厄貝沙坦抑制大鼠平滑肌細胞AT1R及其下游信號通路

龔晶婧 盧卓強 許昌聲 王華軍 晉學慶*

（福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，福建 福州 350005）

厄貝沙坦抑制大鼠平滑肌細胞AT1R及其下游信號通路

龔晶婧 盧卓強 許昌聲 王華軍 晉學慶*

（福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，福建 福州 350005）

目的 本研究目的是利用厄貝沙坦、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）干預平滑肌細胞，闡明血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑（ARB）對血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1R）表達及其下游信號通路的影響。方法 利用Western Blot技術，研究厄貝沙坦、血管緊張素Ⅱ干預平滑肌細胞后對細胞AT1受體蛋白表達及其下游信號通路-細胞外信號調節(jié)激酶1/2（ERK1/2）和信號轉導子和轉錄激活子3（STAT3）蛋白磷酸化水平的影響。結果 研究發(fā)現(xiàn)厄貝沙坦能顯著地抑制AngⅡ誘導的AT1受體蛋白表達（ 0.208±0.022 vs 0.997±0.131，P<0.01）及下游信號通路中的ERK1/2蛋白磷酸化（0.055±0.007 vs 0.103±0.020，P<0.01）、STAT3蛋白磷酸化（0.162±0.010 vs 0.758±0.054，P<0.01）。結論 這些研究結果表明厄貝沙坦抑制AT1R和下游的ERK1/2及STAT3信號通路，從而抑制AngⅡ誘導的平滑肌細胞增殖等，發(fā)揮控制血壓、防治心腦血管疾病作用。

厄貝沙坦；血管緊張素Ⅱ1型受體；ERK1/2；STAT3

腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）在人體內涉及多器官、多系統(tǒng)，是一種重要的調節(jié)系統(tǒng)和循環(huán)通路。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是RAS系統(tǒng)中一個重要的負性調控物質，是由一種重要代謝酶即血管緊張素轉化酶（ACE）轉換血管緊張素1產生的。AngⅡ作用于AT1受體，主要的生理作用是引起血管平滑肌細胞增生、遷移和細胞肥大、血管收縮、內皮損傷、組織重構、炎性因子表達和促進氧化應激等生物學效應[1-2]。目前血管緊張素Ⅱ受體特異性抑制劑（ARB）主要作用于腎素-血管緊張素- 醛固酮系統(tǒng)，能有效地控制血壓，改善心功能，提高患者的運動耐受時間并顯著改善癥狀等，在臨床上已成為治療高血壓及心血管疾病，減少心腦血管事件及腎功能障礙發(fā)生的一線藥物之一[3]。

對AT1 R研究已經(jīng)證明，血管緊張素Ⅱ的生物作用，大部分是通過與AT1R結合后實現(xiàn)的[4-5]。AT1受體調控主要是通過細胞外信號調節(jié)激酶1/2（ERK1/2）、p38-絲裂原活化蛋白激酶（p38- MAPK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、信號轉導及轉錄激活因子3（STAT3）等來調節(jié)平滑肌細胞的增生、遷移、黏附等。

本研究主要通過血管緊張素Ⅱ受體特異性抑制劑（ARB）類藥物厄貝沙坦干預平滑肌細胞，研究厄貝沙坦對AngⅡ誘導的AT1受體蛋白及下游信號通路中的ERK1/2、STAT3蛋白磷酸化水平的影響，探討ARB類藥物拮抗AngⅡ的生物學作用，從而進一步研究其防治心腦血管疾病的機制。

1　材料與方法

1.1主要材料：體質量為120～130 g普通SD成年大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，AngⅡ購自Sigma公司（美國），厄貝沙坦：揚子江藥業(yè)惠贈，TRIZOL試劑：購自Invitrogen公司（美國），兔抗大鼠AT1R一抗（英國Abcam公司），兔抗大鼠P-STAT3、STAT3一抗（美國CST公司），兔抗大鼠P-ERK1/2、ERK1/2一抗（美國CST公司），小鼠β-actin一抗、羊抗大鼠和小鼠二抗（美國Santa Cruz公司），DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）。

1.2SD大鼠胸主動脈平滑肌細胞（VSMC）的培養(yǎng)。SD大鼠胸主動脈平滑肌細胞（VSMC）的培養(yǎng)：采用組織貼塊法培養(yǎng)。

1.3實驗分組：對照組僅用DMEM（2000 mg/L D-葡萄糖、非必需氨基酸、110 mg/L丙酮酸鈉、1.5 g/L碳酸氫鈉、25 mmol/L HEPES和L-谷氨酰胺培養(yǎng)基，pH 7.4）；AngⅡ干預組的終濃度分別為10-7mol/L，各組干預VSMC細胞8 h。厄貝沙坦干預濃度為10-7mol/L，在Ang Ⅱ干預前0.5 h 加入。細胞分組：①空白對照組。②AngⅡ組。③AngⅡ+厄貝沙坦組。④厄貝沙坦組。

1.4Western Blot檢測AT1R蛋白表達和ERK1/2及STAT3蛋白磷酸化水平：將細胞接種在6孔培養(yǎng)板上，分別將Ang Ⅱ和厄貝沙坦按上述最適濃度干預VSMCs完成后，在每孔中加入200 μL RIPA（組成：50 mmol/L Tris-HCl pH 7.4，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.1% SDS），提取蛋白。10%的SDS-PAGE電泳、轉膜，5% 的脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加入兔抗大鼠AT1R（1∶800），兔抗大鼠P-ERK1/2、ERK1/2（1∶800），兔抗大鼠P-STAT3、STAT3（1∶800），4 ℃ 過夜，用TBST（組成：1M Tris-HCl 10 mL pH 7.4，NaCl 8.8 g，吐溫200.05%）洗3次，每次10 min。加入二抗（1∶1500），室溫培育1 h，TBST洗3次，每次10 min。顯色、曝光，經(jīng)Guantity onel軟件分析A值，并與內參照的比值作為半定量指標進行比較。

1.5統(tǒng)計學處理：每個樣本采用復孔，重復4次。所得數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0軟件系統(tǒng)分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間指標的均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩均數(shù)比較采用LSD檢驗。P<0.05被認為有顯著性差異。

2　實驗結果

2.1厄貝沙坦對AngⅡ誘導VSMC 后AT1受體蛋白表達水平的影響：Western-Blot檢測VSMC中AT1受體蛋白的表達。我們觀察到：與空白對照組相比，AngⅡ干預VSMC后AT1受體蛋白的表達明顯增加（0.731±0.079 vs 0.997±0.131，P<0.01）。厄貝沙坦干預VSMC后能抑制AngⅡ誘導的AT1受體蛋白的表達，較AngⅡ組明顯減少（0.208±0.022 vs 0.997±0.131，P<0.01）。另外厄貝沙坦組的AT1受體蛋白表達水平同樣較空白組減少（0.093±0.011 vs 0.731±0.079，P<0.01）。上述結果說明厄貝沙坦干預平滑肌細胞后明顯抑制Ang Ⅱ對AT1受體的刺激作用。見圖1。

圖1　顯示W(wǎng)estern blot檢測不同干預組平滑肌細胞AT1R蛋白表達，結果表明：AngⅡ增加AT1受體蛋白的表達，與對照組相比P<0.01。厄貝沙坦干預能明顯減少AngⅡ 誘導的VSMC AT1受體蛋白的表達，與Ang Ⅱ 組對比P<0.01（n=4）（*P<0.01 vs 空白對照組 ，# P<0.01，vs AngⅡ組 a：空白對照；b：AngⅡ；c：AngⅡ+厄貝沙坦；d：厄貝沙坦AnⅡ：血管緊張素Ⅱ ； AT1R：血管緊張素Ⅱ 1型受體

2.2厄貝沙坦對AngⅡ誘導VSMC后ERK1/2蛋白磷酸化水平的影響：Western-Blot檢測VSMC中STAT3蛋白磷酸化水平。我們觀察到：與空白對照組相比，AngⅡ干預VSMC后STAT3蛋白磷酸化水平明顯增加（0.062±0.008 vs 0.103±0.020，P<0.01）。厄貝沙坦干預VSMC后明顯抑制AngⅡ誘導的ERK1/2蛋白磷酸化，較AngⅡ組明顯減少（0.055 ±0.007 vs 0.103±0.020，P<0.01）。另外厄貝沙坦組的ERK1/2蛋白磷酸化水平同樣較空白組減少（0.026±0.006 vs 0.062±0.008，P<0.01）。以上結果表明厄貝沙坦明顯抑制Ang Ⅱ 刺激AT1受體介導的信號通路ERK1/2的磷酸化。見圖2。

2.3厄貝沙坦對AngⅡ誘導VSMC后STAT3蛋白磷酸化水平的影響：Western-Blot檢測VSMC中STAT3蛋白磷酸化水平。我們觀察到：與空白對照組相比，AngⅡ干預VSMC后STAT3蛋白磷酸化水平明顯增加（0.318±0.059 vs 0.758±0.054，P<0.01）。厄貝沙坦干預VSMC后明顯抑制AngⅡ誘導的STAT3蛋白磷酸化，較AngⅡ組明顯減少（0.162±0.010 vs 0.758±0.054，P<0.01）。另外厄貝沙坦組的STAT3蛋白磷酸化水平同樣較空白組減少（0.081±0.031 vs 0.318±0.059，P<0.01）。以上結果表明厄貝沙坦明顯抑制AngⅡ 刺激AT1受體介導的信號通路STAT3的磷酸化。見圖3。

圖2　顯示W(wǎng)estern blot檢測不同干預組平滑肌細胞ERK1/2蛋白磷酸化水平，結果表明：AngⅡ增加ERK1/2蛋白的磷酸化，與對照組相比P<0.05。厄貝沙坦干預后能明顯減少Ang Ⅱ 誘導的ERK1/2蛋白的磷酸化，與AngⅡ 組對比P<0.01（n=4）（* P<0.01vs空白對照組，# P<0.01vs AngⅡ組a：空白對照；b：AngⅡ；c：AngⅡ+厄貝沙坦；d：厄貝沙坦 ERK1/2：細胞外信號調節(jié)激酶1/2；T：total；P：phosphorylation

圖3　顯示W(wǎng)estern blot檢測不同干預組平滑肌細胞STAT3蛋白磷酸化水平，結果表明：AngⅡ增加STAT3蛋白的磷酸化，與對照組相比P<0.05。厄貝沙坦干預后能明顯減少AngⅡ誘導的STAT3蛋白的磷酸化，與Ang Ⅱ 組對比P<0.01（n=4）（* P<0.01vs空白對照組，# P<0.01 vs AngⅡ組 a：空白對照；b：AngⅡ；c：AngⅡ+厄貝沙坦；d：厄貝沙坦 STAT3：信號轉導子和轉錄激活子3；T：total；P：phosphorylation

3　討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ能誘導平滑肌細胞的AT1受體蛋白表達和AT1下游信號通路ERK1/2、STAT3蛋白磷酸化水平，而ARB類藥物厄貝沙坦干預平滑肌細胞后，能明顯地抑制AngⅡ誘導的AT1受體蛋白表達和ERK1/2、STAT3蛋白磷酸化水平，差異有顯著統(tǒng)計學意義。

AngⅡ的生物作用，主要是通過與AngⅡ特異性1型受體（AT1R）結合后實現(xiàn)的[5-9]。大量研究表明AT1受體調控主要是通過ERK1/2、p38、JNK來調節(jié)平滑肌細胞的增殖、黏附。近年來也有少量報道表明，JAK2、IRS-1的磷酸化也參與AT1受體調節(jié)細胞的增殖、黏附[10-11]。ARB類藥物可在受體水平上高選擇、高效地阻斷AngⅡ與AT1 受體的結合，導致血管平滑肌收縮、醛固酮分泌增加，能有效地阻斷AngⅡ的水鈉潴留、血管收縮與組織重構作用，從而阻斷AngⅡ介導的生物學效應。何松堅等通過檢測2 型糖尿病大鼠血清AT1受體自身抗體證明厄貝沙坦聯(lián)合缺血后適應可明顯減輕2 型糖尿病大鼠缺血再灌注后AT1R的表達，從而可能抑制早期心肌及間質纖維化的發(fā)生，抑制早ARB類藥物具有控制血壓、減輕心肌肥厚、改善早期心肌纖維化、減輕早期心室重構、改善預后的作用。其機制可能與調節(jié)AngⅡ、AT1R 的水平有關。本研究發(fā)現(xiàn)，厄貝沙坦能明顯地抑制AngⅡ誘導的AT1R 蛋白水平以及AT1下游信號通路上的ERK1/2、STAT3蛋白磷酸化水平。目前國內外也有類似的研究報道。Moreno 等研究發(fā)現(xiàn)，AT1受體阻滯劑厄貝沙坦能夠通過抑制異源表達的KCNQ1/ KCNE1 通道電流[14]，阻滯AT1受體產生，起到治療房顫作用，提示ARB類藥物治療房顫的機制不但涉及心臟組織再建，同時也影響心臟電生理再建。周希等研究發(fā)現(xiàn)替米沙坦通過AT1R經(jīng)ERK 信號途徑影響高血壓大鼠纖溶系統(tǒng)的活性[15]。Benkirane等研究證實替米沙坦可以抑制AngⅡ經(jīng)AT1R 介導的ERK 信號通路激活，從而抑制AngⅡ誘導的平滑肌細胞的增殖和物質合成[16]。另外，替米沙坦亦可通過AT1R 作用經(jīng)ERK 信號通路調控纖溶活性從而改善大鼠心肌梗死后的纖溶系統(tǒng)功能[17]。

期心室重構[12]。王亞萍等研究發(fā)現(xiàn)替米沙坦可通過減少腎周脂肪堆積，抑制其局部RAAS，改善肥胖相關的血壓異常[13]。

綜上所述，ARB類藥物厄貝沙坦能通過下調AngⅡ誘導的AT1受體蛋白及下游信號通路中的ERK1/2、STAT3蛋白磷酸化從而拮抗AngⅡ誘導的生物學作用，減輕細胞炎癥及增殖等，最終抑制血管收縮、血壓升高、心肌重構、血管斑塊不穩(wěn)定方面等病理改變，發(fā)揮預防及治療心腦血管疾病的生理作用。

[1] Cherney DZ,Lai V,Scholey JW,et al.Effect of direct renin inhibition on renal hemodynamic function,arterial stiffness,and endothelial function in humans with uncomplicated type 1 diabetes: apilot study[J].Diabetes Care,2010,33(2):361-365.

[2] Kaminska M,Musia W,Chabielska E.AngiotensinⅡ:the risk factor for arterial thrombosis[J].Kardiol Pol,2013,71(4):410-416.

[3] 周晨育.纈沙坦聯(lián)合卡托普利治療慢性心力衰竭療效觀察[J].實用心腦肺心血管病雜 志,2013,21(3):19-22.

[4] Culman J,Hohle S,Qadri F,et a1.Angiotensin as neuromodulator/ neur-otransmitter in central control of body fluid and electrolyte homeostasis[J].Clin Exp Hypertens,1995,17(1/2):281–293.

[5] Oliverio MI,Best CF,Smithies O,et al.Regulation of sodium balance and blood pressure by the AT(1A) receptor for angiotensin Ⅱ[J]. Hypertension,2000,35(2): 550–554.

[6] 馬向紅,黃體鋼,楊萬松,等.血管緊張素Ⅱ對人臍靜脈內皮細胞產生一氧化氮和超氧陰離子的影響[J].中華心血管病雜志,2004, 32(7):442-445.

[7] 李正在,廖玉華,周子華,等.高血壓患者抗α1腎上腺素受體抗體與心臟重構的臨床觀察[J] .中華心血管病雜志,2006,34(7):602-604.

[8] Dechend R,Homuth V,Wallukat G,et al.Agonistic antibodies directed at the angiotensin Ⅱ,AT1 receptor in preeclampsia [J] .J Soc Gynecol Investig,2006,13 (2):79-86.

[9] Hou FF,Zhang X,Zhang GH,et al.Efficacy and safety of benazepril for advanced chronic renal insufficiency [ J].N Engl J Med,2006, 354(2):131-140.

[10] Li JM,Cui TX,Shiuchi T,et a1.Nicotine enhances angiotensin Ⅱ-induced mitogenic response in vascular smooth muscle cells and fibroblasts[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2004,24(1):80-84.

[11] Mascareno E,Beckles DL,Siddiqui MA,et a1.Janus kinase-2 signaling mediates apoptosis in rat cardiomyocytes[J].Vascul Pharmacol, 2005,43(5):327-335.

[12] 何松堅,吳鏗,游瓊,等.厄貝沙坦聯(lián)合缺血后適應對糖尿病大鼠缺血再灌注損傷早期心肌纖維化及心室重構的影響[J] .臨床醫(yī)學工程,2015,22(3):279-282.

[13] 王亞萍,宋艷,李昊,等.高脂喂食誘導的肥胖大鼠腎周脂肪與血壓的關系及替米沙坦干預的影響[J] .中華高血壓雜志,2015,23 (2):138-144.

[14] Moreno I,Caballero R,Gonzalez T,et al.Effects of irbesartan on cloned potassium channels involved in human cardiac repolarization[J].J Pharmacol Exp Ther,2003,304( 2):862-873.

[15] 周希,李法琦,余江恒,等.替米沙坦對高血壓大鼠纖溶功能的作用機制[J].中華高血壓雜志,2006,14(8):651-655.

[16] Benkirane K,Amiri F,Diep QN.PPAR-gamma inhibits AngⅡ-induced cell growth via SHIP2 and 4E-BP1[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2006,290(1):H390-397.

[17] 黃妍,李法琦,周希,等.替米沙坦對心肌梗死后大鼠纖溶系統(tǒng)的影響[J].中國老年學雜志,2011,31(9):1571-1574.

Irbesartan Inhibits the AT1 Receptor -ERK1/2 and STAT3 Signal Pathway in Smooth Muscle Cells

GONG Jing-jing, LU Zhou-qiang, XU Chang-sheng, WANG Hua-jun, JIN Xue-qing
（The First Affiliated Hospital， Fujian Medical University， Fuzhou 350005， China）

Objective To explore the effects of the angiotensintype1-receptor blockers (ARB) on the expression of angiotnsin Ⅱ type 1 receptor. Methods Irbesartan was added into cultured vascular smooth muscle cells (VSMCs). Angiotensin Ⅱ type 1 (AT1) recetpor protein expression were detected with western blot, at the same time, the signalling pathway of (extracellular signal-regulated kinase 1/2)ERK1/2 and (Signal Transducer and Activator of Transcription 3) STAT3 AT1 receptor actived were also detected. Results It was found that Irbesartan inhibit significantly AT1 receptor protein expression，not only in the absence , but also in the presence of AngⅡ. Similar to AT1 receptor protein expression, the signal ERK1/2 and STAT3 phosphorylation was obviously inhibited while Irbesartan intervention. Conclusion This study data show that Irbesartan was able to inhibit AT1 receptor expression and signal pathway of ERK1/2 and STAT3 phosphorylation.

Irbesartan; AT1R; ERK1/2; STAT3

R54

B

1671-8194（2015）30-0028-03