠回收，將PCR產(chǎn)物和表達載體pET-32a（+）（本實驗室保存）分別進行NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切后用T4 DNA Ligase 連接，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細胞，挑取單菌落擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)PCR及雙酶切鑒定為陽性后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序正確的陽性重組質(zhì)粒命名為pET-32a-IFNγ。

1.2.5 原核表達載體的誘導表達 測序鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-32a-IFNγ轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細胞（本實驗室保存），37℃培養(yǎng)過夜，按1∶100轉(zhuǎn)接至100 mL LB培養(yǎng)基（含Amp）震蕩培養(yǎng)。當菌液OD600=0.6左右時以1.0 mmol/L IPTG 37℃誘導4 h，取1 mL菌液離心棄上清，沉淀用100 μL PBS重懸，加入25 μL上樣緩沖液煮沸10 min后SDSPAGE電泳，鑒定目的蛋白的表達情況。

1.2.6 目的融合蛋白的分離純化及Western blotting鑒定 將100 mL經(jīng)IPTG誘導后的菌液6 000×g 離心10 min，棄上清，用20 mL PBS重懸菌體；然后對其超聲波破碎（工作9 s間歇9 s），12 000×g離心20 min；將上清和沉淀分別過ProteinIsoTMNi-NTA Resin（全式金生物技術(shù)有限公司）純化目的融合蛋白；將收集的洗脫液轉(zhuǎn)入透析袋內(nèi)，在 0.5 mol/L、 pH為8.0 的Tris-HCl緩沖液中透析過夜；將透析產(chǎn)物進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測。

將純化的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE，100 mA、1.5 h轉(zhuǎn)印至NC膜上。然后將NC膜置于封閉液中浸泡30 min，加入His-tag抗體（天根生化科技有限公司）孵育1 h，加入羊抗鼠IgG-HRP（天根生化科技有限公司）孵育30 min。以上各步驟之間用PBS緩沖液清洗3次，每次10 min。將NC膜放入避光處加顯色液，10 min之后在凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照。

2 結(jié)果

2.1 RNA提取結(jié)果

利用 RNAiso plus提取紅鰭東方鲀腎臟總RNA，1%瓊脂糖凝膠檢測，在凝膠成像儀下觀察，檢測結(jié)果（圖1）顯示，28S和18S條帶清晰，可用于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄實驗。

圖1 紅鰭東方鲀總RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.2 IFNγ基因的擴增結(jié)果

將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄后用于IFNγ基因成熟肽序列的PCR擴增，結(jié)果（圖2）表明，在約522 bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期大小一致，因此初步判斷該基因的成熟肽序列已被擴增出來。

2.3 IFNγ氨基酸序列比對及進化分析

經(jīng)多序列比對發(fā)現(xiàn)，T. rubripes IFNγ的氨基酸序列與T. nigroviridis一致性為62%，同源性較高，與E. coioides和H. hippoglossus的相似性分別為47%和43%，同源性較低。系統(tǒng)進化樹分析（圖3）表明，T. rubripes與T. nigroviridis聚為一支，親緣關(guān)系最近。

圖2 IFNγ基因的PCR擴增結(jié)果

圖3 IFNγ的系統(tǒng)進化樹分析

2.4 原核表達載體pET-32a-IFNγ的鑒定

圖4顯示，重組表達載體pET-32a-IFNγ經(jīng)雙酶切后在522 bp處出現(xiàn)單一條帶，說明IFNγ基因已連入pET-32a（+）載體。將經(jīng)過雙酶切驗證的重組質(zhì)粒測序，結(jié)果表明已成功將IFNγ基因連接到原核表達載體pET-32a（+），重組表達載體構(gòu)建成功。

圖4 pET-32a-IFNγ質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果

2.5 原核表達載體在BL21（DE3）中的誘導表達

將構(gòu)建好的重組表達載體pET-32a-IFNγ導入表達宿主菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導表達后進行SDS-PAGE分析。結(jié)果（圖5）表明，與pET-32a空載相比重組質(zhì)粒pET-32a-IFNγ在BL21（DE3）中表達的蛋白圖譜中明顯多出一條特異的誘導表達條帶，大小在37.8 kD左右，與預(yù)期大小一致，故初步判斷已誘導表達出目的蛋白。進一步優(yōu)化表達條件發(fā)現(xiàn)pET-32a-IFNγ在IPTG濃度為1 mmol/L，誘導6 h，誘導溫度為37℃時表達量最多（圖6），而誘導時間增加到8 h時相比6 h的表達量并無增加。

圖5 重組表達載體pET-32a-IFNγ的表達分析

2.6 融合蛋白的純化和Western blotting 分析結(jié)果

用Ni柱分別對IFNγ融合蛋白進行破碎后沉淀和上清的純化發(fā)現(xiàn)，在破碎后的沉淀中純化得到以包涵體形式存在的IFNγ融合蛋白。Western blotting檢測（圖7）表明，在37.8 kD處出現(xiàn)一條單一條帶，帶有His標簽的重組蛋白得到表達，進一步說明純化得到的蛋白即為重組紅鰭東方鲀IFNγ蛋白。

3 討論

近年來，紅鰭東方鲀的病害不斷增多，對其病害的防治除了提供良好的養(yǎng)殖環(huán)境和進行藥物治療等措施外，還需提高魚體自身的免疫能力。已有的研究表明，干擾素作為一種細胞因子在增強機體免疫力方面具有重要的作用。在哺乳動物和鳥類中，重組的IFN-α/β已被廣泛用于腫瘤的治療和病毒性疾病的研究，一些魚類重組干擾素的活性已通過ZF4細胞進行了檢測，該細胞來源于斑馬魚的胚胎細胞［20］。實驗證明加入了重組IFN的ZF4細胞能夠增強對黑魚彈狀病毒（Snakehead rhabdovirus，SHRV）的抵抗能力，重組的鮭魚和鯰魚IFNs能夠保護TO細胞免受傳染性胰臟壞死病毒（Infectious pancreatic necrosis virus，IPNV）的侵染和CCO細胞免受斑點叉尾鮰皰疹病毒（Channel catfish herpesvirus，CCV）的侵染［21，22］。重組的牙鲆IFNγ能夠增強牙鲆抵抗愛德華氏菌的能力［23］。

圖6 不同條件下pET-32a-IFNγ在BL21（DE3）細胞中的表達情況

圖7 純化的IFNγ融合蛋白及Western blotting檢測結(jié)果

本研究通過克隆紅鰭東方鲀干擾素γ基因，構(gòu)建重組表達載體，在大腸桿菌細胞中得到了融合表達的IFNγ。但在對重組載體進行誘導表達時，發(fā)現(xiàn)未加IPTG誘導的菌體和含有pET-32a空載體的菌體均出現(xiàn)少量與目的蛋白大小相似的蛋白條帶，這可能是由于菌體中含有與目的蛋白大小相似的其他蛋白造成的。另外，pET表達系統(tǒng)中存在目的蛋白的本底表達也會導致未加誘導劑的情況下同樣有目的蛋白表達的情況。為了進一步證明目的蛋白得到正確表達，本研究進行了Western blotting檢測。因為本實驗選用的是pET-32a構(gòu)建表達載體，所表達的目的蛋白是帶有His標簽的融合蛋白，因此采用His標簽抗體對誘導表達的蛋白進行了Western blotting檢測，表明該蛋白能夠與抗His標簽的單克隆抗體發(fā)生特異反應(yīng)，His標簽得到正確表達，同時也表明載體按照正確的翻譯框架翻譯并表達出目的蛋白。因此，本研究通過誘導表達并純化得到的蛋白不僅大小與預(yù)期一致而且?guī)в蠬is標簽，而這種情況只有目的蛋白具有，可以說明誘導表達的蛋白即為重組紅鰭東方鲀IFNγ蛋白。在原核表達中除了目的基因本身序列對表達量有影響之外，誘導表達的條件對目的基因表達量同樣具有重要影響。在本研究中通過調(diào)整誘導表達時的時間、溫度和誘導劑的濃度，對重組載體的最佳表達條件進行了探索，最終確定了重組紅鰭東方鲀IFNγ蛋白在IPTG為1 mmol/L，37℃條件下誘導6 h時達到最大表達量，為今后重組紅鰭東方鲀IFNγ的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究克隆并獲得了紅鰭東方鲀干擾素γ（IFNγ）成熟肽的基因序列，構(gòu)建了重組表達載體pET-32a-IFNγ，經(jīng)轉(zhuǎn)化和誘導，重組體在大腸桿菌E. coli BL21（DE3）細胞中得以表達。利用Ni柱分離和純化得到的融合蛋白經(jīng)Western blotting分析，證明為重組的紅鰭東方鲀IFNγ。

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（責任編輯 馬鑫）

A Prokaryotic Expression of Recombinant IFNγ from Takifugu rubripes

Ma Pu1Sun Saihong1Wang Yufang1Li Hui1Liu Haiying2Jiang Zhiqiang1Qiu Xuemei1Liu Yang1Zhang Tao3Wang Xiuli1
（1. College of Fisheries and Life Science，Dalian Ocean University，Dalian 116023；2. College of Marine Science and Environment，Dalian Ocean University，Dalian 116023；3. Dalian Tianzheng Industrial Corporation Limited，Dalian 116011）

The aim is to provide a simple and efficient method to acquire recombinant fusion proteins of IFNγ of T. rubripes. In this study，total RNA was extracted from the kidney tissue of T. rubripes， and used as a template to amplify gene sequences of interferon γ（IFNγ）by RT-PCR. The recombinant DNA pET-32a-IFNγ was constructed by ligating the mature peptide sequences of IFNγ and prokaryotic expression vector pET-32a（+）. The genetic engineering bacteria of recombinant expressed IFNγ were obtained by transforming pET-32a-IFNγ into the competent cells of Escherichia coli BL21（DE3）. The fusion proteins were obtained under the induction of IPTG. By purifying the express products and Western blotting test， the results showed the high-efficiency expression of recombinant pET-32a-IFNγ in E. coli and the accurate target protein.

Takifugu rubripes；interferon γ；prokaryotic expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.025

2015-04-21

國家海洋公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費項目（201405003-2），大連市科技計劃項目（2014B11NC091）

馬普，女，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)動物基因工程；E-mail：mapu88824@sina.com

王秀利，男，博士，教授，研究方向：水產(chǎn)動物基因工程；E-mail：xlwang@dlou.edu.cn