高效液相色譜法測定葡萄酒中莧菜紅的不確定度評定

馬 康，李小佳，崔萌萌，馬聯(lián)弟

（1.中國計量科學研究院，北京　100029；2.北京科技大學化學與生物工程學院，北京　100083；3.北京化工大學化學理學院，北京　100029）

高效液相色譜法測定葡萄酒中莧菜紅的不確定度評定

馬 康1，李小佳2，崔萌萌3，馬聯(lián)弟1

（1.中國計量科學研究院，北京100029；2.北京科技大學化學與生物工程學院，北京100083；3.北京化工大學化學理學院，北京100029）

通過對高效液相色譜法測定葡萄酒中合成色素莧菜紅質量濃度的全過程分析，確定了測定結果不確定度的來源。采用計量學不確定度傳遞模型，對引入的不確定度分量進行評定，確定了葡萄酒中莧菜紅質量濃度標準不確定度由標準物質、標準溶液配制、標準曲線擬合、樣品制備、測量重復性和回收率等6部分不確定度合成得到。2個不同質量濃度樣品測定結果不確定度被評定，其相對擴展不確定度分別為2.6％和2.2％（k=2），由不確定度評價結果分析得到，樣品重復性測定和標準溶液配制是測定結果不確定度的主要來源。

計量學；莧菜紅；葡萄酒；高效液相色譜；不確定度

1　前 言

葡萄酒是由新鮮葡萄或葡萄汁經發(fā)酵而成的飲料，富含有機酸、糖類、黃酮類、酚類和原花青素等功能成分，適量飲用能預防多種疾病［1，2］。隨著我國人民生活水平的提高，葡萄酒的消費量呈現了快速增長的趨勢。為了保障葡萄酒的飲用安全，相關國家標準對葡萄酒中允許添加的食品添加劑種類和濃度作了明確規(guī)定，其中規(guī)定不允許添加合成著色劑［3～5］，但一些不法生產者向葡萄酒中添加合成著色劑（莧菜紅、胭脂紅、檸檬黃、日落黃、亮藍）的情況卻時有發(fā)生。其中莧菜紅是非法添加頻率較高的合成著色劑［6］。為了保證葡萄酒的產品質量，防止假冒偽劣產品以次充好和保護大眾健康，需要對葡萄酒中莧菜紅等著色劑進行測量，為了保證測量結果的準確、可靠和可信，需要對測量結果的不確定度進行評價。

不確定度是與測量結果相關聯(lián)的參數，表征合理地賦予被測量的分散性［7］。它是考察一種測量方法能力優(yōu)劣的指征，是對檢測數據進行客觀真實的表述。近年來檢驗分析工作對測量結果的不確定度評定工作越來越重視，不確定度評價結果的可信性、可比性和可接受性的主要指標，同時各實驗室及時總結與評定分析結果的不確定度，對實驗室分析數據的匯總整合具有科學的評價意義［8，9］。本文針對高效液相色譜法測量其他著色劑組分可依此方法進行類似計算。

2　實驗部分

2.1儀器與試劑

UFLC-20A液相色譜儀-二極管陣列檢測器（UFLC-PDA，日本島津公司）。莧菜紅溶液標準物質（中國計量科學研究院）；甲醇（色譜純）、乙酸銨（優(yōu)級純）、檸檬酸（優(yōu)級純）購自百靈威公司；氨水和聚酰胺粉購自北京化學試劑公司。

2.2試驗條件

色譜柱：ODS-C18，4.6 mm×250 mm×5 μm（日本GL Science公司）；柱溫：35℃；流量：1.0mL/ min；進樣量：20 μL。

流動相：流動相A為甲醇；流動相B為0.10 mol/L乙酸銨水溶液。

梯度程序：0～6 min，90％A；6～12 min，（90％ ～55％）A；12～13 min，（55％～90％）A；13～15 min，90％A。

檢測器：二極管陣列波長190～700nm，莧菜紅波長521nm。

2.3分析流程

準確稱取葡萄酒5.0 g，檸檬酸水溶液補足約20mL，60℃聚酰胺粉吸附約1 h，然后用pH=4的檸檬酸水溶液、60∶40的甲醇-甲酸溶液、純凈水各洗3次，最后用乙醇-氨水-水溶液（7∶2∶1）洗脫目的物，旋蒸近干，純水定容25mL，經0.45 μm的濾膜。葡萄酒中莧菜紅組分測試流程見圖1。

圖1　葡萄酒樣品中莧菜紅組分液相色譜測試流程

2.4測定結果的數學模型

本文研究的基質為葡萄酒，采用高效液相色譜法測量葡萄酒中4種著色劑組分的質量濃度，計算式為

式中，X為樣品中著色劑的質量濃度，mg/L；C為由標準曲線所得樣液中著色劑的質量濃度，mg/L；V為樣品最終定容體積，mL；m為最終定容體積所代表的樣品量，g；R為方法的回收率，％。

3　測定不確定度來源

莧菜紅組分質量濃度測量結果的不確定度由二部分組成：第一部分是通過測量數據的標準偏差、測量次數及所要求的置信水平按統(tǒng)計方法直接求得（A類不確定度）；第二部分是通過對測量影響參數和影響函數的分析，估計出其大小，同時考慮樣品不均勻性和有效期內的變動性等其它因素所引起的不確定度（B類不確定度）。對式（1）做全微分并除以X，則得

因此，不確定度的來源因素包括：標準物質、工作標準溶液配制、最小二乘法擬合標準曲線、回收率、樣品制備（天平、容量和溫度），分析過程引入的不確定度通過加標回收率估計，見圖2。

圖2　葡萄酒中莧菜紅測定不確定度的來源

4　結果與討論

4.1不確定度分量評定

4.1.1標準物質引入的不確定度

莧菜紅溶液標準物質GBW（E）100 002 a，特性量值500 μg/mL，相對擴展不確定度1％（k=2），則標準物質的不確定度為

4.1.2工作標準溶液配制引入的不確定度

工作標準溶液至少需要配制5個質量濃度，用上述的莧菜紅溶液標準物質進行逐級得到，質量濃度分別為5 μg/mL、10 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL 和100 μg/mL的工作標準溶液。稀釋過程的數學模型為

其引入的不確定度的計算式為

式中，Ci為稀釋得到莧菜紅工作標準溶液質量濃度，μg/mL；C0為莧菜紅溶液標準物質質量濃度，μg/mL；V0為移取標準溶液的體積，mL；Vi為莧菜紅工作標準溶液定容體積，mL。

以50 μg/mL的工作標準溶液為例說明。移取體積V0引入的不確定度主要由移液器的重復性、校準規(guī)范［12］中的最大允差和移取溶液的溫度差引入的。采用1mL 3次水充滿移液器，用0.1mg的天平連續(xù)稱量6次（1.0001g；1.0015g；1.0010g；0.9997 g；1.0008 g；0.9995 g），稱量結果的6次測量的標準偏差為移液器的重復性0.00079mL；根據JJG646—2006中1mL移液器的最大允差為0.008mL，取三角分布，此項引入的不確定度為0.008/=0.0033mL；工作標準溶液配制溫度與校準時溫度不同，結合實驗室的溫度設置要求，溫差不超過4℃，水體積膨脹系數為0.000 21 L/℃，溫度引入體積變化為0.00021×0.001×4×1 000mL=0.000 84mL，假定溫度變化為矩形分布，則標準不確定度為0.000 84mL/=0.00049mL。

容量瓶定容體積Vi不確定度來源：（1）容量瓶校準對體積影響；（2）溫度對體積影響；（3）容量瓶至刻度線重復性對體積影響。合格的10mL容量瓶（A級）最大允差為±0.02mL［13］。假定為三角形分布，由容量瓶校準對體積影響引入的標準不確定度為0.02mL/=0.008 2mL；實驗溫控在20℃±5℃，又水膨脹系數0.00021L/℃，因此產生的體積變化為±（10×5×0.000 21）mL=±0.011mL，假定溫度變化為矩形分布，則由溫度對體積影響引入的標準不確定度為0.011mL/=0.006 4mL；通過多次充滿10mL容量瓶至刻度并稱量的實驗，得出由充滿容量瓶至刻度線重復性對體積影響引入的標準偏差為0.02mL。

4.1.3擬合標準曲線引入的不確定度

為了校準液相色譜儀，配制莧菜紅系列標準工作溶液進行HPLC-DAD測定，以建立莧菜紅組分校正曲線，經線性回歸得到各自的線性方程，見表1。表中，A為峰面積；X為樣品的質量濃度；R為線性相關系數；s為標準溶液峰面積殘差的標準偏差；Sxx為標準溶液質量濃度的殘差的平方和；Sa斜率標準偏差；Sb為截距標準偏差。

配制系列標準溶液涉及移取1mL、2mL和10mL的容量瓶的莧菜紅溶液標準物質，用三次蒸餾水分別定容至10mL中，分別得到5mg/L、10mg/L、20mg/L、50 mg/L和100mg/L的工作標準溶液。計算5個工作標準溶液的引入的總不確定度為

表1　莧菜紅組分的標準系列線性方程

葡萄酒的某個待測樣品定容溶液進行了3次測定，由直線方程求得平均濃度，則X的標準不確定度為

由上述所得各參數，待測樣品在標準曲線范圍內，計算2個不同質量濃度樣品在標準曲線引入的相對標準不確定度具體見表1，分別為0.24％和0.13％。

4.1.4樣品制備過程引入的不確定度

樣品制備的不確定度來源：（1）天平稱量引入的不確定度；（2）樣品定容體積引入的不確定度。

天平稱量不確定度來源包括：天平稱量最大允許誤差；天平稱量變動性；浮力影響。葡萄酒樣品稱量使用0.01 mg分度的分析天平，天平的變動性、檢定誤差等估計為0.05 mg，天平稱量變動性及浮力影響（在常規(guī)狀態(tài)下稱重，此項可忽略）。純品稱重約5g，按矩形分布相對不確定度=（Δm/m）/= （0.05 mg/5 000 mg）/=0.002 9％。

定容體積不確定度來源包括：容量瓶校準對體積影響；溫度對體積影響；容量瓶至刻度線重復性對體積影響。溶液配制定容體積為50mL，檢定合格的50mL容量瓶最大允差為±0.02mL［13，14］。假定為三角形分布，此項標準不確定度為0.02mL/=0.008 2mL；本方法根據加入的3次水質量計算溶液體積，所以需要考慮溫度對3次水體積的影響而引入的不確定度。實驗溫度控制在（25±5）℃，純水膨脹系數為0.000 21 L/℃，因此產生的體積變化為（0.05 L×±5×0.000 21 L）× 1 000=±0.053mL，假定溫度變化為矩形分布，則標準不確定度為0.053mL/=0.031mL；通過多次充滿50mL容量瓶至刻度并稱量的實驗，得出標準偏差為0.02mL。綜上所述，定容體積引入的相對合成不確定度為0.080％。

4.1.5樣品測量重復性引入的不確定度

在不確定度評定過程中，A類不確定度主要體現為樣品的測量重復性，對樣品進行7次重復試驗，用相對標準偏差來表示樣品測量重復性引入的不確定度。葡萄酒中莧菜紅質量濃度測定結果見表2。

4.1.6回收率引入的不確定度

前處理過程對樣品回收率的影響所產生的不確定度，具體表現為7次測量樣品回收率平均值的標準偏差S（ρRec）［15］，基體加標回收試驗中樣品溶液各組分濃度均低于方法的報出限，其標準不確定度為

當t值大于或等于雙邊臨界值t（95％，6）=2.45時，則與1有顯著性差異，說明fR需要被使用以修正結果；若t值小于t（95％，6），則fR不需要使用。葡萄酒樣品中莧菜紅組分顯著性差異結果見表2。根據t值得到莧菜紅組分均無顯著性差異，不需要修正測試結果。

表2　葡萄酒中莧菜紅質量濃度與回收率測定結果

4.2合成標準不確定度

葡萄酒中莧菜紅測量結果的不確定度來源很多，除了上述提及的不確定度分量，還有溫度效應、玻璃膨脹系數等因素。由于這些分量引入的不確定度相對較小，本文中忽略不計。

根據上述分量，計算得到合成標準不確定度為

相對擴展不確定度為

兩個樣品質量濃度的相對擴展不確定度分別為2.6％和2.2％（k=2）。其中樣品重復性測定和標準溶液配制是測定結果不確定度的重要來源。

5　結論

通過對葡萄酒樣品中莧菜紅組分測定過程的分析，測定結果的不確定度主要來源于標準物質、標準溶液配制、標準曲線擬合、樣品制備、測量重復性和回收率6部分。本文對葡萄酒樣品中莧菜紅組分測定過程各步驟引入不確定度的采集和表述，可為胭脂紅、山梨酸、安賽蜜等其它食品添加劑測量結果擴展不確定度計算提供借鑒。

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［3］國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB 15037—2006，葡萄酒標準［S］.

［4］中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 2760—2011，食品添加劑使用標準［S］.

［5］中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 2758—2012，發(fā)酵酒及其配制酒衛(wèi)生標準［S］.

［6］謝婭黎，陳欣欣，馮勇，等.市售紅葡萄酒中甜味劑以及人工合成色素使用情況分析［J］.現代食品科技，2009，35（12）：1482.

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［11］ISO Guide35 2006Reference Materials-general and Statistical Principles for Certification［S］.

［12］國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.JJG 646—2006，移液器檢定規(guī)程［S］.

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Uncertainty Evaluation for the Determination of Amaranthus Red in Wine Samples by High Performance Liquid Chromatography

MA Kang1，LI Xiao-Jia2，CUI Meng-meng3，MA Lian-di1
（1.National Institute of Metrology，Beijing 100029，China；2.School of Chemistry and Biological，Beijing University of Science and Technology，Beijing 100083，China；3.College of Chemistry，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China）

Sources of measurement for amaranthus red in wine samples by high performance liquid chromatography are determined through studying the whole process of analytical results.The uncertainties of analytical result are evaluated by a metrological model of uncertainty.The standard uncertainty for analytical results for amaranthus red in wine samples is mainly consisted of uncertainty of solution reference material of amaranthus red，preparation of work standard solution，calibration curve using the least squares method，preparation for real wine sample，measured repeatability，method recovery and so on.Relative expanded uncertainties for two real wine sample with different content are evaluated and they are 2.6％ and 2.2％（k=2）.Evaluation of analytical results of two samples with different content indicated that main resource of uncertainty are measured repeatability and calibration curve.

Metrology；Amaranthus red；Wine；HPLC；Uncertainty

TB99

A

1000-1158（2015）01-0102-05

10.3969/j.issn.1000-1158.2015.01.22

2013-05-04；

2014-10-28

科技部公益性行業(yè)科研專項（2012104001）；科技基礎性工作專項（2008FY130200）；中國計量科學研究院基礎科研業(yè)務費（21-AKY1216）

馬康（1973-），男，陜西寶雞人，中國計量科學研究院副研究員，研究方向為食品添加劑的檢測。makang@nim.ac.cn