星點設(shè)計-響應(yīng)面優(yōu)化苦蕎殼黃酮超聲提取工藝

陳金娥，王亞君，趙志剛，劉勇麟，張海容

（山西省忻州師范學(xué)院生化分析技術(shù)研究所，山西忻州034000）

星點設(shè)計-響應(yīng)面優(yōu)化苦蕎殼黃酮超聲提取工藝

陳金娥，王亞君，趙志剛，劉勇麟，張海容*

（山西省忻州師范學(xué)院生化分析技術(shù)研究所，山西忻州034000）

利用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化苦蕎中黃酮的超聲提取條件；在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過星點設(shè)計-中心組合法研究了超聲功率、超聲時間、超聲溫度、液固比對黃酮得率的影響。結(jié)果表明，黃酮最佳超聲提取工藝條件為：超聲提取功率50 W，超聲提取時間26 min，超聲提取溫度53℃，液固比49 mL/g，提取次數(shù)2次，在此條件下黃酮得率為2.02%。

苦蕎黃酮；響應(yīng)面法；超聲提取

苦蕎亦稱“韃靼蕎麥”（Fagopyrum tararium），是一種自然界中藥食兩用的谷類作物，主要產(chǎn)于貴州、四川、云南［1］、山西等地方，富含生物類黃酮、淀粉、維生素、纖維素、脂肪、微量元素和礦物質(zhì)及蛋白質(zhì)等多種生物活性成分?？嗍w作為一種藥食兩用植物，富含以蘆丁為主的黃酮類化合物。研究表明，黃酮類化合物是一種天然抗氧化劑，具有清除人體中超氧離子自由基、抗衰老的作用，并且近年來有研究證明使用黃酮類化合物還可以降低癌癥發(fā)病率［2］。

目前對苦蕎皮中黃酮類化合物的提?。?-4］多采用堿提取酸沉淀法、索氏抽提法、乙醇浸提法等，但這些方法普遍存在提取時間長、提取產(chǎn)物難分離、產(chǎn)率不高，不適合工業(yè)化生產(chǎn)等缺點［5］。超聲波提取法［6-7］應(yīng)用于苦蕎皮中黃酮的提取，具有省時、高效、易操作等優(yōu)點，以乙醇為溶劑還能回收利用，降低成本，減少污染，環(huán)境友好等特點。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料

苦蕎購自山西省靈丘?？嗍w殼置于真空干燥箱中60℃恒溫3 h，粉碎、過40目篩，置于廣口瓶備用。

1.1.2試劑

蕓香葉苷：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；95%乙醇（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；亞硝酸鈉（分析純）：天津市天大化工實驗廠；硝酸鋁（分析純）：北京化工廠；氫氧化鈉（分析純）：天津市北辰方正試劑廠。

1.2儀器

AB204-N型電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；752N型紫外分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；KQ-100DB型高功率數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1工作曲線

測定方法參考文獻(xiàn)［8］。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用硝酸鋁法，在510 nm處測其吸光度值。繪制黃酮工作曲線，得回歸方程：A=10.193C+0.009 8（R2=0.998 4，C單位mg/mL）。

1.3.2苦蕎黃酮的提取及測定

準(zhǔn)確稱取0.2 g苦蕎殼粉放入100 mL錐形瓶中按一定的液固比加入60%乙醇，超聲提取一段時間后，高速離心10 min。重復(fù)提取后合并濾液。將提取液定容至25 mL。準(zhǔn)確吸取3.0 mL待測液置于10 mL比色管中，加80%乙醇至5 mL，加入5%NaNO20.5mL，搖勻，放置6 min，加入10%Al（NO）30.5mL，搖勻，放置6 min，再加入4%的NaOH溶液4 mL，加80%乙醇定容至10 mL，搖勻，靜置15 min；在波長510 nm處測定吸光度，代入下式計算黃酮含量（Y%）：

黃酮含量Y（%）=濃度（mg/mL）×稀釋倍數(shù)×提取液體積（mL）/［原料干重（g）×103］×100%

1.3.3苦蕎黃酮提取的單因素實驗

準(zhǔn)確稱取苦蕎殼0.2 g，對液固比、超聲時間、超聲溫度、超聲功率、提取次數(shù)進(jìn)行單因素探索實驗，分別考察這5個因素對黃酮收率的影響。

1.3.4Box-Behnken星點優(yōu)化設(shè)計

為了分析各因素之間的交互作用對結(jié)果的影響，分析參數(shù)影響因素，得到最佳的提取工藝，試驗在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計，以苦蕎殼黃酮的提取率為考察目標(biāo)，分別以超聲功率、時間、溫度、液固比對應(yīng)四個獨立變量A、B、C、D，實驗的因素水平編碼見表1。

2結(jié)果與討論

2.1溶劑濃度的選取

分別用H2O，20%、40%、60%、80%乙醇，無水乙醇作溶劑，在超聲功率60 W、時間30 min、液固比45∶1、溫度40℃、提取次數(shù)2次條件下提取，選取最佳溶劑濃度，結(jié)果見表2。

表1　Box-Behnken星點設(shè)計因素水平表Table 1Factor levels of Box-Behnken design

表2　乙醇濃度對苦蕎殼總黃酮得率的影響Table 2Effects of ethanol on the flavonoids rates of the tatary buckwheat shell

2.2單因素試驗

2.2.1液固比對總黃酮得率的影響

在超聲時間為30 min，超聲溫度為40℃，超聲功率為60 W，提取次數(shù)為2的情況下。提取液固比分別為15∶1、30∶1、45∶1、60∶1、75∶1，提取液固比對提取率的影響見圖1。

圖1　液固比對總黃酮得率的影響Fig.1The influence of liquid-solid ratio on the extraction rate of tartary buckwheat flavonoid

可以看出液固比較小時，黃酮產(chǎn)率較低，隨著液固比的增加，產(chǎn)率逐漸增大。但是，過多的加水量帶來的產(chǎn)率的提高并不顯著，且會給后續(xù)分離工作帶來很大負(fù)擔(dān)。因此，最佳液固比選取45∶1mL/g。

2.2.2超聲時間對總黃酮得率的影響

在液固比為45∶1，超聲功率為60 W，超聲溫度為40℃，提取次數(shù)為2次的情況下。提取時間分別為5、15、25、35、45 min，提取時間對提取率的影響見圖2。

圖2　時間對總黃酮得率的影響Fig.2The influence of extraction time on the extraction rate of tartary buckwheat flavonoid

可以看出25 min之前，隨著超聲時間的增加，黃酮產(chǎn)率逐漸升高；25 min之后，產(chǎn)率隨超聲時間延長逐漸降低。因此，選擇最佳超聲時間為25 min。

2.2.3溫度對總黃酮得率的影響

在上述選定優(yōu)化條件、提取次數(shù)為2次的情況下，提取溫度分別為30、40、50、60、70℃，提取溫度對提取率的影響結(jié)果見圖3。

圖3　溫度對總黃酮得率的影響Fig.3The influence of temperature on the extraction rate of tartary buckwheat flavonoid

實驗表明，溫度超過40℃時，黃酮產(chǎn)率快速增大，高溫有利于苦蕎殼總黃酮的快速溶出，因此，選擇50℃為最佳提取溫度。

2.2.4超聲功率對總黃酮得率的影響

在液固比為45∶1，超聲時間25 min，超聲溫度為50℃，提取次數(shù)為2次的情況下。提取功率分別為40、50、60、70、80 W，提取功率對提取率的影響結(jié)果見圖4。

可以看出在一定范圍內(nèi)增加超聲功率，黃酮產(chǎn)率隨之升高；超聲功率超過50 W，產(chǎn)率隨功率升高而下降，其作用機理尚待進(jìn)一步研究。因此，選擇最佳超聲功率為50 W。

2.2.5提取次數(shù)對總黃酮得率的影響

在液固比為45∶1，超聲時間為25 min，超聲溫度為50℃，超聲功率50 W的情況下。提取次數(shù)分別為1次、2次、3次，提取次數(shù)對提取率的影響見圖5。

圖4　超聲功率對總黃酮得率的影響Fig.4The influence of ultrasonic power on the extraction rate of tartary buckwheat flavonoid

圖5　提取次數(shù)對總黃酮得率的影響Fig.5The influence of extraction times on the extraction rate of tartary buckwheat flavonoid

提取2次后變化較小，考慮節(jié)時節(jié)能，提取實驗均采取2次提取。

2.3響應(yīng)面法實驗結(jié)果

2.3.1響應(yīng)面法實驗結(jié)果分析

按表1利用設(shè)計軟件Design-Expert，得到的四因素三水平的星點設(shè)計—響應(yīng)面分析實驗方案，計算結(jié)果見表3。

表3　實驗方案及結(jié)果分析Table 3Results analysis and program of the design of response surface analysis methods

續(xù)表3實驗方案及結(jié)果分析Continue table 3Results analysis and program of the design of response surface analysis methods

本實驗中，5，10，16、22、23組為中心實驗，其余均為析因?qū)嶒灒?9個試驗點分為析因點和零點，其中析因點是與自變量A、B、C、D所對應(yīng)的三維頂點，零點實驗重復(fù)5次，用以估計實驗誤差。

2.3.2方差分析和回歸方程

對表3實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多項擬合回歸，建立回歸方程Y=2.01-3.333×10-3A+0.017B+0.033C+0.05D+ 0.02AB+7.5×10-3AC-0.013AD-7.5×10-3BC-0.012BD-0.01CD-0.056A2-0.074B2-0.059C2-0.1D2。對模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表4　方差分析表Table 4The analysis of regression model

續(xù)表4方差分析表Continue table 4The analysis of regression model

由表4可知，本實驗所選模型不同處理間差異較顯著，說明回歸方程描述各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系時，其應(yīng)變量與全體自變量之間線性關(guān)系是顯著的，即這種實驗方法是可靠的；變異系數(shù)（C.V.%值3.20）較低，說明實驗有良好的穩(wěn)定性；模型的相關(guān)系數(shù)R2= 0.843 8，說明該模型可靠性較好。從回歸方程模型因變量的方差分析可知，模型一次項A（P=0.851 0），B（P= 0.354 8）差異不顯著，C（P=0.076 3），D（P=0.012 3）差異顯著，二次項D2（P=0.000 8）差異極顯著。表明液固比對總黃酮得率的主效應(yīng)明顯。依據(jù)系數(shù)值可知因素的主效應(yīng)關(guān)系為：液固比>溫度>時間>超聲功率［9］。

2.4響應(yīng)面圖分析

為了進(jìn)一步考察4個試驗因子：超聲提取功率（A）、時間（B）、溫度（C）、液固比（D）的交互作用以及確定最優(yōu)點，對回歸模型采用降維法分析，即可得到兩因子的回歸模型，并通過Design-Expert7.0軟件繪制出響應(yīng)面曲線圖來進(jìn)行直觀的分析見圖6～圖11分別顯示了6組以得率為響應(yīng)值的趨勢圖，從響應(yīng)面圖可以直觀地反應(yīng)出兩變量交互作用地顯著程度。

圖6　超聲功率和時間對黃酮得率響應(yīng)面Fig.6The mutual interactions of ultrasonic time and power on the yield of tartary buckwheat flavonoid

圖7　超聲功率和溫度對黃酮得率響應(yīng)面Fig.7The mutual interactions of ultrasonic power and temperature on the yield of tartary buckwheat flavonoid

圖8　超聲功率和液固比對黃酮得率響應(yīng)面Fig.8The mutual interactions of ultrasonic power and solid-liquid ratio on the yield of tartary buckwheat flavonoid

圖9　時間和溫度對黃酮得率響應(yīng)面Fig.9The mutual interactions of ultrasonic time and temperature on the yield of tartary buckwheat flavonoid

圖10　時間和液固比對黃酮得率響應(yīng)面Fig.10The mutual interactions of ultrasonic time and liquid-solid ratio on the yield of tartary buckwheat flavonoid

圖11　溫度和液固比對黃酮得率響應(yīng)面Fig.11The mutual interactions of ultrasonic temperature and liquid-solid ratio on the yield of tartary buckwheat flavonoid

由圖6和圖10可看出，超聲功率和時間及液固比和時間兩個因素共同作用對響應(yīng)供過響應(yīng)值的影響較顯著。由圖8和圖11可看出超聲功率和液固比及溫度和液固比兩個因素共同作用對響應(yīng)值的影響不顯著［10］。

2.5最優(yōu)工藝條件求取

為了進(jìn)一步確定最佳點的值，對回歸方程取一階偏導(dǎo)等于零，可以得到曲面的最大點，求導(dǎo)方程整理得：

求解方程組得：A=－0.025 9，B=0.079 6，C=0.251 8，D=0.234 4。最后求得超聲功率、時間、溫度、液固比的最適值分別為：a=49.74 W，b=25.8 min，c=52.52℃，d= 48.5 mL/g。此時，黃酮的理論得率為2.022%。根據(jù)實際情況取最佳的提取工藝參數(shù)為：超聲功率50 W、時間26 min、溫度53℃、液固比49 mL/g。驗證實驗表明，得率為2.02%，與理論值相符。因此，采用響應(yīng)面法得到的提取條件參數(shù)相對較為可靠，具有使用價值。

3結(jié)論

通過Design-Expert 7.0軟件進(jìn)行星點設(shè)計—響應(yīng)面分析法，能夠可靠地進(jìn)行優(yōu)化試驗以及數(shù)據(jù)處理，本實驗應(yīng)用這一方法對苦蕎殼黃酮提取的超聲工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。在單因素的基礎(chǔ)上應(yīng)用DesignExpert 7.0軟件四因素三水平的實驗，確定出了苦蕎殼黃酮超聲提取的優(yōu)化工藝條件為：超聲功率50 W、時間26 min、溫度53℃、液固比49 mL/g，得率為2.02%。實驗證明，采用響應(yīng)面法獲得的苦蕎中黃酮的超聲提取工藝條件，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，科學(xué)可行。

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The Study of Ultrasonic Extraction and Optimization on the Flavonoids of Tatary Buckwheat with Response Surface Analysis Methods

CHEN Jin-e，WANG Ya-jun，ZHAO Zhi-gang，LIU Yong-lin，ZHANG Hai-rong*
（Institute of Biochemical Analysis，Xinzhou Teachers'University，Xinzhou 034000，Shanxi，China）

The ultrasonic extraction conditions of the flavonoids of the Tatary Buckwheat shell were optimized with response surface analysis methods on the basis of single-factor experiments.The effects of ultrasonic power，ultrasonic time，ultrasonic temperature，liquid to solid ratio on yield of flavonoids of the Tatary Buckwheat shell were investigated using a central composite design.The results showed that the best conditions of ultrasonic extraction flavonoids were as follows：50 W of ultrasonic extraction power，26 min of extraction time，53℃of extraction temperature，49 mL/g of liquid to solid ratio，two grade of extraction times by Design Expert 7，the yield of flavonoids was up to 2.02%in optimal condition.

the Tatary Buckwheat flavonoids；response surface analysis methods；ultrasonic extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.006

2013-08-28

忻州師范學(xué)院重點學(xué)科建設(shè)項目資助計劃（xk201402）；山西省高等學(xué)校教學(xué)改革項目（2015-100）；忻州師范學(xué)院應(yīng)用化學(xué)創(chuàng)新實踐基地（2013-31）；山西省教育廳重點建設(shè)學(xué)科項目（20141010）作者簡介：陳金娥（1957—），女（漢），副教授，本科，主要從事植物成分分離分析。

張海容，男，教授，博士，主要從事有機分析。