堿性成纖維細(xì)胞及角蛋白對絲素蛋白膜改性的實(shí)驗(yàn)研究

刁小娟趙東旭李珺山陳幗玲

堿性成纖維細(xì)胞及角蛋白對絲素蛋白膜改性的實(shí)驗(yàn)研究

刁小娟1趙東旭1李珺山1陳幗玲2

目的 探討堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）及角蛋白對絲素蛋白膜改性后的生物相容性改變。方法 還原法制備水溶性人發(fā)角蛋白，用共混法使人發(fā)角蛋白與絲素蛋白形成共混膜；化學(xué)交聯(lián)法用bFGF對絲素膜進(jìn)行表面修飾形成交聯(lián)膜。通過MTT法及熒光顯微鏡觀察檢測3T3細(xì)胞在三種絲素基材料上的增殖情況。通過接觸角測定，對上述三種材料親水性進(jìn)行表征。不同的絲素基材料對細(xì)胞增殖的促進(jìn)情況以及接觸角的測定2組間SUVmax比較采用兩樣本t檢驗(yàn)。結(jié)果 制備的人發(fā)角蛋白分子量范圍在44-66 KDa之間，條帶清晰。MTT 法及顯微鏡觀察表明，含角蛋白40%共混膜對細(xì)胞生長的促進(jìn)作用最為明顯（0.718 ± 0.03，P ＜ 0.05），交聯(lián)膜次之（0.545 ± 0.022，P ＜ 0.05），最后是絲素膜（0.463 ± 0.027，P ＜ 0.01）。接觸角測定結(jié)果表明，共混膜的接觸角（17.5 ± 1.6，P ＜ 0.01）最小，交聯(lián)膜（47 ± 1.8，P ＜ 0.01）次之，絲素膜的接觸角（61 ± 1.5，P ＜ 0.05）最大，即共混膜黏附性最好。結(jié)論 制備的40%共混膜具有最強(qiáng)生物相容性，bFGF修飾的絲素蛋白交聯(lián)膜次之，最后是絲素膜。

成纖維細(xì)胞； 絲素蛋白； 生長因子； 角蛋白

絲素是經(jīng)蠶絲脫膠后而得的一種天然高分子材料，目前，鑒于絲素蛋白良好的生物相容性以及良好的透氧、透氣等許多獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)［1-2］，國內(nèi)外很多學(xué)者現(xiàn)致力于以絲素蛋白用作生物醫(yī)用材料方面的研究［3］。絲素蛋白的主要應(yīng)用包括用作手術(shù)縫合線、藥物緩釋載體［4］、固定化酶載體［5］、生物傳感器［6］、培育人造血管和抗凝血材料［7］、研制人造皮膚和功能性細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)等方面［8］。純絲素溶液制備的絲素膜水溶失率大、強(qiáng)度低［9］，為改善絲素膜的性能，近年來應(yīng)用化學(xué)接枝、化學(xué)交聯(lián)、共混等方法提高絲素材料柔韌性等性能方面開展了較深入研究［10-15］，如絲素和明膠、殼聚糖、海藻酸鈉、聚氨酯等的共混，絲素和PGDE的交聯(lián)等。由于堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fi broblast growth factor，bFGF）作為細(xì)胞分裂原，主要作用在起源于中胚層和神經(jīng)外胚層的骨骼肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和骨細(xì)胞等，其體外效應(yīng)十分強(qiáng)烈，對成纖維細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)和髓質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等具有很強(qiáng)的促細(xì)胞分裂增殖活性。高相對分子質(zhì)量的角蛋白具有很高的機(jī)械強(qiáng)度、優(yōu)良的可加工性、可降解性和良好的生物相容性，是生物移植等應(yīng)用領(lǐng)域極具潛力的新型生物醫(yī)學(xué)材料［16-17］。因此，本研究制備了以絲素蛋白膜為對照，以FGF修飾的絲素蛋白交聯(lián)膜和絲素蛋白-角蛋白共混膜，并通過MTT及熒光顯微鏡觀察的方法檢測上述三種絲素基材料對3T3細(xì)胞增殖的影響；通過傅立葉紅外光譜FT-IR和接觸角測定來表征材料的表面特征，以探索其對細(xì)胞黏附性變化和細(xì)胞增殖變化情況的相關(guān)性，進(jìn)而為組織工程中采用絲素改性的方法制備生物相容性的材料提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

材料與方法

一、主要材料與試劑

蠶繭，購于江西農(nóng)科院；鼠胚胎成纖維細(xì)胞（3T3），實(shí)驗(yàn)室留存。DMEM無血清培養(yǎng)基（Hyclone），優(yōu)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（杭州四季青），胰蛋白酶；0.01 g/ml乙二醇二縮水甘油醚（ethylene glycol diglycidyl ether，EGDE）溶液（含0.5%的甘油），1.0 mg/ml外用重組人bFGF（北京雙鸕藥業(yè)），8 mg/ml角蛋白溶液。

二、方法

1.絲素蛋白膜的制備［18］以及接種細(xì)胞前的滅菌處理：稱取5 g經(jīng)脫膠后的絲素蛋白，溶于100 ml CaCl2：H2O：C2H5OH（摩爾比1： 8 ： 2）三元溶劑中，80℃水浴鍋中攪拌溶解2 h。將溶解的絲素蛋白溶液裝入透析袋中（截留分子量14 000、干燥半徑28 mm），流動(dòng)水中透析48 h，然后蒸餾水中透析24 h。透析后的溶液用布氏漏斗過濾，收集濾液即為絲素蛋白溶液。用干燥法測定溶液的絲素蛋白含量，然后用蒸餾水調(diào)整濃度至8 mg/ml。向96孔板底部每孔加50 μl、6孔板每孔加800 μl，上述絲素蛋白溶液，搖動(dòng)使溶液在孔板里均勻鋪展，之后放于50℃烘箱中6 h烘干成膜。

2. bFGF修飾的絲素蛋白交聯(lián)膜的制備：取出上述鋪有絲素蛋白膜的孔板，然后每孔分別加入pH值9的0.01 g/ml的EGDE溶液（含0.5%甘油），96孔加50 μl、6孔加800 μl，對絲素膜表面進(jìn)行交聯(lián)，37℃搖床中反應(yīng)10 h，加入PBS清洗2 ～ 4遍。以下操作在超凈臺(tái)上進(jìn)行。將鋪膜孔板置于70%酒精缸中浸泡消毒30 min，之后用無菌水沖洗，紫外照射1 h消毒。然后加入濃度為1.0 mg/ml的bFGF溶液，使其與前述的交聯(lián)有EGDE的絲素膜反應(yīng)，37℃搖床中反應(yīng)10 h。到時(shí)間點(diǎn)之后，加入PBS清洗2 ～ 4遍。

3.絲素蛋白-角蛋白共混膜的制備：稱取3份400 mg的成人人發(fā)樣品，此人發(fā)樣品只經(jīng)過洗滌而未經(jīng)過其他處理，按照w（β-巰基乙醇）= 3%、w（SDS）= 2%、C（尿素）= 7 mol/L的還原溶液進(jìn)行角蛋白提取，控制反應(yīng)前溶脹時(shí)間2 h，反應(yīng)過程中反應(yīng)溫度45℃、反應(yīng)時(shí)間12 h。反應(yīng)完后，10 000 × g離心30 min，濾液倒入截留相對分子質(zhì)量為12-15 KDa的透析袋中，在w（巰基乙醇）= 0.08%的水溶液中透析36 h左右，離心后冷凍干燥得白色角蛋白粉末［19］。將得到的角蛋白粉末配制成8 mg/ml的角蛋白溶液，并與已制備的8 mg/ml的絲素蛋白溶液共混，制得一系列不同配比的蛋白混合液，使得角蛋白占總蛋白的濃度分別為0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，最后分別取50 μl（96孔）或800 μl（6孔）加入孔中，50℃烘箱中6 h干燥成膜。通過將鋪膜孔板置于70%酒精缸中浸泡消毒30 min，之后用無菌水沖洗，在超凈臺(tái)內(nèi)紫外照射1 h消毒，進(jìn)而對比不同共混比例的絲素-角蛋白材料對3T3細(xì)胞生長的影響。

4.接觸角測定：先用PBS對測試膜進(jìn)行清洗。采用JC2000A靜滴接觸角（界面）張力測定儀（上海中晨公司）對清洗后的膜樣品進(jìn)行靜態(tài)接觸角測量，每個(gè)樣品測3次，取平均值。

5. MTT法測定3T3細(xì)胞在三種絲素基材料上的黏附及增殖情況：成纖維細(xì)胞按照常規(guī)方法復(fù)蘇，接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)，待細(xì)胞生長至約80%融合度后，用0.25%的胰酶消化并用細(xì)胞計(jì)數(shù)板制成2 × 105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，作為接種細(xì)胞待用。

將細(xì)胞按照2 × 105個(gè)/ml的濃度接種于孔板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔加200 μl，3次重復(fù)，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加20 μl 5 mg/ml MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)上清，每孔加150 μl DMSO，搖床中振蕩10 min使其充分溶解，MTT甲簪沉淀，酶標(biāo)儀檢測490 nm處光密度值（A）。

熒光顯微鏡觀察3T3細(xì)胞在三種絲素基材料上的黏附及增殖情況。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，SUVmax數(shù)據(jù)以±s表示。不同的絲素基材料對細(xì)胞增殖的促進(jìn)情況以及接觸角的測定2組間SUVmax比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　果

1.角蛋白的SDS-PAGE電泳圖：圖1可見，制備的角蛋白主要分子量范圍為44 - 66 KDa，其中有兩條明顯的帶和一條很細(xì)的條帶，可能是因?yàn)樵谶€原法處理人發(fā)樣品時(shí)，有三種不同的肽單元結(jié)構(gòu)所造成。

圖1　角蛋白的SDS-PAGE電泳圖

圖2　不同角蛋白含量對3T3細(xì)胞生長的影響

2.絲素蛋白-角蛋白共混膜中不同角蛋白含量對3T3細(xì)胞生長的影響：通過圖2可知，在用角蛋白與絲素蛋白溶液形成的共混材料上培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，角蛋白占總蛋白的濃度在0%～ 40%，細(xì)胞的數(shù)量趨于增加，在40%時(shí)達(dá)到最大；在40%～ 100%時(shí)，細(xì)胞的數(shù)量有明顯降低的趨勢。由此可知，當(dāng)角蛋白占總蛋白含量40%時(shí)，能夠明顯促進(jìn)細(xì)胞數(shù)量的增加，細(xì)胞的數(shù)量增加近1倍。實(shí)驗(yàn)中所用的角蛋白取材于成人的頭發(fā)。

3.三種絲素膜材料表面接觸角的測定結(jié)果：共混膜的接觸角為（17.5 ± 1.6，P ＜ 0.01）最小，交聯(lián)膜的接觸角為（47 ± 1.8，P ＜ 0.01），絲素膜的接觸角為（61 ± 1.5，P ＜ 0.05），即共混膜黏附性最好。接觸角的測定結(jié)果表明隨著膜的改變，其接觸角變化非常大。經(jīng)bFGF修飾的絲素膜的接觸角明顯小于絲素膜的接觸角，表明bFGF修飾的絲素膜的親水性要比絲素膜好，而絲素蛋白-角蛋白共混膜的接觸角又比交聯(lián)膜的接觸角明顯降低，說明膜的親水性又顯著提高。

4.成纖維細(xì)胞在三種絲素基材料上的生長情況：圖3和圖4反映了3T3細(xì)胞在三種絲素基材料上的生長情況。其中，圖3表明，與絲素膜、經(jīng)bFGF修飾的絲素基膜相比，角蛋白-絲素蛋白共混膜對細(xì)胞數(shù)量的促進(jìn)作用最為明顯。通過MTT法檢測細(xì)胞在48 h后經(jīng)bFGF修飾的絲素蛋白膜、絲素蛋白-角蛋白共混膜與絲素蛋白膜上數(shù)量的對比情況，可計(jì)算其增長率分別為：17.64%和54.98%。經(jīng)過48 h后細(xì)胞的形狀及分布如圖4，從中可以看到細(xì)胞在絲素蛋白-角蛋白共混膜、bFGF修飾的絲素蛋白膜的數(shù)量都要比單純絲素膜上細(xì)胞數(shù)量要多。

圖3　三種不同的絲素基材料對3T3細(xì)胞增殖的影響

圖4　熒光顯微鏡觀察3T3細(xì)胞在三種絲素基材料上的黏附及增殖情況（×200）

討　論

制備的角蛋白有兩條明顯的條帶和一條很細(xì)的條帶可能與Parry等［20］發(fā)現(xiàn)有關(guān)，指出動(dòng)物毛發(fā)纖維的氨基酸重復(fù)單元中主要有兩種基本的五肽環(huán)模式的重復(fù)單元，即：重復(fù)單元A（C-CX-P-X）和B（C-C-X-S/T-S/T），這里C代表半胱氨酸（Cys），P代表脯氨酸（Pro），S代表絲氨酸（Ser），T代表蘇氨酸（Thr），X代表除這幾種之外的構(gòu)成蛋白質(zhì)的任何一種氨基酸。在第一種重復(fù)單元中，A中又衍生出兩種新的重復(fù)結(jié)構(gòu)單元C-C-Q-P-X（A1）和C-C-R-P-X（A2）。

bFGF修飾的絲素基膜親水性增加的變化可能是由于bFGF是重要的促有絲分裂因子，是細(xì)胞形態(tài)發(fā)生和分化的誘導(dǎo)因子有關(guān)，它促使靶細(xì)胞上的受體（FGFR）親和性升高，而出現(xiàn)相應(yīng)的親水性增加的現(xiàn)象［21］，進(jìn)而其修飾的絲素膜材料與單純絲素膜材料相比親水性有一定程度的增強(qiáng)。角蛋白是一類材料力學(xué)特性良好的生物可降解高分子，它與大分子所形成的復(fù)合材料具有比較優(yōu)異的生物相容性能，并且角蛋白纖維可用于制作人工腱等［22］，因此它自身對于共混材料的結(jié)構(gòu)變化起到一定的作用。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，角蛋白與絲素蛋白溶液共混鋪成的膜可以使膜的接觸角明顯降低，即膜的親水性極大地得到了提高。因此，通過接觸角測定表征、熒光顯微鏡觀察及MTT法細(xì)胞學(xué)測定，所制備的40%的共混膜具有強(qiáng)的親水性，其生物相容性優(yōu)于bFGF修飾的絲素蛋白交聯(lián)膜和純絲素膜。這為組織工程中采用絲素蛋白基生物醫(yī)用材料的制備提供了一定的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

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Characteristics of silk fibroin membrane modified by basic fibroblast growth factor andkeratin

Diao Xiaojuan1， Zhao Dongxu1， Li Junshan1， Chen Guoling2. 1Beijing Institute of Technology Life College， Beijing 100081， China；2MedStar Georgetown University Hospital，Washington DC， USA

Zhao Dongxu， Email： 20806044@bit.edu.cn

Objective The biocompatibility of silk-based membrane basis which was modified by basic fibroblast growth factor （bFGF） and keratin was evaluated. Methods The water-soluble keratin was made from hair keratin via reduction reaction and blended with silk fibroin. Basic fibroblast growth factor （bFGF） was crosslinked to the surface of silk fibroin membrance. The effects of different silk fibrin-based materials on 3T3 cell proliferation were evaluated using MTT method and cells were observed by fluorescence microscopy. The hydrophilic property was characterized through the measurement of contact angle of the silk based materials. SUVmax was compared using two sample t test. Results Molecular weight of prepared keratin ranged between 44-66 KDa， and the strips were clear. MTT and microscopic observations showed that blended membrane （0.718 ± 0.03， P ＜ 0.05） was most effective in promoting cell growth， followed by crosslinked membrane （0.545 ± 0.022， P ＜ 0.05）， and silk fibroin membrane （0.463 ± 0.027， P ＜ 0.01）. Blended membrane had the smallest contact angle（17.5 ± 1.6， P ＜ 0.01） followed by the crosslinked membrane （47.5 ± 1.8， P ＜ 0.01）， and the silk fibroin membrance （61 ± 1.5， P ＜ 0.05）， so the blend membranes has the minimum contactangle. Conclusion The blend membrane had the best biocompatibility， then the silk fibroin cross-linked by bFGF， finally was the silk fibroin membrane.

Fibroblasts； silk；growth factor； keratin

2014-12-17）

（本文編輯：蔡曉珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2015.04.005

973計(jì)劃課題（2005CB623906）

100081，北京理工大學(xué)生命學(xué)院1；美國MedStar Georgetown University Hospital2

趙東旭，Email：20806044@bit.edu.cn