兩種提取凍存全血基因組DNA方法的比較

呂曉巖* 嚴 笠 劉 霞 肖 苒*

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院整形外科醫(yī)院研究中心，北京 100144）

兩種提取凍存全血基因組DNA方法的比較

呂曉巖* 嚴 笠 劉 霞 肖 苒*

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院整形外科醫(yī)院研究中心，北京 100144）

目的 比較兩種不同方法提取凍存全血中基因組DNA的效果和特點。方法 分別用改良碘化鉀法和Promega全血基因組提取試劑盒提取全血基因組DNA，通過紫外分光光度儀、凝膠電泳、PCR進行檢測。結(jié)果 改良碘化鉀法和試劑盒法提取的基因組DNA濃度分別為（330.9±0.94）ng/μL和（490.3 ±3.16）ng/μL ；純度為（1.87±0.03）和（1.85±0.06）。試劑盒法提取的基因組DNA含量稍高于改良碘化鉀法，質(zhì)量和純度無顯著差異。結(jié)論 試劑盒法更簡便、快速、無毒地進行提取DNA，但價格較貴；改良碘化鉀法價格低廉，適合大量臨床血液標本的提取，能夠滿足分子生物學(xué)實驗的需要。

基因組DNA；碘化鉀法；改良法；外周血

人類基因組DNA是重要的遺傳信息載體，其提取技術(shù)是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，也是后續(xù)實驗成功的關(guān)鍵。臨床全血樣本來源零散數(shù)量大，往往不能及時提取DNA，部分樣本需低溫冷凍保存。但反復(fù)凍融會影響DNA的產(chǎn)量，因此從凍存標本中提取高產(chǎn)量、高純度的基因組DNA至關(guān)重要[1]。將碘化鉀法加以改良并與Promega公司試劑盒法比較，分析兩種方法提取基因組DNA的純度和產(chǎn)量及后續(xù)實驗效果。

表1　兩種方法提取的基因組DNA各項指標比較（n =10）

圖1　兩種方法提取的基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳

圖2　兩種方法提取基因組DNA的PCR瓊脂糖凝膠電泳

1　材料與方法

1.1儀器和試劑：超微量紫外分光光度計（美國），凝膠成像系統(tǒng)（美國），高速離心機（日本），PCR儀（德國），漩渦混合器（國產(chǎn)）；Promega全血基因組DNA提取試劑盒，氯仿/異戊醇，碘化鉀，氯化鈉。

1.2方法

1.2.1樣本收集：取-75 ℃冷凍保存的枸櫞酸鈉抗凝人外周血10份，2000 r/min 離心10 min，分離血漿和血細胞。血細胞分成兩份，300 μL/份。

1.2.2DNA提取

1.2.2.1試劑盒法：按照Promega全血基因組提取試劑盒使用說明書提取基因組DNA。

1.2.2.2改良碘化鉀法[7]：參考文獻[2]加以改良，實驗在4 ℃下操作：①300 μL抗凝血加1 mL 0.2% NaCl，混勻，室溫靜置10 min，12000 rpm，5 min，棄上清，沉淀為白細胞。若沉淀發(fā)紅再處理1次。沉淀中加80 μL 5 mol/L KI裂解白細胞膜，漩渦振蕩30 s；再依次加入0.9% NaCl溶液400 μL，氯仿/異戊醇（24∶1）混合液500 μL，振蕩混合1 min后，12000 rpm，5 min，吸取水相層轉(zhuǎn)移至1個1.5 mL離心管中。②加300 μL異丙醇沉淀DNA，12000 rpm，5 min，棄上清。③加1 mL70%乙醇洗滌沉淀2次，12000 rpm，1 min，棄上清待干，15 μL TE溶解DNA。

1.2.3DNA純度和濃度檢測：用紫外分光光度計測定基因組DNA的純度，以A260/A280的比值[3]表示；雙鏈DNA濃度（ng/μL）=OD260× 50（ng/μL）×稀釋倍數(shù)。

1.2.4DNA完整性檢測：兩組分別取60ngDNA采用1%瓊脂糖凝膠，100 V，40 min電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果檢測其完整性，拍攝成像。

1.2.5體外PCR擴增：針對管家基因GAPDH進行擴增。上游引物：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游引物：5'-TGGTGAAGAC GCCAGTGGA-3'，反應(yīng)體系20 μL，DNA含量200 ng，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)。

1.2.6統(tǒng)計學(xué)分析：應(yīng)用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用獨立樣本t檢驗方法，結(jié)果以均值±標準差（mean±SD）表示，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié) 果

2.1DNA濃度和純度檢測結(jié)果：比較兩種方法提取的的基因組DNA濃度和純度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)試劑盒法提取的DNA濃度、含量稍高于改良碘化鉀法，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，差異不明顯，P＞0.05，見表1。

2.2DNA完整性檢測結(jié)果：1%瓊脂糖凝膠電泳，兩組DNA條帶均沒有出現(xiàn)明顯拖尾現(xiàn)象（圖1）。

2.3PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳：將兩種不同方法提取的基因組DNA分別擴增內(nèi)參基因GAPDH，PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，均可見清晰目的條帶，擴增效果無差別。見圖2。

3　討 論

全血基因組DNA提取方法比較多，不同方法有各自的優(yōu)缺點，如試劑盒法、氯仿/異戊醇法、異硫氰酸胍法、固相吸附法、鹽析法和碘化物法等[4-6]。選擇簡便、快速、價格低廉、高效的方法是提取基因組DNA的重要條件。本試驗用改良碘化鉀法和Promega試劑盒法提取凍存全血基因組DNA，并對提取效果進行了比較。

在本實驗中改良碘化鉀法將血量由100μL增加到300μL，增加白細胞的數(shù)量而提高了DNA的產(chǎn)量；碘化鉀的用量增加到80μL，可以在短時間內(nèi)直接裂解白細胞膜、核膜，完全充分釋放DNA[7]。Promega試劑盒提取的DNA產(chǎn)量雖稍高于改良碘化鉀法，但無統(tǒng)計學(xué)意義，并且兩種方法提取的DNA純度都達到1.80以上水平，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和PCR檢測均可滿足后續(xù)分子生物學(xué)實驗的要求。但是試劑盒價格昂貴，對于凍存血樣來說，處理血細胞需要更多的細胞裂解液，提高了實驗成本，若提取大量臨床血液標本將增加實驗經(jīng)費；改良碘化鉀法配制簡單，方法易于掌握，重復(fù)性好，所用的試劑為實驗室常用的生化試劑價格低廉適合大批量臨床血液標本的提取。

[1] 王大明,鄒紅巖,李楨,等.全血反復(fù)凍融對工作站提取基因組DNA的影響[J].現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2009,5(3):96-98.

[2] 吳清敏,劉巧紅,滕云,等.外周血DNA提取方法的比較[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2004,27(7):445-446.

[3] 田子強,劉俊峰,張少為,等.甲醛固定石蠟包埋組織中DNA的三種提取方法比較[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2004,4(4):335-338.

[4] 白春英,周靜,瑞云,等.經(jīng)濟、有效提取外周血基因組DNA的方法[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床,2010,9(7):1795.

[5] 李曉曉,趙煥英,楊云廷,等.三種人全血基因組DNA提取方法的比較[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展,2013,27 (13):5221-5225.

[6] 張帥,徐銳,張強,等.改良鹽析法提取全血基因組DNA的影響因素研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2012,22 (35):42-46.

[7] 蔡雪梅,李穗文,胡大春.改良碘化鉀法提取凍存外周血基因組DNA的方法探討[J].分子診斷于治療雜志,2013,3(5):95-98.

Comparison of Two Methods for Extracting Genomic DNA from Human Whole Blood

LV Xiao-yan, YAN Li, LIU Xia, XIAO Ran
(Research Center of Plastic Surgery Hospital, Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College, Beijing 100144, China)

Objective To compare the effect and characteristics of genomic DNA extraction from frozen whole blood using two different methods. Methods Genomic DNA were extracted with potassium iodide method and Promega Genomic DNA Purification Kit.The detection was performed by UV spectrophotometry, gel electrophoresis and PCR. Results The concentration of genomic DNA extracted by potassium iodide method and Promega Genomic DNA Purification Kit method was： （330.9±0.94）ng/μL and （490.3±3.16）ng/μL； and the ratio of A260/A280 was： （1.87±0.03） and （1.85±0.06）.The quantity of genomic DNA extracted by kit is slightly higher than that by potassium iodide method. There is no significant difference in DNA quality and purity between two methods. Conclusion Kit is the more simple, faster, non-toxic method compared with the potassium iodide method, but the cost is expensive. Potassium iodide method is helpful to extract genomic DNA from a large number of clinical blood samples due to the low cost. Two methods are able to meet the needs of molecular biology experiments.

Genomic DNA; Potassium iodide method; Improved method; Peripheral blood

R446

B

1671-8194（2015）30-0016-02

E-mail：lxyan3699@163.com

*通訊作者：E-mail：rxiao163@163.com