熱應(yīng)激下腫瘤細(xì)胞促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型轉(zhuǎn)化及其反饋?zhàn)饔?/h1>
2015-10-25 03:53:04張會(huì)祿湯曉寅馬思聰
介入放射學(xué)雜志 2015年11期
黃 帥， 張會(huì)祿， 王 濤， 王 智， 湯曉寅， 馬思聰， 翟 博
·實(shí)驗(yàn)研究Experimental research·
熱應(yīng)激下腫瘤細(xì)胞促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型轉(zhuǎn)化及其反饋?zhàn)饔?/p>
黃帥，張會(huì)祿，王濤，王智，湯曉寅，馬思聰，翟博
目的通過模擬不同熱應(yīng)激溫度，探討不同熱應(yīng)激條件下腫瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞之間的相互作用。方法收集射頻消融（RFA）前后的人肝癌樣本，比較兩者巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度。體外實(shí)驗(yàn)中將小鼠肝癌細(xì)胞分別以37℃、55℃、70℃水浴加熱，收取腫瘤細(xì)胞上清液以培養(yǎng)巨噬細(xì)胞；實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法檢測(cè)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、精氨酸酶（Arg）-1表達(dá)，MSD方法檢測(cè)白細(xì)胞介素（IL）-10、IL-12分泌量并鏡下觀察不同條件下巨噬細(xì)胞形態(tài)變化及極性轉(zhuǎn)變特征；收取不同條件刺激的巨噬細(xì)胞上清液以培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，觀察腫瘤細(xì)胞增殖情況。結(jié)果RFA后人肝癌組織巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增多。正常體溫下腫瘤細(xì)胞早期接觸即可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞激活并向M1型極性轉(zhuǎn)變，iNOS表達(dá)上調(diào)，IL-12分泌增多，而熱應(yīng)激后腫瘤細(xì)胞易導(dǎo)致巨噬細(xì)胞向M2型極性轉(zhuǎn)變，Arg-1表達(dá)上調(diào)，IL-10分泌增多。熱應(yīng)激后巨噬細(xì)胞上清液可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。結(jié)論腫瘤細(xì)胞熱應(yīng)激導(dǎo)致巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)變，進(jìn)而可潛在促進(jìn)腫瘤發(fā)展。
熱應(yīng)激；腫瘤；巨噬細(xì)胞；M2型；白細(xì)胞介素-10
以射頻消融（RFA）和微波消融（MWA）為代表的熱消融治療因具有創(chuàng)傷輕微、恢復(fù)快捷、有效性堪比外科切除及患者生活質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn)，已成為肝癌等實(shí)體腫瘤治療的重要方法之一［1-3］。在目前腫瘤臨床與基礎(chǔ)研究中，單純熱消融或與其它療法聯(lián)用均顯示出很好的應(yīng)用前景。然而有研究發(fā)現(xiàn)，消融后仍有一定比例患者腫瘤組織壞死不完全，且殘留組織似有生長(zhǎng)加速之勢(shì)，由此推測(cè)熱消融帶來的熱應(yīng)激反應(yīng)可能負(fù)面影響腫瘤微環(huán)境，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞表型和進(jìn)展［4-5］。腫瘤微環(huán)境指腫瘤細(xì)胞本身、組織液、免疫和炎性細(xì)胞、各類細(xì)胞因子及浸潤(rùn)細(xì)胞等共同構(gòu)成的局部環(huán)境，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要作用。
現(xiàn)有熱應(yīng)激治療腫瘤的機(jī)制研究一般分為熱刺激對(duì)腫瘤的直接作用和間接作用［6］，間接作用即熱刺激與腫瘤微環(huán)境之間的關(guān)系。既往研究發(fā)現(xiàn)，RFA后腫瘤組織中自然殺傷（NK）細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞（DC）均有不同程度浸潤(rùn)，甚至未消融腫瘤組織也會(huì)出現(xiàn)變化［7-8］，活化的DC疫苗則被認(rèn)為與RFA效果聯(lián)系更緊密［9-10］。上述研究提示，以RFA為代表的熱消融聯(lián)合生物免疫治療可能是腫瘤治療的未來重要方向。
巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中最具可塑性的細(xì)胞，在不同條件下發(fā)揮完全不同的作用［11］。盡管研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞也參與了熱消融后腫瘤組織中的免疫效應(yīng)，但具體作用并無定論［8］。Ahmed等［12］討論了熱應(yīng)激對(duì)腫瘤微環(huán)境的直接作用和間接作用，認(rèn)為熱應(yīng)激在一定情況下可能使得腫瘤微環(huán)境更易促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，但僅局限在溫度較低（40～50℃）的腫瘤邊緣區(qū)域，而對(duì)溫度較高（50～100℃）的腫瘤中心區(qū)域的微環(huán)境改變則未深入研究。本研究旨在通過體外模擬熱應(yīng)激環(huán)境，探討不同溫度應(yīng)激狀態(tài)下腫瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞間的作用過程，進(jìn)一步明確巨噬細(xì)胞在腫瘤經(jīng)歷熱應(yīng)激時(shí)的變化特征以及與腫瘤細(xì)胞可能存在的潛在交互作用，以期為臨床治療提供有意義的指導(dǎo)。
1 材料與方法
1.1材料
體外實(shí)驗(yàn)材料包括小鼠肝癌Hep1-6細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心）、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗及5%胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司）、人肝癌樣本（仁濟(jì)醫(yī)院肝外科提供）、肝癌患者血清樣本（仁濟(jì)醫(yī)院腫瘤介入科提供）、免疫組化試劑盒（北京中杉金橋公司）、TRIzol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物（上海生工生物工程公司）、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK）-8（美國(guó)Sigma公司）、PCR試劑（美國(guó)Invitrogen公司）和小鼠抗人 CD68抗體（英國(guó)Abcam公司）。
患者選擇標(biāo)準(zhǔn)：接受過RFA術(shù)；消融術(shù)后30 d左右復(fù)查提示消融灶殘留同時(shí)伴有肝內(nèi)其它部位復(fù)發(fā)而改行肝癌切除術(shù)（消融灶殘留組織及新生腫瘤一并切除）。
RFA灶標(biāo)本：收集符合上述條件的10例患者RFA灶（含殘留腫瘤組織）標(biāo)本及切除的肝癌標(biāo)本，另收集30例肝癌患者RFA前1 d、RFA后 1 d和3 d血清樣本。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
小鼠肝癌細(xì)胞系Hep1-6、小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7均用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，均置于37℃恒溫、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
人肝癌樣本用4%多聚甲醛固定24 h后，給予常規(guī)脫水，透明浸蠟和包埋。石蠟切片，厚約4 μm；使用CD68抗體，每組標(biāo)本取5片進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，觀察人體肝癌組織中巨噬細(xì)胞分布變化。具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。
熱應(yīng)激試驗(yàn)：傳6×106個(gè)Hep1-6細(xì)胞入10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，共6盤；12 h貼壁后換8 ml RPMI1640培養(yǎng)基，采用石蠟封口膜將10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿邊緣密封，分別置入37℃、55℃、70℃水浴鍋內(nèi)，每個(gè)溫度點(diǎn)處理2盤細(xì)胞；20 min后取出，吸取培養(yǎng)基入10 ml離心管內(nèi)行離心3 min（900轉(zhuǎn)/min），以防止有腫瘤細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中。離心后將培養(yǎng)基（以下統(tǒng)稱為腫瘤細(xì)胞上清液）吸入新管。
巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)：傳6×106個(gè)巨噬細(xì)胞入10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，共6盤；在上述37℃、55℃、70℃處理過的腫瘤細(xì)胞上清液恢復(fù)到37℃后，使用上清液給巨噬細(xì)胞RAW264.7換液（為排除血清被高溫破壞，在上清液中加入30%完全RPMI1640培養(yǎng)基），細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h；觀察細(xì)胞形態(tài)變化；將不同條件腫瘤細(xì)胞上清液互換，觀察細(xì)胞形態(tài)是否也對(duì)應(yīng)變化；TRIzol試劑裂解巨噬細(xì)胞，3種腫瘤細(xì)胞上清液處理的細(xì)胞各裂解1盤；余下RAW264.7細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基再次換液——普通胎牛血清白細(xì)胞介素（IL）含量很低，為盡量排除血清影響、更準(zhǔn)確檢測(cè)培養(yǎng)基IL含量，本次換液使用含2%血清的RPMI1640培養(yǎng)基，其后再次用于培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)補(bǔ)充至10%，24 h后收取培養(yǎng)基（以下統(tǒng)稱為巨噬細(xì)胞上清液），收取方法同上。
實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)：TRIzol試劑提取巨噬細(xì)胞總RNA，核酸分析儀檢測(cè)RNA量和純度，所用RNA的A260/A280均為1.8～2.0。Moloney鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶將2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以實(shí)時(shí)PCR行擴(kuò)增反應(yīng)。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）引物序列為F：CTGCAGCACTTGGATCAGGAACCTG，RGGAGTAGCCTGTGTGCACCTGGAA；精氨酸酶（Arg）-1引物序列為F：CAGAAGAATGGAAGAGTCAG，R：CAGATATGCAGGGAGTCACC；3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）引物序列為F：TCAACGGCACAGTCAAGG，R：ACTCCACGACATACTCAGC。擴(kuò)增條件如下：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共36個(gè)循環(huán)，然后再72℃延伸10 min。每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)副孔。由于目的基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率一致，統(tǒng)計(jì)分析實(shí)時(shí)PCR結(jié)果采用2-△△Ct法，△△Ct=對(duì)照組△Ct（目的基因Ct-管家基因Ct）-各組△Ct（目的基因-管家基因Ct）。
應(yīng)用Meso Scale Discovery（MSD）技術(shù)檢測(cè)30例肝癌患者射頻消融前后血清IL-10水平。
細(xì)胞體外增殖檢測(cè)：96孔板每孔傳入5 000個(gè)Hep1-6細(xì)胞，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱24 h，細(xì)胞貼壁后將培養(yǎng)基換為不同條件的巨噬細(xì)胞上清液，每24 h使用CCK-8試劑檢測(cè)一次細(xì)胞增殖狀況。CCK-8檢測(cè)方法：將CCK-8以10%比例加入正常培養(yǎng)基，混勻，每孔加入100 μl混合液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min；使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處光密度（OD），OD值越高，代表細(xì)胞數(shù)量越大。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1RFA明顯激活肝癌組織中巨噬細(xì)胞
手術(shù)切除的肝癌標(biāo)本和RFA后殘留肝癌組織標(biāo)本經(jīng)CD68染色，肉眼觀察顯示肝癌組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)較少，而RFA后殘留肝癌組織內(nèi)部則募集了大量巨噬細(xì)胞。400倍鏡下觀察中單個(gè)視野計(jì)數(shù)同樣可見肝癌組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)明顯較少（7.6± 4.0），射頻后殘留肝癌組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)較多（27.0±9.7），兩者差異明顯（P＜0.001）（圖1）。
2.2不同程度熱應(yīng)激后腫瘤細(xì)胞上清液導(dǎo)致巨噬細(xì)胞形態(tài)發(fā)生不同變化
加入37℃所得腫瘤細(xì)胞上清液后，巨噬細(xì)胞偏大，形態(tài)呈多角狀；加入70℃所得上清液后巨噬細(xì)胞則呈極細(xì)長(zhǎng)梭狀；加入55℃所得上清液后巨噬細(xì)胞形態(tài)同樣出現(xiàn)類似變化，但不如70℃明顯。將所用37℃和70℃腫瘤上清液互換，12 h后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)同樣也發(fā)生了不同程度的互換（圖2）。
圖1 人肝癌組織CD68免疫組化染色及巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)
圖2 腫瘤細(xì)胞上清液刺激巨噬細(xì)胞
2.3熱應(yīng)激后腫瘤細(xì)胞通過旁分泌途徑使巨噬細(xì)胞呈M2型轉(zhuǎn)變
37℃腫瘤細(xì)胞上清液刺激后巨噬細(xì)胞iNOS表達(dá)明顯升高（P＜0.001），Arg-1表達(dá)較低；70℃腫瘤上清液刺激后巨噬細(xì)胞iNOS表達(dá)則較低，Arg-1表達(dá)升高（P＜0.01）。檢測(cè)巨噬細(xì)胞上清液IL-10、IL-12顯示，37℃腫瘤上清液刺激后巨噬細(xì)胞分泌的IL-12明顯升高（P＜0.01），70℃腫瘤上清液刺激后巨噬細(xì)胞則表現(xiàn)為IL-10明顯升高（P＜0.05）（圖3）。
2.4RFA后短時(shí)間內(nèi)血清IL-10水平升高
MSD技術(shù)檢測(cè)肝癌患者RFA術(shù)前1 d、術(shù)后1 d、術(shù)后3 d血清樣本中IL-10含量顯示，RFA后1 d血清IL-10水平（0.849±0.367）與RFA后3 d IL-10水平（0.737±0.262）均高于RFA前（0.434±0.196），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。
2.5M2型轉(zhuǎn)變的巨噬細(xì)胞通過旁分泌促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖
不同熱刺激下收取巨噬細(xì)胞上清液，分別培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞0 h、24 h、48 h、72 h后作CCK-8檢測(cè)。在72 h時(shí)，可見對(duì)照組（1.243±0.027）與70℃巨噬細(xì)胞上清液組（1.768±0.083）腫瘤細(xì)胞增殖存在差異（P＜0.05）（圖5）。
圖3 不同形態(tài)巨噬細(xì)胞偏向極性不同
圖4 肝癌患者RFA前后血清IL-10含量變化
圖5 加入不同狀態(tài)巨噬細(xì)胞上清液后0 h、24 h、48 h、72 h時(shí)CCK-8檢測(cè)Hep1-6細(xì)胞增殖情況
3 討論
巨噬細(xì)胞具有極強(qiáng)可塑性及功能多樣性。巨噬細(xì)胞早期接觸腫瘤細(xì)胞時(shí)表現(xiàn)為經(jīng)典的巨噬細(xì)胞活化（M1型），具有抗腫瘤、促炎作用，而與腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)期接觸后則會(huì)向M2型轉(zhuǎn)變［13］，成為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM），低表達(dá)IL-12、高表達(dá)IL-10表現(xiàn)為腫瘤殺傷能力顯著降低，有助于腫瘤發(fā)生發(fā)展［6］。Guiducci等［14］研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞M1、M2狀態(tài)在不同條件下可以相互轉(zhuǎn)換，巨噬細(xì)胞M2狀態(tài)與腫瘤患者預(yù)后顯著相關(guān)［15］。如果臨床上能促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2狀態(tài)向M1狀態(tài)轉(zhuǎn)化，或抑制其反向轉(zhuǎn)化，將極可能有助于提高腫瘤治療效果。
本研究發(fā)現(xiàn)，接受不同程度熱應(yīng)激后腫瘤細(xì)胞上清液將導(dǎo)致巨噬細(xì)胞發(fā)生不同形態(tài)變化，表明不同腫瘤細(xì)胞上清液中可能存在不同的某種或某些分子，造成巨噬細(xì)胞M1、M2狀態(tài)互換。Mantovani等［16］研究認(rèn)為，一定應(yīng)激條件下腫瘤會(huì)分泌IL-10、集落刺激因子（CSF）-1及其它化學(xué)因子（如CCL2、CCL18、CCL17、CXCL4）等作用于周圍細(xì)胞。同時(shí)，Biswas等［17］認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞在一定情況下可引起IL-10升高，刺激巨噬細(xì)胞呈M2表型，而M2型巨噬細(xì)胞則會(huì)分泌更多IL-10，從而形成正反饋。從本研究結(jié)果看，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中熱應(yīng)激刺激巨噬細(xì)胞分泌IL-10，RFA后肝癌患者血清中IL-10含量也顯著高于RFA前，由此推斷RFA后巨噬細(xì)胞可能更傾向于以M2型方式存在。
不僅如此，本研究通過檢測(cè)巨噬細(xì)胞極性標(biāo)志分子iNOS和Arg-1表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)，37℃時(shí)腫瘤上清液刺激的巨噬細(xì)胞偏向M1型方向，說明巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞接觸早期更易于向M1狀態(tài)轉(zhuǎn)變（iNOS表達(dá)明顯升高，Arg-1表達(dá)較低，巨噬細(xì)胞分泌到上清液的IL-12明顯升高），這與之前報(bào)道是一致的［18］；而70℃條件下腫瘤上清液刺激的巨噬細(xì)胞則呈M2型（iNOS表達(dá)較低，Arg-1表達(dá)升高，巨噬細(xì)胞分泌的IL-10顯著升高），這表明熱應(yīng)激后腫瘤細(xì)胞可能通過旁分泌途徑使巨噬細(xì)胞呈M2樣轉(zhuǎn)變。由此提示，RFA治療中應(yīng)當(dāng)考慮到不同溫度情況下腫瘤組織內(nèi)部或邊緣可能發(fā)生不同的微環(huán)境變化，進(jìn)而影響治療結(jié)局。尋找合理方法對(duì)抗巨噬細(xì)胞聚集和M1型向M2型快速轉(zhuǎn)變頗有價(jià)值，值得進(jìn)一步探討。
總之，熱應(yīng)激下腫瘤細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)作用明顯，了解巨噬細(xì)胞射頻后特性和與腫瘤相互作用非常必要。還需要更多證據(jù)判斷類似巨噬細(xì)胞具體狀態(tài)及各種特性，以便在熱消融治療中盡量避免類似過程發(fā)生，提高熱消融治療的遠(yuǎn)期效果。
［1］經(jīng)翔，丁建民，王彥冬，等.射頻消融和微波消融治療肝癌的比較［J］.介入放射學(xué)雜志，2014，23：306-310.
［2］ Chu KF，Dupuy DE.Thermal ablation of tumours：biological mechanisms and advances in therapy［J］.Nat Rev Cancer，2014，14：199-208.
［3］陳敏華.超聲引導(dǎo)肝腫瘤消融治療的歷史、現(xiàn)狀及問題［J］.介入放射學(xué)雜志，2014，23：463-465.
［4］翟博，徐愛民，李曉燕，等.原發(fā)性肝細(xì)胞癌射頻消融后快速?gòu)V泛復(fù)發(fā)的因素［J］.世界華人消化雜志，2008，16：1815-1819.
［5］ 王衛(wèi)東，許林鋒.肝癌不完全消融后殘余腫瘤快速生長(zhǎng)與HIF-1α表達(dá)的關(guān)系［J］.影像診斷與介入放射學(xué)，2014，23：439-442.
［6］Sica A，Mantovani A.Macrophage plasticity and polarization：in vivo veritas［J］.J Clin Invest，2012，122：87-95.
［7］ Zerbini A，Pilli M，Laccabue D，et al.Radiofrequency thermal ablation for hepatocellular carcinoma stimulates autologous NK-cell response［J］.Gastroenterology，2010，138：1931-1942.
［8］Dromi SA，Walsh MP，Herby S，et al.Radiofrequency ablation induces antigen-presenting cell infiltration and amplification of weak tumor-induced immunity［J］.Radiology，2009，251：58-66.
［9］Liu Q，Zhai B，Yang W，et al.Abrogation of local cancer recurrence after radiofrequency ablation by dendritic cell-based hyperthermic tumor vaccine［J］.Mol Ther，2009，17：2049-2057.
［10］邱必軍，張會(huì)祿，李萍，等.射頻消融聯(lián)合激活的樹突狀細(xì)胞疫苗對(duì)新西蘭大白兔肝臟原位種植VX2腫瘤治療的實(shí)驗(yàn)研究［J］.肝膽外科雜志，2013，21：302-305.
［11］Wynn TA，Chawla A，Pollard JW.Macrophagebiology in development，homeostasis and disease［J］.Nature，2013，496：445-455.
［12］Ahmed M，Brace CL，Lee J.Principles of and advances in percutaneous ablation［J］.Radiology，2011，258：351-369.
［13］Hao NB，Lü MH，F(xiàn)an YH，et al.Macrophages in tumor microenvironments and the progression of tumors［J］.Clin Dev Immunol，2012：948098.
［14］Guiducci C，Vicari AP，Sangaletti S，et al.Redirecting in vivo elicitedtumorinfiltratingmacrophagesanddendriticcells towards tumor rejection［J］.Cancer Res，2005，65：3437-3446.
［15］Chen J，Yao Y，Gong C，et al.CCL18 from tumor-associated macrophages promotes breast cancer metastasis via PITPNM3［J］. Cancer Cell，2011，19：541-555.
［16］Mantovani A，Allavena P，Sica A，et al.Cancer-related inflammation［J］.Nature，2008，454：436-444.
［17］Biswas SK，Mantovani A.Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets：cancer as a paradigm［J］.Nat Immunol，2010，11：889-896.
［18］ Chanmee T，Ontong P，Konno K，et al.Tumor-associated macrophages as major players in the tumor microenvironment［J］.Cancers（Basel），2014，6：1670-1690.
The promotion effect of tumor cells on the macrophage M2 transformation under heat stress situation and its feedback effect
HUANG Shuai，ZHANG Hui-lu，WANG Tao，WANG Zhi，TANG Xiao-yin，MA Si-cong，ZHAI Bo.Department of Interventional Oncology，Renji Hospital，School of Medicine，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200120，China
ZHAI Bo，E-mail：zhaiboshi@sina.com
ObjectiveThrough the simulation of different temperature of heat stress to explore the interaction between tumor cells and macrophages under varying degrees of heat stress situation. MethodsHuman liver cancer samples were collected before and after radiofrequency ablation（RFA），and the degrees of macrophage infiltration were compared between the two samples.The mice hepatocellular carcinoma cells were separately warmed up by 37℃，55℃ and 70℃ water bath in vitro.Tumor cells supernatant was collected to culture mice macrophage cell line.The expressions of inducible nitric oxide synthase（iNOS）and arginase-1（Arg-1）were detected by real-time polymerase chain reaction（PCR）method，while MSD method was used to determine the interleukin-10（IL-10）and IL-12 secretion levels.The morphological changes of macrophages and polar transformation characteristics under different conditions were evaluated under microscopic observation.The macrophage supernatants at different stimulation conditions were collected for the culture of tumor cells，and tumor cell proliferation was assessed.ResultsAfter RFA the macrophage infiltration was significantly increased in human hepatocellular tissue（P＜0.05）.At normal body temperature，early contact of tumor cells could cause macrophage to be activated and to be transformed to polar M1 phenotype；the iNOS expression was up regulated and the IL-12 secretion was increased.After heat stress，the tumor cells could easily cause the macrophages to transform to polar M2 phenotype，the Arg-1 expression was up regulated and the IL-10 secretion was increased.After heat stress macrophage supernatantcould promote the proliferation of tumor cells.ConclusionHeat-stressed cells can induce M2 phenotype transformation of macrophages，which can potentially promote the progress of the tumor.（J Intervent Radiol，2015，24：979-983）
heat stress；tumor；macrophage；M2 phenotype；interleukin-10
R735.7
A
1008-794X（2015）-11-0979-05
2015-04-01）
（本文編輯：邊佶）
10.3969/j.issn.1008-794X.2015.11.012
國(guó)家自然科學(xué)基金（81472845）
200120上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院腫瘤介入科
翟博E-mail：zhaiboshi@sina.com
猜你喜歡
“不等式”檢測(cè)題中學(xué)生數(shù)理化·七年級(jí)數(shù)學(xué)人教版(2021年6期)2021-11-22 07:50:58 “一元一次不等式”檢測(cè)題中學(xué)生數(shù)理化·七年級(jí)數(shù)學(xué)人教版(2021年6期)2021-11-22 07:50:58 “一元一次不等式組”檢測(cè)題中學(xué)生數(shù)理化·七年級(jí)數(shù)學(xué)人教版(2021年6期)2021-11-22 07:50:58 血清免疫球蛋白測(cè)定的臨床意義中老年保健(2021年3期)2021-08-22 06:50:04 Meigs綜合征伴血清CA-125水平升高1例天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(2021年2期)2021-03-29 05:31:08 慢性鼻-鼻竇炎患者血清IgE、IL-5及HMGB1的表達(dá)及其臨床意義現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)(2021年1期)2021-01-26 00:56:02 LCMT1在肝癌中的表達(dá)和預(yù)后的意義天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(2019年3期)2019-08-13 06:53:08 小波變換在PCB缺陷檢測(cè)中的應(yīng)用海峽科技與產(chǎn)業(yè)(2016年3期)2016-05-17 04:32:12 microRNA在肝癌發(fā)生發(fā)展及診治中的作用腫瘤預(yù)防與治療(2015年1期)2015-09-26 07:26:20 Rab27A和Rab27B在4種不同人肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥(2015年16期)2015-03-01 02:03:11
黃 帥， 張會(huì)祿， 王 濤， 王 智， 湯曉寅， 馬思聰， 翟 博
·實(shí)驗(yàn)研究Experimental research·
熱應(yīng)激下腫瘤細(xì)胞促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型轉(zhuǎn)化及其反饋?zhàn)饔?/p>
黃帥，張會(huì)祿，王濤，王智，湯曉寅，馬思聰，翟博
目的通過模擬不同熱應(yīng)激溫度，探討不同熱應(yīng)激條件下腫瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞之間的相互作用。方法收集射頻消融（RFA）前后的人肝癌樣本，比較兩者巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度。體外實(shí)驗(yàn)中將小鼠肝癌細(xì)胞分別以37℃、55℃、70℃水浴加熱，收取腫瘤細(xì)胞上清液以培養(yǎng)巨噬細(xì)胞；實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法檢測(cè)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、精氨酸酶（Arg）-1表達(dá)，MSD方法檢測(cè)白細(xì)胞介素（IL）-10、IL-12分泌量并鏡下觀察不同條件下巨噬細(xì)胞形態(tài)變化及極性轉(zhuǎn)變特征；收取不同條件刺激的巨噬細(xì)胞上清液以培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，觀察腫瘤細(xì)胞增殖情況。結(jié)果RFA后人肝癌組織巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增多。正常體溫下腫瘤細(xì)胞早期接觸即可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞激活并向M1型極性轉(zhuǎn)變，iNOS表達(dá)上調(diào)，IL-12分泌增多，而熱應(yīng)激后腫瘤細(xì)胞易導(dǎo)致巨噬細(xì)胞向M2型極性轉(zhuǎn)變，Arg-1表達(dá)上調(diào)，IL-10分泌增多。熱應(yīng)激后巨噬細(xì)胞上清液可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。結(jié)論腫瘤細(xì)胞熱應(yīng)激導(dǎo)致巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)變，進(jìn)而可潛在促進(jìn)腫瘤發(fā)展。
熱應(yīng)激；腫瘤；巨噬細(xì)胞；M2型；白細(xì)胞介素-10
以射頻消融（RFA）和微波消融（MWA）為代表的熱消融治療因具有創(chuàng)傷輕微、恢復(fù)快捷、有效性堪比外科切除及患者生活質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn)，已成為肝癌等實(shí)體腫瘤治療的重要方法之一［1-3］。在目前腫瘤臨床與基礎(chǔ)研究中，單純熱消融或與其它療法聯(lián)用均顯示出很好的應(yīng)用前景。然而有研究發(fā)現(xiàn)，消融后仍有一定比例患者腫瘤組織壞死不完全，且殘留組織似有生長(zhǎng)加速之勢(shì)，由此推測(cè)熱消融帶來的熱應(yīng)激反應(yīng)可能負(fù)面影響腫瘤微環(huán)境，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞表型和進(jìn)展［4-5］。腫瘤微環(huán)境指腫瘤細(xì)胞本身、組織液、免疫和炎性細(xì)胞、各類細(xì)胞因子及浸潤(rùn)細(xì)胞等共同構(gòu)成的局部環(huán)境，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要作用。
現(xiàn)有熱應(yīng)激治療腫瘤的機(jī)制研究一般分為熱刺激對(duì)腫瘤的直接作用和間接作用［6］，間接作用即熱刺激與腫瘤微環(huán)境之間的關(guān)系。既往研究發(fā)現(xiàn)，RFA后腫瘤組織中自然殺傷（NK）細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞（DC）均有不同程度浸潤(rùn)，甚至未消融腫瘤組織也會(huì)出現(xiàn)變化［7-8］，活化的DC疫苗則被認(rèn)為與RFA效果聯(lián)系更緊密［9-10］。上述研究提示，以RFA為代表的熱消融聯(lián)合生物免疫治療可能是腫瘤治療的未來重要方向。
巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中最具可塑性的細(xì)胞，在不同條件下發(fā)揮完全不同的作用［11］。盡管研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞也參與了熱消融后腫瘤組織中的免疫效應(yīng)，但具體作用并無定論［8］。Ahmed等［12］討論了熱應(yīng)激對(duì)腫瘤微環(huán)境的直接作用和間接作用，認(rèn)為熱應(yīng)激在一定情況下可能使得腫瘤微環(huán)境更易促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，但僅局限在溫度較低（40～50℃）的腫瘤邊緣區(qū)域，而對(duì)溫度較高（50～100℃）的腫瘤中心區(qū)域的微環(huán)境改變則未深入研究。本研究旨在通過體外模擬熱應(yīng)激環(huán)境，探討不同溫度應(yīng)激狀態(tài)下腫瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞間的作用過程，進(jìn)一步明確巨噬細(xì)胞在腫瘤經(jīng)歷熱應(yīng)激時(shí)的變化特征以及與腫瘤細(xì)胞可能存在的潛在交互作用，以期為臨床治療提供有意義的指導(dǎo)。
1 材料與方法
1.1材料
體外實(shí)驗(yàn)材料包括小鼠肝癌Hep1-6細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心）、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗及5%胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司）、人肝癌樣本（仁濟(jì)醫(yī)院肝外科提供）、肝癌患者血清樣本（仁濟(jì)醫(yī)院腫瘤介入科提供）、免疫組化試劑盒（北京中杉金橋公司）、TRIzol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物（上海生工生物工程公司）、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK）-8（美國(guó)Sigma公司）、PCR試劑（美國(guó)Invitrogen公司）和小鼠抗人 CD68抗體（英國(guó)Abcam公司）。
患者選擇標(biāo)準(zhǔn)：接受過RFA術(shù)；消融術(shù)后30 d左右復(fù)查提示消融灶殘留同時(shí)伴有肝內(nèi)其它部位復(fù)發(fā)而改行肝癌切除術(shù)（消融灶殘留組織及新生腫瘤一并切除）。
RFA灶標(biāo)本：收集符合上述條件的10例患者RFA灶（含殘留腫瘤組織）標(biāo)本及切除的肝癌標(biāo)本，另收集30例肝癌患者RFA前1 d、RFA后 1 d和3 d血清樣本。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
小鼠肝癌細(xì)胞系Hep1-6、小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7均用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，均置于37℃恒溫、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
人肝癌樣本用4%多聚甲醛固定24 h后，給予常規(guī)脫水，透明浸蠟和包埋。石蠟切片，厚約4 μm；使用CD68抗體，每組標(biāo)本取5片進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，觀察人體肝癌組織中巨噬細(xì)胞分布變化。具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。
熱應(yīng)激試驗(yàn)：傳6×106個(gè)Hep1-6細(xì)胞入10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，共6盤；12 h貼壁后換8 ml RPMI1640培養(yǎng)基，采用石蠟封口膜將10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿邊緣密封，分別置入37℃、55℃、70℃水浴鍋內(nèi)，每個(gè)溫度點(diǎn)處理2盤細(xì)胞；20 min后取出，吸取培養(yǎng)基入10 ml離心管內(nèi)行離心3 min（900轉(zhuǎn)/min），以防止有腫瘤細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中。離心后將培養(yǎng)基（以下統(tǒng)稱為腫瘤細(xì)胞上清液）吸入新管。
巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)：傳6×106個(gè)巨噬細(xì)胞入10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，共6盤；在上述37℃、55℃、70℃處理過的腫瘤細(xì)胞上清液恢復(fù)到37℃后，使用上清液給巨噬細(xì)胞RAW264.7換液（為排除血清被高溫破壞，在上清液中加入30%完全RPMI1640培養(yǎng)基），細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h；觀察細(xì)胞形態(tài)變化；將不同條件腫瘤細(xì)胞上清液互換，觀察細(xì)胞形態(tài)是否也對(duì)應(yīng)變化；TRIzol試劑裂解巨噬細(xì)胞，3種腫瘤細(xì)胞上清液處理的細(xì)胞各裂解1盤；余下RAW264.7細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基再次換液——普通胎牛血清白細(xì)胞介素（IL）含量很低，為盡量排除血清影響、更準(zhǔn)確檢測(cè)培養(yǎng)基IL含量，本次換液使用含2%血清的RPMI1640培養(yǎng)基，其后再次用于培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)補(bǔ)充至10%，24 h后收取培養(yǎng)基（以下統(tǒng)稱為巨噬細(xì)胞上清液），收取方法同上。
實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)：TRIzol試劑提取巨噬細(xì)胞總RNA，核酸分析儀檢測(cè)RNA量和純度，所用RNA的A260/A280均為1.8～2.0。Moloney鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶將2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以實(shí)時(shí)PCR行擴(kuò)增反應(yīng)。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）引物序列為F：CTGCAGCACTTGGATCAGGAACCTG，RGGAGTAGCCTGTGTGCACCTGGAA；精氨酸酶（Arg）-1引物序列為F：CAGAAGAATGGAAGAGTCAG，R：CAGATATGCAGGGAGTCACC；3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）引物序列為F：TCAACGGCACAGTCAAGG，R：ACTCCACGACATACTCAGC。擴(kuò)增條件如下：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共36個(gè)循環(huán)，然后再72℃延伸10 min。每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)副孔。由于目的基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率一致，統(tǒng)計(jì)分析實(shí)時(shí)PCR結(jié)果采用2-△△Ct法，△△Ct=對(duì)照組△Ct（目的基因Ct-管家基因Ct）-各組△Ct（目的基因-管家基因Ct）。
應(yīng)用Meso Scale Discovery（MSD）技術(shù)檢測(cè)30例肝癌患者射頻消融前后血清IL-10水平。
細(xì)胞體外增殖檢測(cè)：96孔板每孔傳入5 000個(gè)Hep1-6細(xì)胞，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱24 h，細(xì)胞貼壁后將培養(yǎng)基換為不同條件的巨噬細(xì)胞上清液，每24 h使用CCK-8試劑檢測(cè)一次細(xì)胞增殖狀況。CCK-8檢測(cè)方法：將CCK-8以10%比例加入正常培養(yǎng)基，混勻，每孔加入100 μl混合液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min；使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處光密度（OD），OD值越高，代表細(xì)胞數(shù)量越大。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1RFA明顯激活肝癌組織中巨噬細(xì)胞
手術(shù)切除的肝癌標(biāo)本和RFA后殘留肝癌組織標(biāo)本經(jīng)CD68染色，肉眼觀察顯示肝癌組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)較少，而RFA后殘留肝癌組織內(nèi)部則募集了大量巨噬細(xì)胞。400倍鏡下觀察中單個(gè)視野計(jì)數(shù)同樣可見肝癌組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)明顯較少（7.6± 4.0），射頻后殘留肝癌組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)較多（27.0±9.7），兩者差異明顯（P＜0.001）（圖1）。
2.2不同程度熱應(yīng)激后腫瘤細(xì)胞上清液導(dǎo)致巨噬細(xì)胞形態(tài)發(fā)生不同變化
加入37℃所得腫瘤細(xì)胞上清液后，巨噬細(xì)胞偏大，形態(tài)呈多角狀；加入70℃所得上清液后巨噬細(xì)胞則呈極細(xì)長(zhǎng)梭狀；加入55℃所得上清液后巨噬細(xì)胞形態(tài)同樣出現(xiàn)類似變化，但不如70℃明顯。將所用37℃和70℃腫瘤上清液互換，12 h后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)同樣也發(fā)生了不同程度的互換（圖2）。
圖1 人肝癌組織CD68免疫組化染色及巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)
圖2 腫瘤細(xì)胞上清液刺激巨噬細(xì)胞
2.3熱應(yīng)激后腫瘤細(xì)胞通過旁分泌途徑使巨噬細(xì)胞呈M2型轉(zhuǎn)變
37℃腫瘤細(xì)胞上清液刺激后巨噬細(xì)胞iNOS表達(dá)明顯升高（P＜0.001），Arg-1表達(dá)較低；70℃腫瘤上清液刺激后巨噬細(xì)胞iNOS表達(dá)則較低，Arg-1表達(dá)升高（P＜0.01）。檢測(cè)巨噬細(xì)胞上清液IL-10、IL-12顯示，37℃腫瘤上清液刺激后巨噬細(xì)胞分泌的IL-12明顯升高（P＜0.01），70℃腫瘤上清液刺激后巨噬細(xì)胞則表現(xiàn)為IL-10明顯升高（P＜0.05）（圖3）。
2.4RFA后短時(shí)間內(nèi)血清IL-10水平升高
MSD技術(shù)檢測(cè)肝癌患者RFA術(shù)前1 d、術(shù)后1 d、術(shù)后3 d血清樣本中IL-10含量顯示，RFA后1 d血清IL-10水平（0.849±0.367）與RFA后3 d IL-10水平（0.737±0.262）均高于RFA前（0.434±0.196），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。
2.5M2型轉(zhuǎn)變的巨噬細(xì)胞通過旁分泌促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖
不同熱刺激下收取巨噬細(xì)胞上清液，分別培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞0 h、24 h、48 h、72 h后作CCK-8檢測(cè)。在72 h時(shí)，可見對(duì)照組（1.243±0.027）與70℃巨噬細(xì)胞上清液組（1.768±0.083）腫瘤細(xì)胞增殖存在差異（P＜0.05）（圖5）。
圖3 不同形態(tài)巨噬細(xì)胞偏向極性不同
圖4 肝癌患者RFA前后血清IL-10含量變化
圖5 加入不同狀態(tài)巨噬細(xì)胞上清液后0 h、24 h、48 h、72 h時(shí)CCK-8檢測(cè)Hep1-6細(xì)胞增殖情況
3 討論
巨噬細(xì)胞具有極強(qiáng)可塑性及功能多樣性。巨噬細(xì)胞早期接觸腫瘤細(xì)胞時(shí)表現(xiàn)為經(jīng)典的巨噬細(xì)胞活化（M1型），具有抗腫瘤、促炎作用，而與腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)期接觸后則會(huì)向M2型轉(zhuǎn)變［13］，成為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM），低表達(dá)IL-12、高表達(dá)IL-10表現(xiàn)為腫瘤殺傷能力顯著降低，有助于腫瘤發(fā)生發(fā)展［6］。Guiducci等［14］研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞M1、M2狀態(tài)在不同條件下可以相互轉(zhuǎn)換，巨噬細(xì)胞M2狀態(tài)與腫瘤患者預(yù)后顯著相關(guān)［15］。如果臨床上能促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2狀態(tài)向M1狀態(tài)轉(zhuǎn)化，或抑制其反向轉(zhuǎn)化，將極可能有助于提高腫瘤治療效果。
本研究發(fā)現(xiàn)，接受不同程度熱應(yīng)激后腫瘤細(xì)胞上清液將導(dǎo)致巨噬細(xì)胞發(fā)生不同形態(tài)變化，表明不同腫瘤細(xì)胞上清液中可能存在不同的某種或某些分子，造成巨噬細(xì)胞M1、M2狀態(tài)互換。Mantovani等［16］研究認(rèn)為，一定應(yīng)激條件下腫瘤會(huì)分泌IL-10、集落刺激因子（CSF）-1及其它化學(xué)因子（如CCL2、CCL18、CCL17、CXCL4）等作用于周圍細(xì)胞。同時(shí)，Biswas等［17］認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞在一定情況下可引起IL-10升高，刺激巨噬細(xì)胞呈M2表型，而M2型巨噬細(xì)胞則會(huì)分泌更多IL-10，從而形成正反饋。從本研究結(jié)果看，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中熱應(yīng)激刺激巨噬細(xì)胞分泌IL-10，RFA后肝癌患者血清中IL-10含量也顯著高于RFA前，由此推斷RFA后巨噬細(xì)胞可能更傾向于以M2型方式存在。
不僅如此，本研究通過檢測(cè)巨噬細(xì)胞極性標(biāo)志分子iNOS和Arg-1表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)，37℃時(shí)腫瘤上清液刺激的巨噬細(xì)胞偏向M1型方向，說明巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞接觸早期更易于向M1狀態(tài)轉(zhuǎn)變（iNOS表達(dá)明顯升高，Arg-1表達(dá)較低，巨噬細(xì)胞分泌到上清液的IL-12明顯升高），這與之前報(bào)道是一致的［18］；而70℃條件下腫瘤上清液刺激的巨噬細(xì)胞則呈M2型（iNOS表達(dá)較低，Arg-1表達(dá)升高，巨噬細(xì)胞分泌的IL-10顯著升高），這表明熱應(yīng)激后腫瘤細(xì)胞可能通過旁分泌途徑使巨噬細(xì)胞呈M2樣轉(zhuǎn)變。由此提示，RFA治療中應(yīng)當(dāng)考慮到不同溫度情況下腫瘤組織內(nèi)部或邊緣可能發(fā)生不同的微環(huán)境變化，進(jìn)而影響治療結(jié)局。尋找合理方法對(duì)抗巨噬細(xì)胞聚集和M1型向M2型快速轉(zhuǎn)變頗有價(jià)值，值得進(jìn)一步探討。
總之，熱應(yīng)激下腫瘤細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)作用明顯，了解巨噬細(xì)胞射頻后特性和與腫瘤相互作用非常必要。還需要更多證據(jù)判斷類似巨噬細(xì)胞具體狀態(tài)及各種特性，以便在熱消融治療中盡量避免類似過程發(fā)生，提高熱消融治療的遠(yuǎn)期效果。
［1］經(jīng)翔，丁建民，王彥冬，等.射頻消融和微波消融治療肝癌的比較［J］.介入放射學(xué)雜志，2014，23：306-310.
［2］ Chu KF，Dupuy DE.Thermal ablation of tumours：biological mechanisms and advances in therapy［J］.Nat Rev Cancer，2014，14：199-208.
［3］陳敏華.超聲引導(dǎo)肝腫瘤消融治療的歷史、現(xiàn)狀及問題［J］.介入放射學(xué)雜志，2014，23：463-465.
［4］翟博，徐愛民，李曉燕，等.原發(fā)性肝細(xì)胞癌射頻消融后快速?gòu)V泛復(fù)發(fā)的因素［J］.世界華人消化雜志，2008，16：1815-1819.
［5］ 王衛(wèi)東，許林鋒.肝癌不完全消融后殘余腫瘤快速生長(zhǎng)與HIF-1α表達(dá)的關(guān)系［J］.影像診斷與介入放射學(xué)，2014，23：439-442.
［6］Sica A，Mantovani A.Macrophage plasticity and polarization：in vivo veritas［J］.J Clin Invest，2012，122：87-95.
［7］ Zerbini A，Pilli M，Laccabue D，et al.Radiofrequency thermal ablation for hepatocellular carcinoma stimulates autologous NK-cell response［J］.Gastroenterology，2010，138：1931-1942.
［8］Dromi SA，Walsh MP，Herby S，et al.Radiofrequency ablation induces antigen-presenting cell infiltration and amplification of weak tumor-induced immunity［J］.Radiology，2009，251：58-66.
［9］Liu Q，Zhai B，Yang W，et al.Abrogation of local cancer recurrence after radiofrequency ablation by dendritic cell-based hyperthermic tumor vaccine［J］.Mol Ther，2009，17：2049-2057.
［10］邱必軍，張會(huì)祿，李萍，等.射頻消融聯(lián)合激活的樹突狀細(xì)胞疫苗對(duì)新西蘭大白兔肝臟原位種植VX2腫瘤治療的實(shí)驗(yàn)研究［J］.肝膽外科雜志，2013，21：302-305.
［11］Wynn TA，Chawla A，Pollard JW.Macrophagebiology in development，homeostasis and disease［J］.Nature，2013，496：445-455.
［12］Ahmed M，Brace CL，Lee J.Principles of and advances in percutaneous ablation［J］.Radiology，2011，258：351-369.
［13］Hao NB，Lü MH，F(xiàn)an YH，et al.Macrophages in tumor microenvironments and the progression of tumors［J］.Clin Dev Immunol，2012：948098.
［14］Guiducci C，Vicari AP，Sangaletti S，et al.Redirecting in vivo elicitedtumorinfiltratingmacrophagesanddendriticcells towards tumor rejection［J］.Cancer Res，2005，65：3437-3446.
［15］Chen J，Yao Y，Gong C，et al.CCL18 from tumor-associated macrophages promotes breast cancer metastasis via PITPNM3［J］. Cancer Cell，2011，19：541-555.
［16］Mantovani A，Allavena P，Sica A，et al.Cancer-related inflammation［J］.Nature，2008，454：436-444.
［17］Biswas SK，Mantovani A.Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets：cancer as a paradigm［J］.Nat Immunol，2010，11：889-896.
［18］ Chanmee T，Ontong P，Konno K，et al.Tumor-associated macrophages as major players in the tumor microenvironment［J］.Cancers（Basel），2014，6：1670-1690.
The promotion effect of tumor cells on the macrophage M2 transformation under heat stress situation and its feedback effect
HUANG Shuai，ZHANG Hui-lu，WANG Tao，WANG Zhi，TANG Xiao-yin，MA Si-cong，ZHAI Bo.Department of Interventional Oncology，Renji Hospital，School of Medicine，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200120，China
ZHAI Bo，E-mail：zhaiboshi@sina.com
ObjectiveThrough the simulation of different temperature of heat stress to explore the interaction between tumor cells and macrophages under varying degrees of heat stress situation. MethodsHuman liver cancer samples were collected before and after radiofrequency ablation（RFA），and the degrees of macrophage infiltration were compared between the two samples.The mice hepatocellular carcinoma cells were separately warmed up by 37℃，55℃ and 70℃ water bath in vitro.Tumor cells supernatant was collected to culture mice macrophage cell line.The expressions of inducible nitric oxide synthase（iNOS）and arginase-1（Arg-1）were detected by real-time polymerase chain reaction（PCR）method，while MSD method was used to determine the interleukin-10（IL-10）and IL-12 secretion levels.The morphological changes of macrophages and polar transformation characteristics under different conditions were evaluated under microscopic observation.The macrophage supernatants at different stimulation conditions were collected for the culture of tumor cells，and tumor cell proliferation was assessed.ResultsAfter RFA the macrophage infiltration was significantly increased in human hepatocellular tissue（P＜0.05）.At normal body temperature，early contact of tumor cells could cause macrophage to be activated and to be transformed to polar M1 phenotype；the iNOS expression was up regulated and the IL-12 secretion was increased.After heat stress，the tumor cells could easily cause the macrophages to transform to polar M2 phenotype，the Arg-1 expression was up regulated and the IL-10 secretion was increased.After heat stress macrophage supernatantcould promote the proliferation of tumor cells.ConclusionHeat-stressed cells can induce M2 phenotype transformation of macrophages，which can potentially promote the progress of the tumor.（J Intervent Radiol，2015，24：979-983）
heat stress；tumor；macrophage；M2 phenotype；interleukin-10
R735.7
A
1008-794X（2015）-11-0979-05
2015-04-01）
（本文編輯：邊佶）
10.3969/j.issn.1008-794X.2015.11.012
國(guó)家自然科學(xué)基金（81472845）
200120上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院腫瘤介入科
翟博E-mail：zhaiboshi@sina.com
猜你喜歡
中學(xué)生數(shù)理化·七年級(jí)數(shù)學(xué)人教版(2021年6期)2021-11-22 07:50:58
中學(xué)生數(shù)理化·七年級(jí)數(shù)學(xué)人教版(2021年6期)2021-11-22 07:50:58
中學(xué)生數(shù)理化·七年級(jí)數(shù)學(xué)人教版(2021年6期)2021-11-22 07:50:58
中老年保健(2021年3期)2021-08-22 06:50:04
天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(2021年2期)2021-03-29 05:31:08
現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)(2021年1期)2021-01-26 00:56:02
天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(2019年3期)2019-08-13 06:53:08
海峽科技與產(chǎn)業(yè)(2016年3期)2016-05-17 04:32:12
腫瘤預(yù)防與治療(2015年1期)2015-09-26 07:26:20
中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥(2015年16期)2015-03-01 02:03:11
