氨基酸類(lèi)成分的高效液相指紋圖譜鑒別不同產(chǎn)地絞股藍(lán)研究

陳培云，王獻(xiàn)友，趙志磊，龐艷蘋(píng)，李曉楊

（河北大學(xué)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督學(xué)院，河北保定071002）

氨基酸類(lèi)成分的高效液相指紋圖譜鑒別不同產(chǎn)地絞股藍(lán)研究

陳培云，王獻(xiàn)友，趙志磊，龐艷蘋(píng)，李曉楊

（河北大學(xué)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督學(xué)院，河北保定071002）

采用氨基酸類(lèi)成分的高效液相指紋圖譜，實(shí)現(xiàn)對(duì)包括陜西平利在內(nèi)的8個(gè)產(chǎn)地絞股藍(lán)的鑒別。使用超聲法提取絞股藍(lán)水溶性氨基酸，采用鄰苯二甲醛柱前衍生高效液相色譜－熒光檢測(cè)法，建立絞股藍(lán)氨基酸類(lèi)指紋圖譜，結(jié)合主成分分析、判別分析鑒別不同產(chǎn)地絞股藍(lán)。結(jié)果表明主成分分析法明顯把陜西平利和其他產(chǎn)地區(qū)開(kāi)來(lái)，對(duì)其他產(chǎn)地也基本上能夠進(jìn)行區(qū)分，建立的判別分析模型穩(wěn)定性良好。由此得出氨基酸類(lèi)成分的高效液相指紋圖譜結(jié)合主成分析分析可以實(shí)現(xiàn)平利絞股藍(lán)和其他產(chǎn)地的有效區(qū)分，建立的判別分析模型，為保護(hù)平利絞股藍(lán)原產(chǎn)地域產(chǎn)品以及其他不同產(chǎn)地的區(qū)分提供了新的方法途徑。

絞股藍(lán)；氨基酸類(lèi)指紋圖譜；原產(chǎn)地；主成分分析；判別分析

絞股藍(lán)Gynostemmapentaphyllum（Thunb.）Maldno為葫聲科Cucurbitaceae絞股藍(lán)屬草質(zhì)藤本植物，又名天堂草、超人參和七葉參等。具有抑制腫瘤［1］、降低血脂、清熱解毒、止咳袪痰等作用［1-2］。民間稱(chēng)其為“神奇”的“不老長(zhǎng)壽藥草”。絞股藍(lán)被醫(yī)學(xué)界譽(yù)為東方神草、人間福音草，現(xiàn)代研究表明絞股藍(lán)含有皂苷、黃酮、氨基酸、植物蛋白、多糖、磷脂、維生素、纖維素、微量元素等［3-4］。

絞股藍(lán)產(chǎn)地眾多，地理分布廣泛，不同產(chǎn)地的絞股藍(lán)質(zhì)量參差不齊，魚(yú)龍混雜。地處北亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候區(qū)的平利縣，由于雨量充沛，氣候溫和，日照充足，無(wú)霜期時(shí)間長(zhǎng)，土壤有害物質(zhì)含量低，成為中國(guó)國(guó)內(nèi)生態(tài)型藥用植物種植示范基地的最佳區(qū)域。根據(jù)《中華人民共和國(guó)產(chǎn)品質(zhì)量法》和《原產(chǎn)地域產(chǎn)品保護(hù)規(guī)定》，國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局通過(guò)了對(duì)平利絞股藍(lán)原產(chǎn)地域產(chǎn)品保護(hù)申請(qǐng)的審查，批準(zhǔn)自2004年12月13日起對(duì)平利絞股藍(lán)實(shí)施原產(chǎn)地域保護(hù)。

近年來(lái)，絞股藍(lán)的研究主要集中在測(cè)定其中單一成分或某幾種成分的含量［5-8］。對(duì)產(chǎn)地差異的研究主要有：秦江［9］等測(cè)定產(chǎn)自福建、湖北、廣西、云南、浙江和陜西6種不同產(chǎn)地絞股藍(lán)總皂苷的含量，比較這6種絞股藍(lán)總皂苷組成成分的差異性，王晶［10］等測(cè)定了7個(gè)省產(chǎn)絞股藍(lán)及其根際土壤中As，Hg，Se 3種元素的含量，進(jìn)行分析比較。梁曉慶［11］等對(duì)5省絞股藍(lán)Se、總蛋白及總皂苷含量進(jìn)行測(cè)定，分析了三者相關(guān)性，劉芳［12］等建立絞股藍(lán)藥材黃酮類(lèi)化合物的HPLC指紋圖譜，對(duì)不同產(chǎn)地批次的絞股藍(lán)藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。?？》澹?3］等建立固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜方法，對(duì)采自4省市5個(gè)地區(qū)藥用植物絞股藍(lán)的揮發(fā)性化學(xué)成分進(jìn)行定性定量分析。以上研究均未明確對(duì)絞股藍(lán)產(chǎn)地來(lái)源進(jìn)行區(qū)分，絞股藍(lán)中富含氨基酸，不同產(chǎn)地絞股中藍(lán)氨基酸含量不同，本文采用高效液相色譜法對(duì)包括平利在內(nèi)的8個(gè)產(chǎn)地絞股藍(lán)氨基酸類(lèi)進(jìn)行研究，并利用matlab軟件進(jìn)行主成分分析和spss進(jìn)行判別分析，建立穩(wěn)定可靠的模式識(shí)別方法。該研究結(jié)果為維護(hù)名貴中藥材市場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)秩序，保護(hù)地理標(biāo)志產(chǎn)品的聲譽(yù)提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1材料與儀器

鄰苯二甲醛（上海源葉生物科技有限公司，分析純），β-巰基乙醇（amresco，分析純），甲醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純），四氫呋喃（上海同試化工有限公司，分析純），乙酸鈉（天津市光復(fù)精細(xì)化工廠，優(yōu)級(jí)純），硼酸（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司，≥99.8%），氫氧化鈉（天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司，≥98%優(yōu)級(jí)純），氨基酸對(duì)照品：天冬氨酸（20121123）、蛋氨酸（20110415）、賴(lài)氨酸（20130113）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，谷氨酸（14690-201203）、絲氨酸（14688-201001）、組氨酸（140693-201102）、甘氨酸（140689-201103）、蘇氨酸（140682-201102）、丙氨酸（140680-201002）、色氨酸（140686-201002）、纈氨酸（14681-201202）、苯丙氨酸（140676-201106）、異亮氨酸（140683-201202）、亮氨酸（140687-201102）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究所）精氨酸（≥99.2%）酪氨酸（≥99.4%）購(gòu)自中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水，流動(dòng)相以0.45 μm的濾膜過(guò)濾。實(shí)驗(yàn)采用的8個(gè)絞股藍(lán)藥材分別來(lái)源于陜西、安徽、福建、廣西、湖北、湖南、山東、四川。實(shí)驗(yàn)時(shí)每個(gè)產(chǎn)地取5個(gè)批次。

Agilent1100高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫科技公司；Agilent色譜工作站；色譜柱Kromasil C18，5 μm，4.6 mm×250 mm；檢測(cè)器Agilent G1321熒光檢測(cè)器；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；高速中藥粉碎機(jī)：武義縣屹立工具有限公司。

1.2方法

1.2.1氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

分別精密稱(chēng)取16種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸各0.25 g于25 mL容量瓶中，加超純水溶解并定容后備用。

1.2.2供試樣品制備

絞股藍(lán)在50℃～60℃下烘干干燥，干燥后的材料用植物粉碎機(jī)粉碎并過(guò)80目篩，準(zhǔn)確稱(chēng)取絞股藍(lán)0.6 g，置100 mL容量瓶中，用二次去離子水至近刻度，30℃超聲提取30 min（100 kHz，80 w），冷卻后，二次去離子水定容至刻度，10 000 r/min離心棄去沉淀，離心液用0.45 μm濾膜過(guò)濾，備用。

1.2.3衍生及分析

衍生試劑的配制：稱(chēng)取0.27 g鄰苯二甲醛（OPA）溶于5 mL無(wú)水乙醇中，加入100 μL2-巰基乙醇，用0.4 mol/L的硼酸（pH=9.5，氫氧化鈉溶液調(diào)制）定容到50 mL，混勻，置于暗處，每隔1天補(bǔ)加10 μL巰基乙醇，每周需重新配制。

移取100 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品于2 mL的棕色樣品瓶中加入等量的OPA衍生化試劑，在混勻器中混勻，反應(yīng)1.5 min，取50 μL（定量環(huán)為20 μL）注入高效液相色譜儀，按下述色譜條件操作，記錄30 min色譜圖。

1.2.4色譜條件

色譜柱為Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相（A）：0.05mol/LNaAc+0.5%THF；流動(dòng)相B：甲醇。梯度洗脫線(xiàn)性梯度：（T，B%）（0 min，20%）（27 min，88%）（34min，20%）。流速為1.0 mL/min，柱溫為35℃，熒光檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為460 nm，進(jìn)樣量為20 μL。每次樣品完成后，系統(tǒng)平衡10 min。

1.2.5數(shù)據(jù)處理方法

液相色譜圖通過(guò)《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)研究（2004試行版）》處理分析。使用matlab進(jìn)行主成分分析，spss進(jìn)行判別分析。

2結(jié)果與分析

2.1方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1方法的專(zhuān)屬性

在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品色譜圖見(jiàn)圖1（A、B、C）。

由圖1可見(jiàn)氨基酸在26 min內(nèi)基本達(dá)到了完全分離，內(nèi)源性物質(zhì)及衍生化試劑不干擾氨基酸的測(cè)定。方法具有較好的專(zhuān)屬性。

圖1　HPLC圖Fig.1Chromatogram of amino acids constituents

2.1.2精密度試驗(yàn)

將處理好的絞股藍(lán)的水提取液，分別按照“2.1.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生，按2.1.1實(shí)驗(yàn)條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，結(jié)果表明，各主要色譜峰的相對(duì)酪氨酸參照峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為0.10%～0.32%、0.28%～3.3%，圖譜導(dǎo)入相似度軟件處理，相似度均在0.998以上，表明儀器精密度良好。

2.1.3重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取同一絞股藍(lán)5份，分別按照“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，然后分別進(jìn)行衍生、進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果各主要色譜峰相對(duì)酪氨酸參照峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別0.2%～1.5%，0.26%～3.5%，圖譜導(dǎo)入相似度軟件處理，相似度均在0.983以上，表明本方法重復(fù)性好。

2.1.4穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一絞股藍(lán)供試品溶液，分別在0、2、4、8、10、12、24 h衍生進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果各主要色譜峰相對(duì)酪氨酸參照峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為0.58%～2.65%、0.69%～2.39%，圖譜導(dǎo)入相似度軟件處理，相似度均在0.982以上，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，穩(wěn)定性良好。

2.2絞股藍(lán)氨基酸指紋圖譜的建立

將8個(gè)不同產(chǎn)地40批絞股藍(lán)藥材按2.1項(xiàng)的條件進(jìn)樣，通過(guò)化學(xué)工作站按表1進(jìn)行積分，使用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2004A版），設(shè)定時(shí)間窗0.5，對(duì)40批不同產(chǎn)地絞股藍(lán)藥材HPLC指紋圖譜進(jìn)行共有峰標(biāo)定，結(jié)果表明共有11個(gè)峰面積在100以上的共有峰，并對(duì)同一產(chǎn)地樣品的色譜峰進(jìn)行自動(dòng)匹配生成中位數(shù)對(duì)照指紋圖譜，得到每個(gè)產(chǎn)地的對(duì)照譜圖，如圖2。

圖2　不同產(chǎn)地絞股藍(lán)氨基酸指紋對(duì)照譜圖Fig.2Fingerprints of amino acids constituents of Gynostemma pentaphylla from different Localities

2.3絞股藍(lán)藥材指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)

使用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”對(duì)每一產(chǎn)地的5個(gè)批次絞股藍(lán)樣品相似度計(jì)算結(jié)果如表2，對(duì)8個(gè)產(chǎn)地絞股藍(lán)的對(duì)照?qǐng)D譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以陜西平利為參考圖譜計(jì)算相似度，結(jié)果如表3所示。

由表2、表3可見(jiàn)，同一產(chǎn)地絞股藍(lán)的指紋圖譜相似度均大于0.97，說(shuō)明同一產(chǎn)地絞股藍(lán)中氨基酸含量相近，由表3可見(jiàn)，8個(gè)產(chǎn)地對(duì)照指紋圖譜相似度除廣西外均大于85%，說(shuō)明它們性質(zhì)較為相近，仔細(xì)比較各個(gè)樣本的相似度又存在一定地差別，低的只有79%左右，高的接近96%，但不能明確將不同產(chǎn)地樣品區(qū)分開(kāi)，因此認(rèn)為使用傳統(tǒng)的相似度評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行分析得到的結(jié)果較為模糊，不能明確的區(qū)分產(chǎn)地。

表2　同產(chǎn)地絞股藍(lán)相似度計(jì)算結(jié)果Table 2The similarity Gynostemma pentaphylla between the same cultivation areas

表3　不同產(chǎn)地絞股藍(lán)的相似度Table 3The similarity Gynostemma pentaphylla between different cultivation areas

2.4主成分分析

根據(jù)絞股藍(lán)藥材的HPLC指紋圖譜確定共有峰11個(gè)，其中峰8（酪氨酸）為絞股藍(lán)中主要的氨基酸成分，在HPLC色譜圖中分離良好，含量較高且穩(wěn)定，選擇峰8為參照峰。并對(duì)共有峰的相對(duì)峰面積比值進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)表4。將11個(gè)共有峰峰面積比值數(shù)據(jù)導(dǎo)入MATLAB軟件中，進(jìn)行主成分分析。

表4　8個(gè)產(chǎn)地11個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積Table 4The relative peak area of common peaks for eleven batches of eight areas

分析結(jié)果表明前3個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率已達(dá)到98.85%，前3個(gè)主成分概括了大部分的數(shù)據(jù)信息，因此使用提取的前3個(gè)主成分得分作三維圖，觀察前3個(gè)主成分得分情況，可發(fā)現(xiàn)各產(chǎn)地樣品具有明顯的聚類(lèi)趨勢(shì)。橢圓形圈中部分為陜西樣品。能夠與其他產(chǎn)地區(qū)分開(kāi)來(lái)。將各點(diǎn)投影到平面上，所得結(jié)果如圖3，可看出樣品很明顯的分為8類(lèi)，不同產(chǎn)地的聚在一起成為一類(lèi)，可見(jiàn)該方法可在一定程度上實(shí)現(xiàn)絞股藍(lán)產(chǎn)地識(shí)別。

圖3　前三主成分得分投影圖Fig.3Projection of the first three principal component scores

2.5判別分析

以各產(chǎn)地的11個(gè)相對(duì)峰面積前3個(gè)主成分得分及其所述屬的類(lèi)型作為評(píng)價(jià)新指標(biāo)，運(yùn)用SPSS19.0軟件，對(duì)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行貝葉斯判別分析，以所有組先驗(yàn)概率相等進(jìn)行判別，所建模型對(duì)初始分組案例的分類(lèi)正確率達(dá)到了97.5%，交叉驗(yàn)證的概率為95%，表明該模型的穩(wěn)定性良好。可寫(xiě)出8個(gè)產(chǎn)地的貝葉斯判別函數(shù)，分別為：

其中Xi為第i個(gè)主成分得分，將待判樣品的前3個(gè)主成分得分分別帶入上述8個(gè)貝葉斯判別函數(shù)中，計(jì)算每個(gè)判別函數(shù)的函數(shù)值g安徽、g福建、g廣西、g湖北、g湖南、g山東、g四川、g陜西。根據(jù)貝葉斯后驗(yàn)概率最大原則，哪個(gè)函數(shù)值最大，則待判樣品屬于哪一類(lèi)。

3結(jié)論

超聲法提取絞股藍(lán)水溶性氨基酸，采用鄰苯二甲醛柱前衍生高效液相色譜－熒光檢測(cè)法，建立絞股藍(lán)氨基酸類(lèi)指紋圖譜，利用氨基酸類(lèi)成分的高效液相指紋圖譜，結(jié)合主成分分析、判別分析對(duì)不同產(chǎn)地的絞股藍(lán)樣品進(jìn)行分析。結(jié)果表明，傳統(tǒng)的使用相似度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行分析得到的結(jié)果較為模糊，不能明確的區(qū)分產(chǎn)地。而使用PCA方法明顯把陜西平利和其他產(chǎn)地區(qū)分開(kāi)來(lái)，對(duì)其他產(chǎn)地也基本上能夠進(jìn)行區(qū)分。利用前三組成分得分所建立的判別分析模型，為保護(hù)平利絞股藍(lán)原產(chǎn)地域產(chǎn)品以及其他不同產(chǎn)地的區(qū)分提供了新的方法途徑。

［1］劉運(yùn)美，何軍，苗勝斌，等．絞股藍(lán)中總黃酮的分析［J］．中成藥，2009，31（8）：1300-1302

［2］余昌東，陳宗良，梅全喜．絞股藍(lán)的藥理作用研究概況［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19（9）：2296-2298

［3］李風(fēng)華，陳素紅，呂圭源.7個(gè)不同產(chǎn)地絞股藍(lán)皂苷含量測(cè)定［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2012，30（4）：887-888

［4］樸香蘭，吳倩.絞股藍(lán)研究進(jìn)展［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（7）：1758-1760.

［5］ZHOU J，ZHANG X.New research progress of Gynostemma pentaphyllum and application［J］.Food Science and Technology，2010，35（2）：021

［6］Gao B，Lu Y，Qin F，et al.Differentiating Organic from Conventional Peppermints Using Chromatographic and Flow Injection Mass Spectrometric（FIMS）Fingerprints［J］.Journal of agricultural and food chemistry，2012，60（48）：11987-11994

［7］Xie Z，Liu W，Huang H，et al.Chemical composition of five commercial Gynostemma pentaphyllum samples and their radical scavenging，antiproliferative and anti-inflammatory properties［J］.Journal of agricultural and food chemistry，2010，58（21）：11243-11249

［8］XI X，JI Y，ZENG G，et al.Determination of trace elements in gynostemma pentaphylla by microwave digestion and ICP-AES［J］. Applied Chemical Industry，2009，10：039

［9］秦江，陳良華，劉軒，等.不同地區(qū)絞股藍(lán)總皂苷的分析及純化［J］.廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，51（1）：125-129

［10］王晶，肖婭萍，梁曉慶，等.氫化物發(fā)生—原子熒光法測(cè)定不同產(chǎn)地絞股藍(lán)及其根際土壤中As，Hg，Se［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2012，32（3）：813-816

［11］梁曉慶，肖婭萍，王晶，等.不同產(chǎn)地絞股藍(lán)Se、總蛋白及總皂苷含量及三者相關(guān)性分析［J］.藥物生物技術(shù)，2012，17（1）：52-54

［12］劉芳，胡坪，任德權(quán).絞股藍(lán)藥材黃酮類(lèi)化合物的HPLC指紋圖譜研究［J］.中成藥，2009，31（4）：493-495

［13］?？》?，肖婭萍，姜東亮，等.5個(gè)不同地區(qū)絞股藍(lán)中揮發(fā)性成分的SPME-GC-MS分析［J］.藥物分析雜志，2012，32（4）578-582

Study on HPLC Fingerprints of Amino Acids Constituents for Identification of Gynostemma Pentaphylla from Different Localities

CHEN Pei-yun，WANG Xian-you，ZHAO Zhi-lei，PANG Yan-ping，LI Xiao-yang
（College of Quality&Technical Supervision，Hebei University，Baoding 071002，Hebei，China）

To establish a fingerprint analytical method according to the amino acids constituents for Identification of Gynostemma pentaphylla from eight different Localities including pingli shanxi.Free Amino Acids in Gynostemma pentaphylla were extracted by ultrasonic under water conditon，derivatized by O-phthalaldehyde，separated by Kromasil C18 column，monitored by a fluorescence detector，A HPLC fingerprints of amino acids constituents was established.Similarity combined with principal component analysis（PCA）and discriminant analysis were used to compare and analyze Gynostemma pentaphylla in different localities.PCA could discriminate clearly Gynostemma pentaphylla cultivated pingli from other cultivation areas，also could basically carry on the discrimination between other cultivation areas.And a stable discrimination analysis model was established.HPLC fingerprints of amino acids constituents coupled with PCA could be used to compare and discriminate Gynostemma pentaphylla cultivated pingli from other cultivation areas，the established discrimination analysis model for pingli cultivation areas and other cultivation areas provided a new method for protecting Gynostemma pentaphylla cultivated pingli source territory and identifying different localities.

Gynostemma pentaphylla；fingerprints of amino acids constituents；source territory；principal component analysis；discriminant analysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.024

2014-02-09

質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目（201210010-4）；河北大學(xué)2014-2015實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放項(xiàng)目

陳培云（1973—），女（漢），高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，博士，主要從事食品分析檢測(cè)研究。