臍帶間充質(zhì)干細胞移植對帕金森病的臨床療效觀察

趙堂亮吳正敏王萍譚建明

臍帶間充質(zhì)干細胞移植對帕金森病的臨床療效觀察

趙堂亮1吳正敏2王萍2譚建明2

目的 探討臍帶間充質(zhì)干細胞（UC-MSC）移植治療帕金森?。≒D）的臨床效果及安全性。方法 選擇福州總醫(yī)院干細胞治療科收治的20例經(jīng)鞘內(nèi)注射UC-MSC治療原發(fā)性PD患者為實驗組，本院神經(jīng)內(nèi)科收治的20例經(jīng)口服左旋多巴治療原發(fā)性PD患者為對照組。采用PD統(tǒng)一評分量表（UPDRS）對患者治療前及治療后1個月、3個月、6個月進行量化評分。采用兩獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計分析比較實驗組與對照組差異。結(jié)果 實驗組20例患者臨床癥狀緩解程度較對照組明顯，實驗組與對照組治療前UPDRS評分與治療后1個月、3個月、6個月的UPDRS評分的差值分別為［（11.45 ± 2.01）分，（6.25 ± 1.07）分，t = 26.12，P = 0.00］，［（16.1 ± 2.65）分，（7.6 ± 1.47）分，t = 23.19，P = 0.00］，［（20.45 ± 3.28）分，（8.45 ± 1.85）分，t = 20.44，P = 0.00］，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 鞘內(nèi)注射UC-MSC治療PD的臨床療效優(yōu)于單純口服左旋多巴片治療PD。

帕金森病； 臍帶； 間質(zhì)干細胞； 干細胞移植

帕金森病（Parkinson's disease，PD）為常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，主要病理改變?yōu)槟X黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡，導(dǎo)致紋狀體多巴胺含量顯著減少而致?。?］，臨床表現(xiàn)主要包括靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢步態(tài)障礙，同時患者可伴有抑郁、便秘和睡眠障礙等非運動癥狀，嚴重影響患者的生命健康及生活質(zhì)量。傳統(tǒng)的藥物及手術(shù)治療均無法逆轉(zhuǎn)神經(jīng)變性，無法增加多巴胺能神經(jīng)細胞的數(shù)目。近年來，隨著干細胞技術(shù)的發(fā)展，臍帶間充質(zhì)干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cell， UC-MSC）的多向分化潛能逐漸應(yīng)用于PD的臨床治療中。目前國內(nèi)有報道運用骨髓間充質(zhì)干細胞、UC-MSC經(jīng)頸動脈穿刺移植治療PD，但考慮到血腦屏障可能對治療效果產(chǎn)生影響，我科開展采用UC-MSC經(jīng)鞘內(nèi)注射治療20例PD患者的研究，觀察其臨床療效和安全性。

研究分實驗組與對照組，以治療前以及治療后1個月、3個月、6個月PD統(tǒng)一評分量表（unified Parkinson disease rating scale，UPDRS）量化評分作為主要指標來評價鞘內(nèi)注射UC-MSC對PD的臨床療效。

資料與方法

一、病例選擇

實驗組入組標準：本院干細胞治療科收治的20例原發(fā)性PD患者，采用鞘內(nèi)注射UC-MSC治療PD。對照組入組標準：本院神經(jīng)內(nèi)科收治的20例原發(fā)性PD患者，采用口服左旋多巴片治療PD。實驗組與對照組中患者均為PD Hoehn-Yahr分級為3-5級者，并排除合并惡性腫瘤，全身感染、局部嚴重感染、結(jié)核感染，心、肺、肝、腎等重要臟器的功能障礙者等，對治療及試驗方案知情同意，并且通過醫(yī)院倫理委員會批準。

二、方法

1.UC-MSC制備：用于治療PD的UC-MSC均由福建省移植生物重點實驗室自行制備。產(chǎn)婦知情同意，通過倫理委員會批準，獲取足月妊娠的產(chǎn)婦臍帶。分離UC-MSC：分離并去除臍帶外膜和血管組織，取臍帶基質(zhì)，將其剪碎，加入質(zhì)量分數(shù)為0.1%膠原酶Ⅳ消化過夜。離心后，取下層沉淀再用0.25%胰蛋白酶37℃消化1 h，過100目篩網(wǎng)，收集含細胞的濾液，離心后計數(shù)，接種于低糖DMEM無血清培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。移植前所用臍帶干細胞均經(jīng)過檢測：細胞呈紡錘狀，病原學(xué)檢查陰性（包括細菌和真菌等），具有典型的間充質(zhì)干細胞的免疫表型，內(nèi)毒素試驗陰性［2］。

2.準備工作：實驗組、對照組患者在實驗前一直規(guī)律服用左旋多巴片治療PD 1年以上，病情穩(wěn)定。實驗組在實驗中運用UC-MSC鞘內(nèi)注射，每周1次，共治療4次；對照組在實驗中繼續(xù)規(guī)律服用左旋多巴片，無其他特殊治療。實驗后隨訪階段兩組患者均繼續(xù)規(guī)律服用左旋多巴片治療PD。

3.實驗組患者行UC-MSC鞘內(nèi)注射：選擇第3、4腰椎間隙為穿刺點，行常規(guī)消毒鋪巾后，用2%利多卡因行局部麻醉，然后用穿刺針垂直穿刺入蛛網(wǎng)膜下腔，注射器回抽見腦脊液，測量顱內(nèi)壓，收集5 ml腦脊液行實驗室檢查，再取準備好的UC-MSC注射液5 ml［干細胞數(shù)：體重（kg）× 106個］，于6 ～ 8 min內(nèi)緩慢注入蛛網(wǎng)膜下腔，干細胞鞘內(nèi)注射完畢后，緩慢鞘內(nèi)注射5 mg地塞米松。然后拔出穿刺針，行局部皮膚消毒，無菌敷料敷蓋創(chuàng)面，平臥觀察10 min，患者無任何不適后，去枕平臥6 h。在干細胞移植治療的同時，給予心電監(jiān)護、擴張血管、營養(yǎng)神經(jīng)及對癥等綜合治療。

三、評估標準

實驗組和對照組分別于治療前和治療后1個月、3個月、6個月，采用統(tǒng)一PD評分量表（UPDRS），主要從精神、行為和情緒，日常生活活動，運動檢查，并發(fā)癥4個方面進行評價。分值越高表示神經(jīng)功能缺損越嚴重。

四、統(tǒng)計學(xué)分析方法

運用SAS統(tǒng)計軟件，患者年齡、體重、病史以及兩組患者治療前與治療后1個月、3個月、6個月UPDRS評分計量資料以±s表示，并采用兩獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計分析比較實驗組與對照組差異，兩組患者男女比例，伴隨疾病情況計數(shù)資料用c2檢驗，以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1　實驗組、對照組患者基本情況

表2　兩組患者治療前后UPDRS總分對比（分，x

結(jié)　果

一、患者基本情況（表1）

二、療效評估

實驗組治療前UPDRS評分為（85.45 ± 4.41）分，治療后1個月、3個月、6個月UPDRS評分分別為（74.00 ± 4.32）分、（69.35 ± 3.94）分、（65.00 ± 3.74）分；對照組治療前UPDRS評分為（86.80 ± 3.76）分，治療后1個月、3個月、6個月UPDRS評分分別為（80.35 ± 3.50）分、（79.00 ± 2.99）分、（78.15 ± 3.91）分，兩組治療后1個月、3個月、6個月UPDRS評分均下降，但實驗組下降程度較對照組明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05，表2）；對實驗組及對照組治療前與治療后1個月、3個月、6個月UPDRS評分差值（d）的差異進行統(tǒng)計分析，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05，表3）。對精神、行為和情緒方面進行療效評估，實驗組及對照組經(jīng)治療后UPDRS評分均下降，治療后1個月、3個月、6個月，對照組UPDRS評分均下降程度大于實驗組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05，表4）。對日常生活活動，運動檢查2個方面進行療效評估，經(jīng)治療后1個月、3個月、6個月，實驗組及對照組UPDRS評分均下降，實驗組的臨床療效明顯優(yōu)于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05，表5）。對并發(fā)癥方面進行療效評估，治療后1個月、3個月，實驗組UPDRS評分均下降程度大于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05，表6），在治療后6個月，實驗組UPDRS評分下降程度大于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05，表6）。

表3　實驗組與對照組治療前、后UPDRS評分差值（d）比較（分，±s）

表3　實驗組與對照組治療前、后UPDRS評分差值（d）比較（分，±s）

注：d1：治療前UPDRS評分與治療后1個月UPDRS評分的差值；d2：治療前UPDRS評分與治療后3個月UPDRS評分的差值；d3：治療前UPDRS評分與治療后6個月UPDRS評分的差值

組別例數(shù)d1d2d3實驗組2011.45 ± 2.0116.10 ± 2.65 20.45 ± 3.28對照組20 6.25 ± 1.07 7.60 ± 1.47　8.45 ± 1.85 t 值26.1223.1920.44 P 值　0.00　0.00　0.00

三、安全性分析

經(jīng)鞘內(nèi)注射UC-MSC后，患者出現(xiàn)乏力癥狀4例、低熱（體溫37.1℃）1例、頭痛1例、腰痛2例，給予對癥處理后可完全緩解（表7）。

表4　兩組患者治療前后精神、行為和情緒的UPDRS評分對比（分，±s）

表4　兩組患者治療前后精神、行為和情緒的UPDRS評分對比（分，±s）

組別例數(shù)治療前治療后1個月治療后3個月治療后6個月實驗組207.75 ± 0.976.45 ± 1.005.90 ± 0.794.90 ± 0.64對照組207.75 ± 0.976.00 ± 0.795.65 ± 0.755.30 ± 0.80 t值01.581.03-1.74 P值10.120.310.09

表5　兩組患者治療前后日常生活活動和運動檢查的UPDRS評分對比（分，±s）

表5　兩組患者治療前后日常生活活動和運動檢查的UPDRS評分對比（分，±s）

日常生活活動運動檢查治療前治療后治療前治療后1個月3個月6個月1個月3個月6個月實驗組2027.65 ± 1.50 23.45 ± 1.96 21.40 ± 1.73 20.25 ± 1.37 36.80 ± 2.42 32.60 ± 2.4430.80 ± 2.44 28.75 ± 2.30對照組2028.20 ± 2.17 26.30 ± 1.63 25.90 ± 1.52 25.50 ± 1.82 37.65 ± 1.95 35.80 ± 1.7935.25 ± 1.80 35.05 ± 1.96 t值-0.93-5.01-8.75-10.30-1.22-4.73 P值　0.36　0.00　0.00　0.000.230.000.000.00組別例數(shù)

表6　兩組患者治療前后并發(fā)癥的UPDRS評分對比（分，±s）

表6　兩組患者治療前后并發(fā)癥的UPDRS評分對比（分，±s）

組別例數(shù)治療前治療后1個月治療后3個月治療后6個月實驗組2013.25 ± 2.1511.50 ± 1.7011.25 ± 1.5211.10 ± 1.65對照組2013.00 ± 1.4912.25 ± 1.3712.20 ± 1.7712.30 ± 1.98 t值0.43-1.53-1.83-2.08 P值0.67　0.13　0.08　0.04

表7　實驗組患者并發(fā)癥發(fā)生情況分析

討　論

UC-MSC是指存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細胞，它能分化成許多種組織細胞，在一定條件下可誘導(dǎo)分化為破骨樣細胞、心肌樣細胞和神經(jīng)元樣細胞［3］，并有報道通過全反式維甲酸誘導(dǎo)可使臍血多能干細胞分化成為有功能的多巴胺能神經(jīng)元，這種誘導(dǎo)后產(chǎn)生的臍血多能干細胞來源的神經(jīng)元表達酪氨酸羥化酶及多巴胺轉(zhuǎn)運體等多巴胺神經(jīng)元特異性分子標志物，為干細胞誘導(dǎo)產(chǎn)生多巴胺能神經(jīng)元治療PD提供新的途徑［4］，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。因為UC-MSC具備多向分化潛能和自我更新能力，可在一定的條件下分化為神經(jīng)細胞，近些年，UC-MSC移植作為治療PD的最前沿方法，其療效備受矚目。

UC-MSC治療的優(yōu)勢：（1）倫理問題不突出，來源廣泛，易采集，易擴增；（2）具有更強的增殖能力，比骨髓間充質(zhì)干細胞快數(shù)倍；（3）是一種更原始的間充質(zhì)干細胞群。

經(jīng)過本實驗的研究觀察，可得出結(jié)果：鞘內(nèi)注射臍帶間充質(zhì)干細胞治療帕金森病的臨床療效優(yōu)于單純口服左旋多巴片治療帕金森病。在精神、行為和情緒方面治療后1個月、3個月、6個月以及并發(fā)癥發(fā)面治療后1個月、3個月，兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其原因不明，需進一步研究其作用機制；在日常生活活動，運動檢查方面經(jīng)治療后1個月、3個月、6個月以及并發(fā)癥發(fā)面治療6個月后，實驗組臨床療效明顯優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其作用機制可能為：（1）自我更新和定向分化為多巴胺能神經(jīng)元，UC-MSC移植后能夠定向遷移到病變部位，表達替代缺損的神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細胞，使其發(fā)揮正常的細胞功能，從而緩解PD的病癥；（2）臍血干細胞進入腦部后，可以誘導(dǎo)分化并且替代受損細胞恢復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)的功能和傳導(dǎo)通路，為腦內(nèi)營造一個良好的局部微環(huán)境［5］；（3）分泌多種生物活性因子，具有神經(jīng)營養(yǎng)、抗細胞凋亡、促進血管再生、免疫調(diào)控和抗炎作用等［6］；（4）調(diào)節(jié)細胞代謝，一項最近的研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞可調(diào)控細胞 ATP、NAD+/NADH比率，降低高濃度谷氨酸對線粒體膜損傷，從而調(diào)節(jié)細胞能量代謝，減少神經(jīng)細胞變性［7］。

本次研究的不足：（1）樣本量小，為了得到更安全可靠的臨床療效，還應(yīng)進行大樣本和長期的術(shù)后隨訪；（2）未采取盲法，實驗組患者對鞘內(nèi)注射UC-MSC知情同意，易產(chǎn)生偏移。

與傳統(tǒng)的治療方法相比，UC-MSC治療PD是一種新型且有效的治療方法，具有廣闊的前景，為PD的治療提供了新的希望。

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Efficacy and safety of umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation on the treatment of Parkinson’s disease

Zhao Tangliang1， Wu Zhengmin2， Wang Ping2， Tan Jianming2.1Department of Urology，F(xiàn)uzhou general hospital of the Second Military Medical University，F(xiàn)u zhou，350025，China；2Department of Stem cell therapy，F(xiàn)uzhou general hospital，F(xiàn)uzhou，350025，China

Tan Jianming， Email：tanjm156@xmu.edu.cn

Objective To evaluate the efficacyand safety of umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation on the treatment of Parkinson's disease. Methods Twenty patients with Parkinson's disease were treated with umbilical cord mesenchymal stem cells through the intrathecal injection； 20 cases with Parkinson's disease treated with levodopa served as control. Patients were evaluated by unified Parkinson disease rating scale at baseline， 1 month， 3 months， and 6 months after the treatment. t-test was used to analyze the difference. Results The experimental group had have greater improvement than the control group at 1 month，3 months，6 months， The difference values（d） of the scores before the treatment and 1 month，3 monthes，6 monthes after the treatment of experimental group and control group are respectively（11.45 ± 2.01， 6.25 ± 1.07， t = 26.12， P = 0.00），（16.1 ± 2.65， 7.6 ± 1.47， t = 23.19， P = 0.00）， （20.45 ± 3.28， 8.45 ± 1.85， t = 20.44， P = 0.00），the difference was statistically significant（P ＜ 0.05）.Conclusions Umbilical cord mesenchymal stem cell through the intrathecal injection was more effective than levodopa in treating Parkinson's disease.

Parkinson Disease； umbilical cord； mesenchymal stem cell； stem cell transplantation

2015-09-26）

（本文編輯：陳媛媛）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2015.04.007

350025福州，第二軍醫(yī)大學(xué)福州總醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)院泌尿外科1；350025福州，南京軍區(qū)福州總醫(yī)院干細胞治療科2

譚建明，Email：tanjm156@xmu.edu.cn