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    連花清瘟顆粒微生物限度檢查方法的研究

    2015-10-28 01:49:16北京以嶺藥業(yè)有限公司102600李志紅王磊李海南王彥彥
    首都食品與醫(yī)藥 2015年2期
    關(guān)鍵詞:平皿試液本品

    北京以嶺藥業(yè)有限公司(102600)李志紅 王磊 李海南 王彥彥

    1 材料與儀器

    樣品為連花清瘟顆粒三批,批號分別為091201、091202、091203,由北京以嶺藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

    營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基均由北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn),按說明書要求配制,121℃濕熱滅菌15 min,備用。

    枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501],金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003],大腸埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102],乙型副傷寒沙門菌(Salmonella paratyphi B)[CMCC(B)50094],白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001],黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]。

    脈動真空滅菌器(XG1.G型,山東新華醫(yī)療器械股份有限公司),生物安全柜(BHC-1300ⅡA2型,蘇州凈化設(shè)備有限公司),生化培養(yǎng)箱(LRH-250F,上海一恒科技有限公司),霉菌培養(yǎng)箱(MJ-250Ⅱ型,上海一恒科技有限公司),電熱恒溫水箱(HHW21.420型,天津泰斯特儀器有限公司)。

    2 預(yù)試驗(yàn)[1]

    按照《中國藥典》2010年版一部附錄微生物限度檢查法中的平皿法進(jìn)行回收率試驗(yàn),結(jié)果金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率均小于70%,其余試驗(yàn)菌株的回收率均大于70%,采用培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行試驗(yàn)(1∶10供試液,0.2ml/皿),金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率均大于70%。

    采用常規(guī)法對樣品進(jìn)行大腸埃希菌檢查,結(jié)果陽性菌生長良好,說明本品在該條件下對大腸埃希菌的抑制作用可以忽略。

    據(jù)此,擬定本品的微生物限度檢查方法草案如下。

    取本品10g,加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml,振搖至供試品分散均勻,制成1∶10的供試液;細(xì)菌數(shù)采用培養(yǎng)基稀釋法,取1∶10的供試液1ml,等量分注于5個平皿中,每皿0.2ml;霉菌及酵母菌數(shù)采用平皿法,取1∶10的供試液1ml,注入平皿中,每皿1ml;大腸埃希菌采用常規(guī)法。

    3 方法學(xué)驗(yàn)證[1][4]

    3.1 菌液的制備按照中國藥典2010年版一部附錄微生物限度檢查法進(jìn)行。

    3.2 供試液的制備

    取本品10g,加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml,振搖至供試品分散均勻,制成1∶10的供試液。

    3.3 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

    3.3.1 試驗(yàn)組

    取1∶10供試液0.2ml和枯草芽孢桿菌菌液1ml,分別注入同一平皿中,立刻傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,混勻,待凝固后置30℃~35℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天,計(jì)數(shù)。用同樣的方法對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行試驗(yàn)。

    取1∶10供試液1ml和白色念珠菌菌液1ml,分別注入同一平皿中,立刻傾注玫瑰紅鈉培養(yǎng)基,混勻,待凝固后置23℃~28℃霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天,計(jì)數(shù)。

    取1∶10供試液1ml和黑曲霉孢子懸液1ml,分別注入同一平皿中,立刻傾注玫瑰紅鈉培養(yǎng)基,混勻,待凝固后置23℃~28℃霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天,計(jì)數(shù)。

    結(jié)果見附表1。

    3.3.2 菌液組

    分別取上述菌液1ml,采用平皿法,測定制備好的菌液的菌數(shù)(cfu/ml),所用培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件同3.3.1,結(jié)果見附表2。

    3.3.3 供試品對照組

    取1∶10的供試液1ml,等量分注于5個平皿中,每皿0.2ml,立刻傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,混勻,待凝固后置30℃~35℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天,測定其本底的細(xì)菌數(shù)。

    取1∶10的供試液1ml,注入平皿中,立刻傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基,混勻,待凝固后置23℃~28℃霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天,測定其本底的霉菌及酵母菌數(shù)。結(jié)果見附表3。

    3.3.4 回收率

    附表1 試驗(yàn)組菌落計(jì)數(shù)(cfu/皿)

    附表2 菌液組菌落計(jì)數(shù)(cfu/皿)

    附表3 供試品對照組菌落計(jì)數(shù)(cfu/皿)

    附表4 回收率(%)

    附表5 大腸埃希菌檢查結(jié)果

    分別進(jìn)行3次獨(dú)立試驗(yàn),結(jié)果見附表4。

    結(jié)果顯示,各試驗(yàn)菌的回收率均大于70%,表明該方法可以有效地減弱本品對試驗(yàn)菌的抑制作用。

    3.4 大腸埃希菌檢查方法的驗(yàn)證

    3.4.1 供試品組

    取1∶10供試液10ml,加至100ml乳糖膽鹽培養(yǎng)基中,置30℃~35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。

    3.4.2 空白對照組

    取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10ml,加至100ml乳糖膽鹽培養(yǎng)基中,置30℃~35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。

    3.4.3 試驗(yàn)組

    取1∶10供試液10ml,加至100ml乳糖膽鹽培養(yǎng)基中,再加入1ml大腸埃希菌菌液,置30℃~35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。

    分別取上述培養(yǎng)物0.2ml,加至含5ml4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基試管中,置30℃~35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5~24h,觀察結(jié)果。見附表5。

    結(jié)果顯示,試驗(yàn)組檢出大腸埃希菌,供試品組和空白對照組結(jié)果為陰性,說明該方法檢查大腸埃希菌可行。

    綜上所述,草案擬定的方法可行。

    4 確定的微生物限度檢查方法[6][7]

    取本品10 g,加p H 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml,振搖至供試品分散均勻,制成1∶10的供試液;細(xì)菌計(jì)數(shù)采用培養(yǎng)基稀釋法,取1∶10的供試液1ml,等量分注于5個平皿中,每皿0.2ml;霉菌及酵母菌數(shù)采用平皿法,取1∶10的供試液1ml,注入平皿中,每皿1ml;大腸埃希菌采用常規(guī)法。

    5 討論

    由于中成藥的成分復(fù)雜,常有抑菌性,如果不對微生物限度檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證,只采用平皿法,會使結(jié)果產(chǎn)生較大的誤差。因此要采取適當(dāng)?shù)姆椒p弱供試液的抑菌性,同時對方法進(jìn)行驗(yàn)證,才能確保結(jié)果的可靠性。如何減弱抑菌性,在方法的選擇上可以優(yōu)先考慮稀釋法,簡單可靠。離心沉淀法較為繁瑣且有局限性,故未采用。

    本品供試液不能全部透過濾膜,薄膜上表面有較多殘留,不適合薄膜過濾法。本品抑菌成分復(fù)雜,也很難采用中和法。因此優(yōu)先選擇培養(yǎng)基稀釋法,驗(yàn)證的結(jié)果表明,此方法可有效消除連花清瘟顆粒的抑菌性,使微生物限度檢查結(jié)果準(zhǔn)確可靠[2][3][5]。

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