腫瘤壞死因子相關凋亡配體轉染骨髓干細胞后對U251膠質瘤細胞的體外靶向抗瘤作用

李偉，王道奎，王增武，宋仁興

腫瘤壞死因子相關凋亡配體轉染骨髓干細胞后對U251膠質瘤細胞的體外靶向抗瘤作用

李偉1，王道奎2，王增武2，宋仁興2

（1.濰坊醫(yī)學院山東濰坊261053；2.山東省濰坊市人民醫(yī)院神經外科，山東濰坊261041）

目的探究腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL）體外轉染骨髓干細胞（BMSCs）后對U251腦膠質瘤細胞生長及凋亡的作用。方法利用Transwells小室研究骨髓干細胞的腫瘤遷徙性。將攜帶TRAIL的質粒體外轉染人骨髓干細胞，采用PCR及Western blot檢測轉染后BMSCs中目的基因的表達強度。將轉染的BMSCs與U251細胞體外共培養(yǎng)，采用流式細胞儀檢測轉染后的BMSCs誘導U251細胞的凋亡情況。結果BMSCs具備向腫瘤細胞的遷徙性。轉染后的骨髓干細胞表達、分泌TRAIL，且干細胞凋亡情況無變化。將轉染后的BMSCs與U251細胞共同培養(yǎng)，可明顯提高U251細胞的凋亡率，BMSCs TRAIL+U251組U251細胞凋亡率明顯高于對照組（P＜0.05）。結論在體外實驗中，利用BMSCs腫瘤遷徙的特異性，將BMSCs作為基因載體，可提高TRAIL對U251膠質瘤細胞的靶向抑癌作用。

腫瘤壞死因子相關凋亡配體；U251膠質瘤細胞；基因治療

腦膠質瘤為顱內最常見的惡性腫瘤，死亡率居顱內腫瘤的首位，呈浸潤侵襲性生長，術后極易復發(fā)，5年生存率不到20%。TNF相關的凋亡誘導配體（tumornecrosisfactor-relatedapoptosis-inducing ligand，TRAIL）屬于TNFSF中的成員之一，可與膜受體結合誘導細胞發(fā)生凋亡，且對正常的組織和細胞無毒性作用［1］。

骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells，BMSCs）具有很強的分化能力，在合適的條件下可以分化成骨、軟骨、脂肪組織等多種組織細胞［2-4］。BMSCs的這一特點及其靶向遷徙的能力［5］使它在基因治療中具有了獨特的價值。BMSCs可作為理想的分子載體，通過外源治療基因TRAIL修飾后的BMSCs可以向受損組織趨化及發(fā)揮修復作用。由此可知，BMSCs經過腫瘤殺傷基因修飾后有可能攜帶治療性物質靶向殺傷腫瘤細胞。本實驗將TRAIL的選擇性殺傷細胞作用與BMSCs的腫瘤細胞遷徙性相結合，探究TRAIL轉染骨髓干細胞后靶向治療腦膠質瘤的潛在價值。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1細胞和主要試劑人骨髓間充質干細胞購于美國Millipore公司，U251膠質瘤細胞株購自南京凱基生物公司，血清和DMEM培養(yǎng)基均購于美國Millipore公司，RT-PCR（Reverse Transcription-Polym erase Chain Reaction，逆轉錄-聚合酶鏈反應）試劑盒，美國BIO-RAD公司，Trizol試劑，Invitrogen公司，質粒提取盒，天根生化科技有限公司，轉染試劑（Trans IT-2020），Invitrogen公司，流式試劑，美國BD公司，一抗、二抗，英國Abcam公司，質粒由加拿大UBC大學實驗室提供。

1.1.2細胞培養(yǎng)與傳代取出BMSC（U251）冷凍保存細胞于37℃水浴鍋中迅速復蘇，將細胞液移于離心管中離心、收集細胞，再加入含10%胎牛血清（fatal bovine serum，F(xiàn)BS）的完全培養(yǎng)基，充分吹打懸浮細胞，移于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%二氧化碳孵育箱培養(yǎng)，待細胞長到80%～90%時，用0.25%胰酶消化、收集細胞，進行傳代培養(yǎng)。

1.2實驗方法

1.2.1BMSCs向腫瘤細胞遷徙的體外實驗利用8μm孔徑的Transwells小室進行BMSCs遷徙實驗。將1×105個/ml BMSCs置于上室，U251膠質瘤細胞置于下室，然后置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中24 h，取下濾膜，用PBS沖洗2遍，并用細胞鏟刮除黏附的細胞，甲醛固定30 min，風干后用0.1%結晶紫染色30 min，隨機選取5個視野在顯微鏡下觀察、計數(shù)。

1.2.2質粒的擴增與提取質粒屬于綠色熒光蛋白的分泌型TRAIL真核表達質粒，內含有目的基因TRAIL以及抗AMP（ampicillin，氨芐青霉素）片段，置于-20℃保存?zhèn)溆谩Ｈ≠|粒與感受態(tài)細胞（由實驗室提供）冰上解凍，將兩者混勻后于42℃水浴90 s，加入LB培養(yǎng)基（Luria-Bertani培養(yǎng)基），搖床振蕩復蘇細胞；在選擇性培養(yǎng)板（AMP）上涂板，過夜培養(yǎng)。挑取單菌落加入含AMP的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，待LB變渾，采用高純度質粒小提中量試劑盒（tiangen）進行提取，具體參照試劑盒說明書，提取的質粒置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3質粒轉染BMSC細胞待細胞達80%左右時進行轉染，轉染前細胞用無雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。將含TRAIL的質粒溶于Opti-MEM培養(yǎng)基中混勻，另取轉染試劑Trans IT-2020溶于Opti-MEM培養(yǎng)基混勻，將兩溶液吹打混勻后立即加入細胞中，并邊加邊搖，置于37℃、5%二氧化碳孵育箱中培養(yǎng)，6 h后換成完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24～48 h后于顯微鏡下觀察。

1.2.4質粒轉染的BMSCs中目的基因的表達應用PCR檢測TRAIL基因的表達情況，培養(yǎng)24 h后收集各組BMSC細胞，用PBS（phosphate belanced solution，磷酸緩沖液）沖洗3次，加入Trizol裂解細胞，嚴格按照說明書提取總RNA（ribonucleic acid，核糖核酸）。引物序列通過Olig 6軟件設計，由寶生物公司合成。擴增TRAIL基因編碼序列的引物：正向5'-TGACTGTGGCTGTGACTTA-3'；反向5'-ACTCCCAG GTTTCTATCTT-3'。β-actin的正向5'-GTGGGGCG CCCCAGGCACCA-3'；反向5'-CTCCTTAATGTCACG CACGATTTC-3'。PCR擴增條件：共30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃30 s，55℃30 s，72℃60 s。同時擴增管家基因β-actin作為對照驗證。每孔加5μl樣品，并在一側加入5μl的2 000 Marker，進行瓊脂糖凝膠電泳，20 min后獲取圖片，并對數(shù)據(jù)進行分析。

應用Western blot法檢測相關蛋白的表達水平，β-actin作為內參。培養(yǎng)48 h后收集各組細胞蛋白產物，取50μl樣本與5×SDS-PAGE緩沖液混合，電泳后經轉膜儀將樣本轉移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，經漂洗、封閉、一抗（抗TRAIL）孵育、二抗孵育，檢測結果并通過Image J2X軟件掃描圖像及定量分析。

1.2.5流式細胞儀檢測U251細胞的凋亡率各實驗組細胞處理48 h后，收集培養(yǎng)基到新的離心管中，加PBS沖洗3次，將沖洗液吸取到相應離心管中（避免丟失懸浮的凋亡細胞影響實驗結果）。用0.25%胰酶消化、收集細胞到相應的離心管，1 000 r/min，離心5 min。用預冷的PBS沖洗3次，然后用1×bind buffer將細胞配成（1-5）×104/ml的細胞懸液，取100μl加入新的EP管中，每管加5μl Annexin V-FITC和5μl PI（propidium iodide），暗環(huán)境培養(yǎng)15 min后加入400μl 1×bind buffer，立即用流式細胞儀檢測，1 h內完成，并分析實驗結果（實驗需設置3組質控樣本）。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，用配對資料t檢驗，各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，轉染后的BMSCs細胞對U251細胞的增抑制率及凋亡率比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1BMSCs向U251細胞的遷徙能力

應用Transwell法驗證BMSCs向腫瘤細胞的遷徙能力，BMSCs與U251細胞共培養(yǎng)48 h后，隨機選取5個視野在顯微鏡下觀察、計數(shù)，可見U251細胞培養(yǎng)液可刺激更多的BMSCs發(fā)生遷徙，與生理鹽水及培養(yǎng)基比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（見圖1）。熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，BMSCs主要聚集于U251細胞周圍，而在無U251細胞的培養(yǎng)基周圍僅散在少量BMSCs（見圖2）。由此可證明，BMSCs向腫瘤細胞遷徙的特異性。

圖1　BMSCs向腫瘤細胞的遷徙能力

圖2　熒光顯微鏡下觀察，BMSCs透過Transwell小室向腫瘤細胞的遷徙能力（×200）

2.2RT-PCR及Western blot檢測目的基因表達

通過PR-PCR擴增，將擴增的目的基因分別加樣進行瓊脂糖電泳，經20 min后觀察結果并成像（見圖3）。結果顯示條帶隨培養(yǎng)時間的延長依次由淡變亮，表明TRAIL在BMSCs內成功表達。應用Western blot法檢測轉染組與未轉染組目的基因的表達情況，可見轉染組的TRAIL表達與PCR結果有相同效果，隨著培養(yǎng)時間的延長表達量相繼增加，βactin在不同細胞的表達量無差異。見圖4。

圖3　RT-PCR檢測轉染后TRAIL基因的表達情況

圖4　應用Western blot法檢測轉染后TRAIL的表達情況

2.3流式細胞儀檢測U251細胞的凋亡率

采用Annexin V/PI雙染色法進行檢測各組U251細胞的凋亡情況并記錄數(shù)據(jù)，U251細胞的凋亡率取右下象限（見圖5），即Annexin V-FITC（+）/PI（-），由表1可見轉染組誘導U251細胞的凋亡率與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而未轉染組與空白組比較差異不明顯（P＞0.05）。TRAIL對 BMSCs的凋亡作用見圖6。由表2可見轉染的TRAIL對BMSCs無明顯毒性作用（P＞0.05）。

圖5　流式細胞儀檢測共同培養(yǎng)48 h后U251細胞的凋亡率

圖6　流式細胞儀檢測TRAIL對BMSCs的促凋亡作用

表1　流式細胞儀檢測共同培養(yǎng)48 h后U251細胞的凋亡率（%，n=3±s）

表1　流式細胞儀檢測共同培養(yǎng)48 h后U251細胞的凋亡率（%，n=3±s）

注：1）與BMSCs+U251組比較，P＜0.05；2）與空白對照組比較，P＞0.05

項目BMSCsTRAIL+U251BMSCs+U251空白對照組凋亡率2.98 000±0.15 3951）0.81 330±0.50 0832）0.39 670±0.29 569

表2　流式細胞儀檢測轉染48 h后BMSCs的凋亡率（%，n=3±s）

表2　流式細胞儀檢測轉染48 h后BMSCs的凋亡率（%，n=3±s）

項目BMSCs TRAILBMSCs對照組P值凋亡率0.68 000±0.15 3950.67 670±0.29 5690.340

3 討論

人腦膠質瘤是神經外科最常見惡性腫瘤，發(fā)病迅速，致死率高［6-7］，目前針對腦膠質瘤的治療有放療、化療、手術治療，但治愈率很低，術后極易復發(fā)［8］，5年生存率也不足20%。因此，對腦膠質瘤是治愈要探索新的治療手段，眾所周知，細胞的分化受到基因的嚴密調節(jié)，能否選擇一種方法在腫瘤細胞的生長分化過程中殺傷腫瘤細胞呢？許多專家已經證實腫瘤壞死因子和抑癌基因在調控細胞生長分化中至關重要［9］，所以，基因治療腦膠質瘤可能成為根治膠質瘤的有效方法。

TRAIL是腫瘤壞死因子家族的最新成員，可與腫瘤細胞膜上的DR5結合，再通過一系列級聯(lián)反應組成DR5-FADD-Caspase 8（DISC）死亡誘導信號復合體，激活Caspase 8，誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡［10］，而對正常細胞無影響［11］。另外，也有相關文獻證明TRAIL聯(lián)合放化療可顯著增強腫瘤細胞對放化療的敏感性，增加耐藥性腫瘤的凋亡，因此，TRAIL日益受到人們的重視，但是TRAIL在腫瘤治療中的應用較為局限，原因有：①TRAIL在血漿內的半衰期極短，大約小于1 h［12］；②具備生物活性的TRAIL必須以三聚體的形式存在，故難以透過血腦屏障發(fā)揮作用；③應用腺病毒基因療法體外能誘導數(shù)種人腫瘤細胞凋亡，但體內有引起宿主抗病毒免疫反應的可能。BMSCs的腫瘤遷徙性已在許多文獻中被證實，可能是腫瘤細胞分泌相關性因子，從而誘導BMSCs發(fā)生遷徙，BMSCs的這一特性為靶向殺傷腫瘤細胞提供了理想的載體。BMSCs可以向腫瘤組織趨化，定位于其間質中增殖、分化［13］，所以將目的基因轉染入骨髓干細胞，通過骨髓干細胞將治療基因帶入腫瘤組織，由于治療基因的存在及分泌殺傷物質從而達到腫瘤的抑制作用。本實驗主要是探究TRAIL基因作為目的基因轉染骨髓干細胞后對U251膠質瘤細胞的體外靶向抗瘤作用。

實驗構建TRAIL的表達載體轉染骨髓干細胞，轉染成功后，通過PCR及Western blot檢測轉染后TRAIL的表達，由圖3、4可知轉染后的TRAIL基因在BMSCs中表達，且TRAIL的表達量隨時間延長而增加。選擇第3天的轉染組與U251膠質瘤細胞共培養(yǎng)，并利用流式細胞儀檢測U251細胞的凋亡率，發(fā)現(xiàn)實驗組U251細胞的凋亡率明顯增加，BMSCs作為基因載體誘導腫瘤細胞凋亡，自身卻不發(fā)生凋亡。由此推斷，BMSCs作為有效的基因載體，不僅克服TRAIL基因在血漿中半衰期短的難題，而且TRAIL修飾后的BMSCs具備靶向抗瘤的作用，這為惡性膠質瘤的治療提供了新的途徑。

綜上所述，在體外實驗中利用BMSCs腫瘤遷徙的特異性，將BMSCs作為基因載體，可提高TRAIL對U251膠質瘤細胞的靶向抑癌作用。但U251細胞僅屬于腦膠質瘤細胞的一個細胞系，不能反映所有顱腦腫瘤的特性，對其他類型的腦瘤細胞仍需進一步的研究證實。

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（張西倩編輯）

In vitrotargeted antitumor effects of bone marrow stem cells transfected by tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand against U251 glioma cells

Wei LI1，Dao-kui WANG2，Zeng-wu WANG2，Ren-xing SONG2
（1.Weifang Medical University，Weifang，Shandong 261053，P.R.China；2.Department of Neurosurgery，Weifang People's Hospital，Weifang，Shandong 261041，P.R.China）

Abstrct：【Objective】To study the targeted antitumor effects of bone marrow stem cells（BMSCs）transfected by tumor necrosis factor-related apoptosis--inducing ligand（TRAIL）against gliomain vitro.【Methods】The migration capacity of BMSCs toward glioma was investigated using Transwells inserts.Thein vitroexpression of target gene in transfected BMSCs was detected by PCR and Western blot.The apoptosis of U251 cells was analyzed by flow cytometry after the co-culture with the transfected BMSCs.【Results】First，BMSCs had the capacity of mobilizing toward tumor cells.Second，although the BMSCs expressed and secreted TRAIL，their apoptosis was unchanged.Third，the apoptosis rate of U251 cells increased significantly after the co-culture with the transfected BMSCs（P＜0.05）.【Conclusions】Using BMSCs as gene vectors，the targeted antitumor effects of TRAIL against U251 glioma cells can be increased by the specific mobility of BMSCs towards tumorin vitro.

TRAIL；U251 cell；gene therapy；BMSC

R739.41

A

1005-8982（2015）36-0026-05

2015-06-29