食品中真菌毒素快速檢測方法

北京維德維康生物技術(shù)有限公司（以下簡稱“維德維康”）是一家專注于食品中有害化合物（農(nóng)獸藥、微生物、重金屬、非法添加物等）殘留快速檢測技術(shù)、動物疫病快速診斷技術(shù)研究及相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)的中關(guān)村高新技術(shù)企業(yè)、國家高新技術(shù)企業(yè)、國家火炬計劃重點(diǎn)高新技術(shù)企業(yè)和北京市專利示范單位。維德維康作為中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、國家獸藥安全評價中心的產(chǎn)業(yè)化基地，與中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、國家食品安全風(fēng)險評估中心等權(quán)威機(jī)構(gòu)共建合作平臺，結(jié)合自身雄厚的科研力量，形成了一系列具有自主知識產(chǎn)權(quán)的關(guān)鍵技術(shù)、重點(diǎn)產(chǎn)品和創(chuàng)新工藝，擁有食品安全檢測抗原抗體資源近千種，供應(yīng)檢測試劑及設(shè)備千余種。

真菌毒素的危害

真菌毒素是由產(chǎn)毒真菌在適宜環(huán)境條件下產(chǎn)生有毒代謝的產(chǎn)物，廣泛存在于糧油食品和飼料中，是自然發(fā)生的最危險的食品污染物之一。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織估算，全球每年約有25%的農(nóng)產(chǎn)品受到真菌毒素的污染，每年糧食及食品損失達(dá)到10億噸。在我國，真菌毒素的污染狀況同樣不容樂觀。根據(jù)國家糧食局不完全統(tǒng)計，每年真菌毒素污染造成的糧食損失累計約3100萬噸，占糧食總產(chǎn)量的6.2%，相當(dāng)于陜西、甘肅、青海、寧夏、西藏5個?。ㄗ灾螀^(qū)）全年糧食產(chǎn)量的總和。而糧油產(chǎn)品真菌毒素污染導(dǎo)致的應(yīng)急搶救和醫(yī)療、善后撫恤、畜禽因病死亡、病畜銷毀處理等間接損失更大?？梢哉f，我國農(nóng)產(chǎn)品中真菌毒素污染嚴(yán)重，已成為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要限制因素之一，嚴(yán)重威脅著人類與動物的健康。

現(xiàn)已查明自然界存在的真菌毒素有200多種，按真菌毒素的重要性及危害依次排列為：黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、單端孢霉烯族毒素、玉米赤霉烯酮。真菌毒素具有兩種毒性，一是致DNA損傷，嚴(yán)重者可致癌；二是細(xì)胞毒性，有破壞質(zhì)膜和細(xì)胞酶的作用。

對整個食品產(chǎn)業(yè)鏈而言，真菌毒素是一種“看不見的威脅”，能引起急、慢性中毒，損害肝臟、腎臟、神經(jīng)組織、造血組織等，嚴(yán)重的可導(dǎo)致死亡。真菌毒素中的黃曲霉毒素和鐮刀菌素被聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）列為自然發(fā)生的最危險的食品污染物，具有強(qiáng)毒性和致癌性。黃曲霉毒素更被列為I級致癌物，是惡性腫瘤的主要誘因之一；鐮刀菌素中，以T-2毒素的毒性最強(qiáng)。

殘留限量

目前，世界上有100多個國家或地區(qū)已經(jīng)制定了食品和飼料中真菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)與法規(guī)，近幾年歐盟等發(fā)達(dá)國家和地區(qū)逐漸提高了真菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)。我國各級政府十分重視真菌毒素的防控工作，農(nóng)業(yè)部、科技部相繼立項(xiàng)相關(guān)研究和污染調(diào)查，并分別在2005年和2011年發(fā)布和修訂了真菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)，在一定程度上減少了真菌毒素對人類健康的危害。幾種常見霉菌毒素的殘留限量如表1。

主要檢測方法

食品中真菌毒素含量的檢測方法一直是制約真菌毒素與人類疾病研究進(jìn)展的關(guān)鍵，現(xiàn)有的真菌毒素典型檢測方法包括：高效液相色譜法、薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法、液質(zhì)聯(lián)用法等。隨著科技的進(jìn)步，也衍生出了其他各種檢測方法，如光化學(xué)衍生-高壓液相色譜法、電化學(xué)衍生-高壓液相色譜法、熒光光度法、液相色譜-三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法等。這些方法所用到的設(shè)備價格昂貴，樣品要經(jīng)過復(fù)雜的前處理，要求技術(shù)人員有較強(qiáng)的操作能力和分析能力；另外儀器的耗材和維護(hù)費(fèi)用都很高，導(dǎo)致每個樣品的檢測成本一般在200元以上，且儀器方法需對樣本進(jìn)行依次檢測，而平均每個樣本的檢測時間均在兩個小時以上，甚至需要1天的時間。新方法雖然具有靈敏、精確的優(yōu)點(diǎn)，但普遍存在著成本昂貴、操作繁瑣、人員要求高、耗費(fèi)時長等問題，限制了其推廣和應(yīng)用，不利于常規(guī)檢測，目前主要作為檢測的參考依據(jù)使用。因此，建立準(zhǔn)確、高效、快速檢測真菌毒素的方法是目前亟待解決的關(guān)鍵問題。

免疫化學(xué)分析方法，是利用抗原和抗體的特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)建立起來的特異性高、靈敏度高、成本低、對操作人員要求低的一類快速分析方法，其對環(huán)境和儀器要求低，樣品檢測通量高、速度快，因此適合大量樣品的快速篩查和現(xiàn)場檢測。常見的免疫化學(xué)分析方法可以分為酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、免疫層析試紙條（immunochromatographic strip，ICA，也稱Lateral-flow colloidal gold-based immunoassay，俗稱膠體金試紙條）、免疫親和柱（Immunoaffinity chromatography，IAC）、化學(xué)發(fā)光免疫分析（chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay， CL-ELISA）以及時間分辨熒光免疫分析（timed-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）等。其中最常用、最成熟、應(yīng)用最廣的主要是ELISA和膠體金試紙條。ELISA 除了肉眼定性判斷和半定量判斷結(jié)果，還可通過酶標(biāo)儀測定吸光值進(jìn)行定量分析；膠體金試紙條只需將試紙條插入待測液體，即可在幾分鐘內(nèi)讀取結(jié)果，是最適合現(xiàn)場檢測的免疫分析方法。

維德維康真菌毒素檢測解決方案

以黃曲霉毒素M1為例介紹維德維康食品中真菌毒素解決方案：

黃曲霉毒素M1酶聯(lián)免疫試劑盒

將抗原固定到酶標(biāo)板上，并保持其免疫活性?？贵w與酶連接成酶標(biāo)抗體，這種酶標(biāo)抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。測定時，把受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體按不同的步驟與酶標(biāo)板表面的抗原反應(yīng)。用洗滌的方法使酶標(biāo)板上形成的抗原-抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在酶標(biāo)板上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺來判斷樣品中黃曲霉毒素M1的含量。含量少，顯色深；含量多，則顯色淺。

設(shè)備：酶標(biāo)儀（檢測波長450nm，參考波長630nm）；漩渦振蕩器；微量移液器；計時器；離心機(jī)（4000g）。

檢測步驟：

a.將樣品用去離子水稀釋；

b.將標(biāo)準(zhǔn)品工作液加入對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品板孔中；

c.在樣品孔中依次加入樣品和酶標(biāo)記物工作液；

d.蓋好蓋板膜，輕輕振蕩，室溫下避光反應(yīng)；

e.倒掉板孔中液體，在每孔加入洗滌工作液，充分洗滌4次；

f.倒掉板孔中液體，將酶標(biāo)板倒置于