液質(zhì)聯(lián)用法快速測(cè)定飼料中維吉尼亞霉素含量

曹文卿，吳振興，靜平，楊桂朋，林黎明

（1.中國(guó)海洋大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東青島266100；2.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，山東青島266002）

液質(zhì)聯(lián)用法快速測(cè)定飼料中維吉尼亞霉素含量

曹文卿1，2，吳振興2，靜平2，楊桂朋1，林黎明2

（1.中國(guó)海洋大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東青島266100；2.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，山東青島266002）

建立了飼料中快速測(cè)定維吉尼亞霉素M1和S1殘留量的高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）方法。樣品采用乙腈提取，經(jīng)冷凍脫脂和飽和氯化鈉溶液鹽析凈化，用甲醇-甲酸銨溶液定容，經(jīng)SDB-C8色譜柱分離后，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）正離子模式檢測(cè)，監(jiān)測(cè)離子對(duì)分別為M1：m/z 526.3/355.1和526.3/337.2；S1：824.5/290.1和824.5/ 205.1。其中526.3/355.1和824.5/205.1分別用于M1和S1的外標(biāo)法定量。維吉尼亞霉素M1和S1在1.0 μg/kg～1 000.0 μg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.998 7～0.999 5，添加飼料中添加水平為2.0、5.0、10.0 μg/kg時(shí)，回收率在81.0%～105.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于4.0%（n=6），最低檢出限和定量限分別為1.0 μg/kg和2.0 μg/kg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度高，省時(shí)，操作簡(jiǎn)單，成本低，重現(xiàn)性好，結(jié)果可靠，實(shí)用性強(qiáng)。

維吉尼亞霉素M1和S1；高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜；乙腈提??；冷凍脫脂；鹽析凈化；飼料；快速測(cè)定

維吉尼亞霉素（Virginiamycin，簡(jiǎn)稱VGM）又稱維吉尼霉素、速大肥、肥大霉素、維及霉素、抗金霉素或抗金葡霉素和威里霉素等，是維吉尼鏈霉菌產(chǎn)生的一種內(nèi)酯環(huán)肽類抗生素，它是由VGM M（M1，M2）和VGM S（S1～S5）組成的混合物，其中VGM M1和VGM S1為主要成分，分子式分別為C28H35N3O7和C43H49N7O10，結(jié)構(gòu)式見圖1，它們各有不同的抗菌范圍，并存在較好的協(xié)同性，按一定比例配合具有很好的抗菌效果。商業(yè)維吉尼亞霉素為M1和S1的混合物，一般比例為3∶1。

圖1　維吉尼亞霉素M1和S1的結(jié)構(gòu)式Fig.1Chemical structures of virginiamycin M1and S1

維吉尼亞霉素主要對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有抑制作用，主要通過抑制細(xì)菌核糖體合成蛋白質(zhì)達(dá)到殺菌效果，可以防治細(xì)菌性下痢和雞壞死性腸炎［1］；還能殺滅腸道中有害細(xì)菌，減少乳酸、氨、揮發(fā)性脂肪酸等毒素的產(chǎn)生，減緩腸道蠕動(dòng)，從而延長(zhǎng)飼料在腸道中的消化時(shí)間，起到增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育的作用［2-6］。美、歐國(guó)家曾將維吉尼亞霉素作為“動(dòng)物生長(zhǎng)促進(jìn)劑”廣泛用于畜禽配合飼料中。為充分降低發(fā)生細(xì)菌抗藥性危險(xiǎn)程度，歐盟1999年決定禁止將維吉尼亞霉素、桿菌肽鋅、磷酸泰樂菌素等抗生素作為動(dòng)物生長(zhǎng)促進(jìn)劑用于飼料添加劑。我國(guó)農(nóng)業(yè)部在2001年發(fā)布的《飼料藥物添加劑使用規(guī)范》允許將維吉尼亞霉素用于飼料添加劑，用來防病和促生長(zhǎng)。農(nóng)業(yè)部2002年235號(hào)公告規(guī)定：維吉尼亞霉素在雞組織中的最高殘留限量，肌肉為100 μg/kg，肝臟為300 μg/kg，腎臟為400 μg/kg［7］，2011年國(guó)家質(zhì)檢總局下達(dá)的殘留監(jiān)控計(jì)劃中，出口歐盟的雞產(chǎn)品限量為1.0 μg/kg，進(jìn)口羊組織中維吉尼亞霉素限量為50 μg/kg。目前飼料中檢測(cè)維吉尼亞霉素殘留主要用高效液相色譜法［8-10］，檢測(cè)限在1mg/kg以上，食品中檢測(cè)維吉尼亞霉素殘留主要在奶制品、豬組織中以檢VGM M1為主，前處理方法使用甲醇-乙腈提取樣品，C18SPE固相萃取小柱凈化后，再用三氯甲烷萃取洗脫液，操作繁雜，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法中檢測(cè)限在2.0 μg/kg左右，液-質(zhì)分析譜圖出峰時(shí)間較遲（22 min～24 min之后），分析一個(gè)樣品至少需0.5 h［11-17］。本文參照文獻(xiàn)［18］研究并建立一種快速檢測(cè)飼料中維吉尼亞霉素M1和S1的簡(jiǎn)單高效方法，前處理直接采用乙腈提取，經(jīng)冷凍脫脂和飽和氯化鈉溶液鹽析凈化，無須使用SPE小柱和三氯甲烷等材料即可達(dá)到凈化要求；既環(huán)保、節(jié)約，又縮短了前處理時(shí)間，儀器分析效率亦提高一倍（共15 min），結(jié)果可靠，回收率高，可同時(shí)對(duì)飼料中的維吉尼亞霉素M1和S1含量進(jìn)行快速測(cè)定，定量限為2.0 μg/kg，滿足當(dāng)前對(duì)飼料制品中此類藥物含量的控制要求。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

Agilent 6410高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）及MssHunter3.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：美國(guó)Agilent公司；T25型均質(zhì)器：IKA公司；39760型渦流混勻器：Thermolyne公司；KQ-500DB型超聲波發(fā)生器：昆山超聲儀器有限公司；振蕩器；HITACHI高速冷凍離心機(jī)：GR22GⅡ，日本；MilliQ超純水儀：Millipore公司；氮吹儀：美國(guó)Caliper公司，0.22 μm微孔濾膜、十萬分之一分析天平：瑞士Mettler Toledo公司；磷酸二氫銨、甲酸銨、氯化鈉：優(yōu)級(jí)純；甲酸為色譜純：德國(guó)Merck公司；水為超純水（18.2 MΩ·cm）、維吉尼亞霉素M1（純度98%）、S1（純度99%）：美國(guó)Sigma公司。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取維吉尼亞霉素M1和S1標(biāo)準(zhǔn)品各10.0± 0.2 mg用乙腈溶解并定容至10 mL，配成1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（-18℃以下保存）。用乙腈稀釋成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液（-18℃以下保存）。使用前用乙腈將標(biāo)準(zhǔn)中間液稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3樣品前處理

稱?。?.00±0.01）g粉碎均勻的飼料樣品于50 mL聚丙烯離心管中，準(zhǔn)確加入10 mL乙腈，均質(zhì)3 min，振蕩提取10 min，4℃下以3 000 r/min冷凍離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液到另一潔凈離心管中；殘?jiān)尤?0 mL 0.01 mol/L NH4H2PO4緩沖液，渦旋混勻后振蕩10 min，4℃下，8 000 r/min離心10 min，合并上清液并渦旋混勻，8 000 r/min離心5 min，上清液待凈化。

在上述提取液中加入3.7 g氯化鈉振蕩5 min，在-5℃下，12 000 r/min離心10 min后從乙腈層吸取5 mL至15 mL玻璃管中，45℃下氮?dú)獯蹈?。加?.5 mL甲醇和甲酸銨混合液（1∶1，體積比）溶解殘?jiān)?，定容液轉(zhuǎn)移至2 mL EP管中，4℃下，12 000 r/min離心10 min，上清液過雙層0.22 μm注射器濾膜（有機(jī)膜）至棕色進(jìn)樣小瓶中，供HPLC-MS/MS測(cè)定。

1.4液相色譜

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C8（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A：乙腈；B：3 mmol/L甲酸銨水溶液，梯度洗脫（柱平衡時(shí)間4 min）：0 min～2 min，50%A～75% A，2 min～3 min，75%A～80%A，3 min～6 min，80%A～85%A，6 min～8 min，85%A～50%A，8 min～12 min，保持50%A；流速：500 μL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.5質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI+）；毛細(xì)管電壓：4 000 V；干燥氣流量：10.0 L/min；霧化器壓力：211 KPa；干燥氣溫度：350℃；多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；定性離子、定量離子、保留時(shí)間、駐留時(shí)間、碰撞電能和碰撞電壓等參數(shù)見表1。

表1　維吉尼亞霉素M1、S1的HPLC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)Table 1The HPLC-MS/MS parameters of VGM M1and VGM S1in multiple reaction monitoring（MRM）

2結(jié)果與討論

2.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化

從質(zhì)譜全掃描得到一級(jí)質(zhì)譜圖維吉尼亞霉素M1和S1的分子離子分別為526.3和824.5；再分別以M1和S1的分子離子為母離子進(jìn)行子離子掃描，得到相應(yīng)子離子：355.1、337.2，290.1、205.1；每種化合物選取兩個(gè)離子對(duì)，并將豐度最高的526.3/355.1和824.5/205.1分別作為M1和S1的定量離子。優(yōu)化碎裂電壓（Fragmentor）和碰撞能（CE）（優(yōu)化的參數(shù)見表1）。

2.2色譜條件的優(yōu)化

分別選用甲醇：乙腈（體積比=1∶1）-0.1%甲酸水溶液、甲醇-5 mmol/L的乙酸銨水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-3 mmol/L的甲酸銨水溶液為流動(dòng)相。并進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果表明，在該儀器條件下，乙腈-3 mmol/L的甲酸銨水溶液為流動(dòng)相時(shí)，采用（1.4）的梯度程序，維吉尼亞霉素M1和S1得到較好分離，且保留時(shí)間適宜（分別為5.3 min和6.5 min附近，待測(cè)樣品中化合物色譜峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液相比變化范圍在±0.25 min之內(nèi)，圖2），峰形良好，各基質(zhì)總離子流圖（圖3）與提取液質(zhì)譜圖中無明顯干擾峰（圖4）。在色譜條件最優(yōu)化條件下標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白基質(zhì)溶液和加標(biāo)飼料樣品提取液的總離子流圖及提取離子流圖見圖2～圖4。

圖2　維吉尼亞霉素M1、S1標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖和提取離子圖Fig.2MS Spectrum TIC&EIC of Virginiamycin M1&S1

圖3　飼料樣品中維吉尼亞霉素M1、S1的總離子流圖Fig.3MS Spectrum TIC of Virginiamycin M1&S1in feed samples

2.3提取與凈化方法的改進(jìn)

根據(jù)目標(biāo)化合物的物理化學(xué)性質(zhì)，改進(jìn)提取方法需要解決的兩個(gè)問題：一是選擇的提取溶液必須能將目標(biāo)物有效提?。欢悄苁够|(zhì)干擾較少。分別用水、甲醇、乙腈及其不同比例的混合物進(jìn)行了比較實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用水和甲醇作提取液比用乙腈提取出更多的基質(zhì)干擾物，同時(shí)目標(biāo)物回收率也較低，而乙腈能有效提取出樣品中的目標(biāo)物，因此選取乙腈為提取溶劑，同時(shí)利用飽和氯化鈉的鹽析作用使雜質(zhì)進(jìn)一步析出并使乙腈與水相分層，具有提取凈化的雙重作用，由于凈化比較充分，本方法不需使用SPE凈化步驟。

圖4　加標(biāo)飼料樣品中維吉尼亞霉素M1、S1的提取離子流圖（2.0 μg/kg）Fig.4Extracted Chromatograms of Virginiamycin M1，S1from spiked feed sample（2.0 μg/kg）

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)提取步驟中兩次提取液在合并后由澄清變渾濁，是因?yàn)槿芤旱膒H發(fā)生變化，使雜質(zhì)的溶解度降低而析出所導(dǎo)致。為減少檢測(cè)干擾，提取液合并后混勻后須再次離心以分離析出物。

2.4方法的線性范圍

用初始流動(dòng)相和標(biāo)準(zhǔn)工作液配制0、1.0、2.0、10.0、100.0、1 000.0μg/kg基質(zhì)校準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度（μg/kg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量，所得回歸參數(shù)見表2。

表2　維吉尼亞霉素M1、S1在添加水平為1.0 μg/kg～1 000.0 μg/kg時(shí)校準(zhǔn)曲線的相關(guān)參數(shù)Table 2Calibration curve parameters in fortified feed samples at range of 1.0 μg/kg-1 000.0 μg/kg

結(jié)果表明，維吉尼亞霉素M1、S1在1.0 μg/mL～1 000.0 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.5最低檢測(cè)限測(cè)定

稱取飼料樣品1.0 g（精確到0.01 g），加入適量標(biāo)準(zhǔn)液，使樣品中維吉尼亞霉素M1、S1的濃度水平為1.0、2.0、5.0 μg/kg，每水平3個(gè)平行樣，按1.3.2處理后進(jìn)HPLC-MS/MS測(cè)定。添加水平為1.0 μg/kg的提取液中的維吉尼亞霉素M1的定性定量離子信噪比均≥10，S1定量離子信噪比大于3；添加水平為2.0 μg/kg的溶液，測(cè)得其目標(biāo)化合物定量離子M1和S1的S/N皆大于10，維吉尼亞霉素M1&S1的檢出限測(cè)定參數(shù)見表3。

表3　維吉尼亞霉素M1&S1的檢出限測(cè)定參數(shù)Table 3Signal-to-Noise ratios in determination of VGM M1&S1in feed sample by HPLC-MS/MS（spiked level at 1.0 μg/kg（LOD）&2.0 μg/kg（LOQ））

以被測(cè)化合物的相應(yīng)值信噪比≥3和≥10時(shí)所對(duì)應(yīng)的含量分別作為檢測(cè)限和定量限，表明維吉尼亞霉素兩種主要成分的檢出限和定量限分別達(dá)到1.0 μg/kg和2.0 μg/kg.方法靈敏度滿足目前此類化合物的檢測(cè)技術(shù)指標(biāo)要求。

2.6應(yīng)用本方法對(duì)飼料樣品前處理的效果

采用本研究方法對(duì)空白飼料樣品做維吉尼亞霉素M1、S1的空白提取和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，得到相應(yīng)質(zhì)譜圖。經(jīng)本方法處理的樣品譜圖基質(zhì)干擾較小的效果見圖3。

2.7方法的回收率和精密度

等量稱取18個(gè)（1.00±0.01）g陰性飼料樣品于50mL聚丙烯離心管中，分為3組，分別加入適量標(biāo)準(zhǔn)工作液，使3組樣品中維吉尼亞霉素M1、S1的含量分別為2.0、5.0、10.0 μg/kg，加標(biāo)樣品按步驟1.3.2處理后進(jìn)HPLC-MS/MS測(cè)定?；|(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線法進(jìn)行外標(biāo)法定量，回收率和精密度數(shù)據(jù)見表4。

表4　加標(biāo)飼料樣品的平均回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=18）Table 4The average recoveries and of precisions of virginiamycin M1&S1in fortified feed samples（n=18）

在添加水平為2.0、5.0、10.0 μg/kg時(shí)，維吉尼亞霉素M1和S1的平均回收率分別為M1：94.0%～103.2%，97.0%～102.0%，89.2%～105.0%；S1：92.4%～99.8%，85.2%～92.8%，81.0%～91.9%。用空白基質(zhì)進(jìn)行室內(nèi)精密度試驗(yàn)，在添加水平為2.0、5.0、10.0 μg/kg時(shí)，維吉尼亞霉素M1的總體變異系數(shù)分別為：3.5%；2.0%；4.0%；S1的總體變異系數(shù)分別為：3.3%；3.9%；2.6%。加標(biāo)飼料樣品的平均回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

3結(jié)論

本文建立了快速檢測(cè)飼料中維吉尼亞霉素M1和S1含量的高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜檢測(cè)方法，樣品處理過程采用乙腈直接提取，飽和氯化鈉溶液鹽析凈化，方法操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度高，低成本，省時(shí)高效。與目前流行的甲醇提取和SPE凈化方法相比，該方法明顯改進(jìn)了基質(zhì)效應(yīng)問題，且具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、結(jié)果可靠的優(yōu)點(diǎn)，完全滿足目前我國(guó)目前飼料產(chǎn)品中維吉尼亞霉素含量監(jiān)控的技術(shù)要求。

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A Rapid Method for the Determination of Virginiamycin in Feeds Using Liquid Chromatographytandem Mass Spectrometry

CAO Wen-qing1，2，WU Zhen-xing2，JING Ping2，YANG Gui-peng1，LIN Li-ming2
（1.College of Chemistry and Chemical Engineering of OUC，Qingdao 266100，Shandong，China；2.Shandong Exit-Entry Inspection and Quarantine Technical Center，Qingdao 266002，Shandong，China）

A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric（HPLC-MS/MS）method was developed for the determination of virginiamycin（VGM）M1and S1residues in feeds.The samples were extracted with acetonitrile，purified by freezing de-fatted and salting-out effect of saturated sodium chloride solution and redissolved in methanol-ammonium formate solution.The extracts were separated with XDB-C8 LC column using a binary eluent under gradient elution and determined by tandem mass spectrometry under positive electrospray ionization mode with multiple reaction monitoring（MRM）mode.m/z M1：526.3/355.1 and 526.3/337.2，S1：824.5/290.1 and 824.5/205.1 were selected as precursor-product ion pairs，in which 526.3/ 355.1 and 824.5/205.1 were used for external standard quantization.Under the optimal conditions，the calibration curve was linear over the concentration of VGM in the range of 1.0 μg/kg-1 000.0 μg/kg with correlation coefficient between 0.998 7-0.999 5.The quantitation limit of 2.0 μg/kg and the detection limit was 1.0 μg/kg.The average fortified recoveries of VGM from feeds at 3 spiked levels of 2.0，5.0 and 10 μg/kg ranged from 81.0%to 105.0%with relative standard deviations（RSD）（n=6）less than 4.0%.The method showed good simplicity，sensitivity，stability，accuracy，time saving and low cost，and was suitable for the rapid determination of VGM in feedstuffs.

VGM M1and S1；HPLC-MS/MS；acetonitrile extraction；freezing de-fatted；salting-out effect；feeds；rapid method

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.021

2013-12-17

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（NO.41030858）；國(guó)家自然科學(xué)基金創(chuàng)新研究群體項(xiàng)目（NO.41221004）

曹文卿（1974—），女（漢），工程師，博士研究生，研究方向：生物毒素分析。