小花棘豆Embellisia內(nèi)生真菌原生質(zhì)體的制備與再生研究

呼吉雅 盧萍 牛艷芳

（內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，呼和浩特　010022）

小花棘豆Embellisia內(nèi)生真菌原生質(zhì)體的制備與再生研究

呼吉雅 盧萍 牛艷芳

（內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，呼和浩特010022）

旨在獲得數(shù)目多且活力高的小花棘豆Embellisia內(nèi)生真菌的原生質(zhì)體，分析和探討該內(nèi)生真菌原生質(zhì)體制備與再生的最佳條件，為后續(xù)外源基因轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。利用酶解法對制備小花棘豆Embellisia內(nèi)生真菌菌絲的原生質(zhì)體，研究酶解液成分、pH、溫度、滲透壓穩(wěn)定劑、酶解時(shí)間及菌齡對原生質(zhì)體制備和再生的影響；原生質(zhì)體在TB3培養(yǎng)基上再生后，研究酶解時(shí)間對原生質(zhì)體再生的影響。結(jié)果顯示，2.5%（W/V）lysing enzymes、2%（W/V）纖維素酶和3%（W/V）蝸牛酶3種混合酶處理，菌齡為10 d，當(dāng)酶解溫度為30℃、pH5.8、1.2 mol/L MgSO4為滲透壓穩(wěn)定劑，在80 r/min水平搖床酶解8 h時(shí)，原生質(zhì)體濃度較高，達(dá)4.42×105個(gè)/mL；酶解時(shí)間6 h時(shí)再生率最高，達(dá)46.7%。

小花棘豆；內(nèi)生真菌；原生質(zhì)體；原生質(zhì)體制備與再生

小花棘豆（Oxytropis glabra）屬于豆科棘豆屬的多年生有毒草本植物，主要分布于我國內(nèi)蒙古、甘肅、新疆、陜西、青海、寧夏等地區(qū)的荒漠化草原及山地。小花棘豆生命力旺盛、適應(yīng)性很強(qiáng)，已成為我國西部荒漠化草原優(yōu)勢種群。但是牲畜采食后會引起慢性中毒，給草原畜牧業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失［1，2］。其有毒成分為苦馬豆素，同屬的其他植物，如甘肅棘豆、黃花棘豆中的主要有毒成分也是苦馬豆素［3，4］，它可抑制動物細(xì)胞內(nèi)α-甘露糖苷酶活性，使糖代謝受阻，致使神經(jīng)細(xì)胞功能紊亂，出現(xiàn)中毒癥狀，毒素積累到一定程度可引起死亡?？囫R豆素具有抗腫瘤活性，可抑制腫瘤細(xì)胞N-連接寡糖的合成，從而抑制其生長及擴(kuò)散［5，6］。盧萍等［7-9］研究發(fā)現(xiàn)，小花棘豆毒性與其感染Embellisia內(nèi)生真菌密切相關(guān)，該內(nèi)生真菌在分類上屬于子囊菌門、腔菌綱、格孢腔菌目、格孢腔菌科、埃里磚格孢屬的絲狀真菌，體外培養(yǎng)該內(nèi)生真菌會產(chǎn)生苦馬豆素。小花棘豆中的營養(yǎng)成分及含量與其他豆科植物和禾本科牧草相當(dāng)，是一種具有潛在利用價(jià)值的牧草［10，11］。因此，深入研究該內(nèi)生真菌，對于小花棘豆的治理利用、苦馬豆素微生物工業(yè)化生產(chǎn)等方面都有重要意義。

原生質(zhì)體是外源DNA轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移、病毒轉(zhuǎn)染的良好受體，再生后可表達(dá)外源基因。真菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用［12-14］。絲狀真菌有多組分復(fù)雜細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，與細(xì)菌、酵母、放線菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)相比更加復(fù)雜，相近絲狀真菌物種間的細(xì)胞壁多糖組分和比例也不同［15-17］，絲狀真菌原生質(zhì)體制備難度較高。原生質(zhì)體的高效制備是完成外源基因轉(zhuǎn)化的前提，探索其制備與再生條件非常必要。分離原生質(zhì)體的方法有酶解法和機(jī)械法等，其中酶解法簡便高效，因而被廣泛使用。本研究擬探索小花棘豆Embellisia內(nèi)生真菌的原生質(zhì)體制備與再生的最適條件，旨在為外源基因轉(zhuǎn)化和分析基因在真菌苦馬豆素代謝中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 小花棘豆Embellisia內(nèi)生真菌OW7.8菌株，菌種于本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 1.2 mol/L滲透壓穩(wěn)定劑：KCl，MgSO4，山梨醇，蔗糖（pH由磷酸緩沖液調(diào)制）。PDA培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯 200、蔗糖 20、瓊脂粉20；PDB培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯200、葡萄糖20、蛋白胨10；原生質(zhì)體保存液（STC buffer）［18］：1 mol/L山梨醇、100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）、100 mmol/L CaCl2；TB3原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基：20%蔗糖、0.3%酵母提取物、0.3%酸水解酪蛋白；雙層再生培養(yǎng)基：TOP培養(yǎng)基：TB3再生培養(yǎng)基中加入0.6%瓊脂；Bottom培養(yǎng)基：TB3再生培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂。1.1.3 酶的種類 蝸牛酶（Snailase），纖維素酶（Cellulase）購自內(nèi)蒙古鴻之惠商貿(mào)有限公司；溶壁酶（Lysing enzymes）購自Sigma公司。纖維素酶4 000 r/min 離心2 min，取上清。酶溶液用1.2 mol/L滲透壓穩(wěn)定劑配制，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 方法

1.2.1 真菌原生質(zhì)體制備 在PDA平板上接種OW7.8菌株，培養(yǎng)15 d，用滅菌牙簽刮下菌絲體，置于50 mL PDB液體培養(yǎng)基中，于25℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)14 d后，用寬口槍頭取出適量菌絲團(tuán)置于10 mL離心管中，4 000 r/min離心5 min，棄上清，用超純水洗去殘留培養(yǎng)基，用滲透壓穩(wěn)定劑沖洗一次。稱量得到白色菌絲團(tuán)鮮重，按每克菌絲加20 mL酶液添加進(jìn)行酶解反應(yīng)，每隔30 min檢測原生質(zhì)體釋放情況。酶解結(jié)束后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)原生質(zhì)體，6次重復(fù)，計(jì)算原生質(zhì)體釋放率。用4層擦鏡紙過濾菌絲體酶解液，去掉殘余菌絲體，用滲透壓穩(wěn)定劑沖洗一次，于4℃、6 000 r/min離心10 min，棄上清，加入0.5 mL STC buffer，再次離心后棄上清，加適量STC buffer混勻，收集純化的原生質(zhì)體，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，6次重復(fù)，得到原生質(zhì)體濃度值。

1.2.1.1 酶組合及其濃度 用溶壁酶（含幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、纖維素酶和蛋白酶）、蝸牛酶（含葡聚糖酶、昆布多糖酶、纖維素酶和多聚半乳糖酶等20多種酶）和纖維素酶（含外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶），設(shè)計(jì)單酶、不同酶組合及酶濃度梯度實(shí)驗(yàn)（表1）。其他條件為菌齡12 d，pH6.0，30℃，以MgSO4為滲透壓穩(wěn)定劑，酶解6 h，計(jì)算原生質(zhì)體釋放率，確定最佳酶濃度及酶組合。

1.2.1.2 酶解反應(yīng)pH值 酶組合及濃度確定后，用磷酸緩沖液分別配制pH分別為5.5、5.8、6.1、6.4、6.7和7.0的MgSO4溶液，其他條件不變，進(jìn)行酶解反應(yīng)，分別計(jì)算原生質(zhì)體釋放率。

1.2.1.3 酶解溫度 采用上述實(shí)驗(yàn)確定的酶組合和MgSO4濃度的條件，設(shè)置酶解溫度分別為20℃、25℃、30℃和35℃，其他條件不變，進(jìn)行酶解反應(yīng)，分別計(jì)算原生質(zhì)體釋放率。

表1 不同酶組合及濃度實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1.4 滲透壓穩(wěn)定劑 采用上述實(shí)驗(yàn)確定的酶組合、MgSO4濃度和溫度條件，分別以MgSO4、KCl、山梨醇和蔗糖為滲透壓穩(wěn)定劑，進(jìn)行酶解反應(yīng)，分別計(jì)算原生質(zhì)體釋放率。

1.2.1.5 酶解時(shí)間 將酶解反應(yīng)時(shí)間設(shè)置在2、4、6、8和10 h，分別計(jì)算原生質(zhì)體釋放率。收集原生質(zhì)體，在TB3培養(yǎng)基上再生，于25℃恒溫培養(yǎng)5 d，分別計(jì)算酶解反應(yīng)時(shí)間在2、4、6、8和10 h時(shí)的原生質(zhì)體再生率。

1.2.1.6 菌齡 將菌絲接種到PDB培養(yǎng)基上，在恒溫振蕩器上以80 r/min分別震蕩培養(yǎng)8、10、12、14和16 d后，制備原生質(zhì)體，計(jì)算原生質(zhì)體釋放率。1.2.2 真菌原生質(zhì)體的釋放形式 在酶解過程中，每隔30 min取樣制片，在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體的釋放。

1.2.3 原生質(zhì)體再生 將收集純化的原生質(zhì)體接種到雙層平板中。先在培養(yǎng)皿底部鋪一層Bottom培養(yǎng)基，待其凝固，將收集純化并用STC buffer適當(dāng)稀釋的原生質(zhì)體與冷卻至40℃左右的TOP培養(yǎng)基輕輕混勻，倒入上述平板中，于25℃恒溫培養(yǎng)5 d，計(jì)數(shù)再生菌落數(shù)。收集原生質(zhì)體時(shí)會有酶解不完全的菌絲，為消除其對計(jì)算原生質(zhì)體再生率帶來的誤差，將相同量原生質(zhì)體收集液用去離子水稀釋，室溫放置20 min，使原生質(zhì)體充分脹破，也以上述再生方式培養(yǎng)，進(jìn)行計(jì)菌落數(shù)。

原生質(zhì)體再生率（%）=（STC buffer稀釋生長的菌落數(shù)-去離子水稀釋生長的菌落數(shù)）/原生質(zhì)體總數(shù)×100%

2 結(jié)果

2.1 影響小花棘豆Embellisia內(nèi)生真菌原生質(zhì)體制備的因素

2.1.1 酶組分及濃度 制備小花棘豆Embellisia內(nèi)生真菌的原生質(zhì)體時(shí)，3種酶的混合酶解效果明顯優(yōu)于單酶及雙酶混合的效果，原生質(zhì)體產(chǎn)量起初隨著溶壁酶濃度的增加而明顯提高，但增至3%時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量增加不再顯著（表2）。綜合考慮酶濃度與產(chǎn)量比，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇2.5%溶壁酶、3%蝸牛酶和2%纖維素酶三種酶的混合進(jìn)行酶解反應(yīng)。

表2 酶的不同組合及濃度對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

2.1.2 pH值 原生質(zhì)體產(chǎn)量隨pH增高而增多，pH5.8時(shí)原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，達(dá)3.33×105個(gè)/mL，之后隨pH值升高，原生質(zhì)體產(chǎn)量下降（圖1）。

2.1.3 酶解反應(yīng)溫度 原生質(zhì)體產(chǎn)量隨著酶解反應(yīng)溫度的提高而增加，當(dāng)反應(yīng)溫度為30℃時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，為3.75×105個(gè)/mL，之后隨反應(yīng)溫度的提高，原生質(zhì)體產(chǎn)量下降（圖2）。

2.1.4 不同滲透壓穩(wěn)定劑 用4種緩沖液均可形成一定數(shù)量的原生質(zhì)體，其中山梨醇和蔗糖緩沖液中的原生質(zhì)體數(shù)量較少，而MgSO4滲透壓穩(wěn)定劑緩沖液中的原生質(zhì)體數(shù)量明顯增多，達(dá)3.83×105個(gè)/mL（表3）。

圖1 酶解pH對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

圖2 酶解溫度對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

表3 不同滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

2.1.5 酶解時(shí)間 酶解2 h到3 h，菌絲斷裂并膨脹，只有少數(shù)原生質(zhì)體產(chǎn)生，之后原生質(zhì)體產(chǎn)量隨酶解時(shí)間延長而增加，直到酶解10 h時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)4.5×105個(gè)/mL（圖3）。但因酶解8 h時(shí)有些許原生質(zhì)體已開始破裂，故酶解10 h后不繼續(xù)檢測。

2.1.6 菌齡 菌絲團(tuán)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長逐漸變得致密，14 d有黑色素生成。起初原生質(zhì)體產(chǎn)量隨著菌齡延長而增加，10 d時(shí)原生質(zhì)體產(chǎn)量最多，達(dá)4.42×105個(gè)/mL。然而繼續(xù)延長菌齡，原生質(zhì)體產(chǎn)量急劇下降（圖4）。

圖3 酶解時(shí)間對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

圖4 菌齡對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

2.2 原生質(zhì)體釋放方式

小花棘豆Embellisia內(nèi)生真菌釋放原生質(zhì)體的方式有頂端釋放、側(cè)位釋放和原位釋放3種（圖5）。頂端釋放和側(cè)位釋放多發(fā)生在酶解反應(yīng)初期，在菌絲體細(xì)胞壁較薄處出現(xiàn)孔洞，原生質(zhì)體從此溢出。原位釋放發(fā)生在酶解后期，菌絲段整個(gè)在原位形成球狀體，單個(gè)或數(shù)個(gè)呈串珠狀排列。

2.3 原生質(zhì)體的再生

小花棘豆Embellisia內(nèi)生真菌的原生質(zhì)體在TB3再生培養(yǎng)基上生長良好。原生質(zhì)體再生率與酶解反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系，見圖6。酶解2 h時(shí)原生質(zhì)體產(chǎn)量甚少，隨酶解反應(yīng)時(shí)間延長，再生率明顯提高，酶解6 h時(shí)再生率最高，達(dá)46.7.3%，繼續(xù)延長酶解反應(yīng)時(shí)間，再生率下降。

圖5 原生質(zhì)體釋放方式及收集純化的原生質(zhì)體

圖6 酶解時(shí)間對原生質(zhì)體再生率的影響

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)制備絲狀真菌的原生質(zhì)體時(shí)，混合酶的使用效果明顯好于單一酶［19-21］，本研究結(jié)果也支持該結(jié)論，小花棘豆Embellisia原生質(zhì)體產(chǎn)量在一定范圍內(nèi)與酶濃度成正比，超過該濃度后，產(chǎn)量增加不明顯，過高酶濃度則影響后續(xù)轉(zhuǎn)化及再生［22，23］。

一些研究認(rèn)為，制備原生質(zhì)體的酶解反應(yīng)時(shí)間超過3 h，原生質(zhì)體產(chǎn)量開始下降，再生率降低［15，21］。然而本研究的酶解反應(yīng)達(dá)10 h，原生質(zhì)體數(shù)量依然增加，但酶解反應(yīng)8 h后，一些原生質(zhì)體已開始破裂，再生率下降；培養(yǎng)的內(nèi)生真菌的菌齡超過一定時(shí)間后，其原生質(zhì)體產(chǎn)量也明顯下降，可能因?yàn)橛g菌絲細(xì)胞壁成分及結(jié)構(gòu)較簡單，隨菌齡增加，則細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變得復(fù)雜化，且細(xì)胞開始分泌色素及其他次生代謝物質(zhì)，影響了酶解反應(yīng)效果，也可能降低了酶活性，從而使原生質(zhì)體數(shù)量減少［24，25］。

原生質(zhì)體再生率隨原生質(zhì)體濃度增加而提高，有些原生質(zhì)體無再生能力，其原因一方面可能是在形成過程中內(nèi)部物質(zhì)分配不均勻，導(dǎo)致出現(xiàn)缺乏細(xì)胞核或其他細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)，使原生質(zhì)體無法再生；另一方面可能是原生質(zhì)體酶解過于徹底，喪失了再生基礎(chǔ)或原生質(zhì)體在酶解過程中受到損傷［26，27］。

內(nèi)生真菌如果培養(yǎng)在PDA液體菌絲培養(yǎng)基中，則獲得的菌絲緊密抱團(tuán)，不利于酶解反應(yīng)進(jìn)行和釋放原生質(zhì)體，且菌絲生長也比較緩慢。而在PDB培養(yǎng)基中真菌生長旺盛且菌絲團(tuán)松散，菌絲體量足，即便不對菌絲體進(jìn)行預(yù)處理也能獲得數(shù)目較多的原生質(zhì)體。本研究結(jié)果為后續(xù)外源基因的轉(zhuǎn)化于表達(dá)奠定了良好的基礎(chǔ)。在本次對該菌原生質(zhì)體制備與再生條件優(yōu)化基礎(chǔ)上可進(jìn)一步進(jìn)行外源基因轉(zhuǎn)化研究。

4 結(jié)論

不同酶解液成分、pH、溫度、滲透壓穩(wěn)定劑、酶解時(shí)間及菌齡對小花棘豆Embellisia內(nèi)生真菌原生質(zhì)體產(chǎn)量有顯著影響，各影響因子的最優(yōu)條件組合可獲得數(shù)目較多的原生質(zhì)體。酶解時(shí)間顯著影響原生質(zhì)體再生率，酶解8 h時(shí)，獲得的原生質(zhì)體數(shù)量及其再生率均較高，故確定最佳酶解時(shí)間為8 h。

［1］趙一之， 劉麗. 內(nèi)蒙古棘豆屬Oxytropis植物區(qū)系生態(tài)地理分布特征［J］. 內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版， 1997， 28（2）：199-211.

［2］史志誠. 動物毒物學(xué)［M］. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社， 2001：1-429.

［3］王凱. 黃花棘豆對山羊的毒性研究［J］. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 1990，21（1）：80-86.

［4］童德文， 曹光榮， 李紹軍， 等. 甘肅棘豆中苦馬豆素的分離與鑒定［J］. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)， 2001， 29（3）：62-68.

［5］楊鳴琦， 曹光榮. 苦馬豆素的毒性、代謝與用途［J］. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 1997， 18（4）：20-25.

［6］ 路浩， 王建軍， 孫莉莎， 等. 苦馬豆素抗腫瘤作用研究進(jìn)展［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2009， 30（9）：87-90.

［7］盧萍. 內(nèi)蒙古三種棘豆屬植物中苦馬豆素相關(guān)因子的研究［M］.呼和浩特：內(nèi)蒙古人民出社， 2008：1-164.

［8］盧萍， Child D， 趙萌莉， 等. 小花棘豆（Oxytropis glabra DC. ）內(nèi)生真菌的培養(yǎng)和鑒定［J］. 生態(tài)學(xué)報(bào)， 2009， 29（1）：53：58.

［9］霍紅雁. 小花棘豆內(nèi)生真菌的培養(yǎng)、鑒定及其苦馬豆素含量測定的分析［D］. 呼和浩特：內(nèi)蒙古師范大學(xué)， 2010：1-43.

［10］王帥， 胡建軍， 阿力木別克， 等. 南疆地區(qū)小花棘豆的營養(yǎng)成分分析［J］. 草業(yè)科學(xué)， 2010， 27（5）：136-139.

［11］ 米克熱木·沙伊不扎提， 斯坎達(dá)爾·買合木提， 高超. 新疆小花棘豆?fàn)I養(yǎng)成分的研究［J］. 草食家畜， 2013， 4：65-69.

［12］ Atkins SD， Mauchline TH， Kerry BR， et al. Development of a transformation system for the nematophagous fungus Pochonia chiamydosporia［J］. Mycological Research， 2004， 108（6）：654-661.

［13］張莉滟， 陳林， 張德純. 保加利亞乳桿菌原生質(zhì)體的制備與回復(fù)研究［J］. 中國微生態(tài)學(xué)雜志， 2004， 16（2）：73-74.

［14］Mukherjee S， Dawe AL， Creamer R. Potential role for saccharopine reductase in swainsonine metabolism in endophytic fungus，undifilum oxytropis［J］. Fungal Biology， 2012， 116（8）：902-909.

［15］劉士旺， 尤玉如， 黃俊， 等. 聚乙二醇介導(dǎo)木霉的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化［J］. 中國釀造， 2009， 202（1）：35-38.

［16］宋慶濤， 張國珍， 董金皋. 玉米大斑病原菌原生質(zhì)體的制備與再生［J］. 微生物學(xué)通報(bào)， 2003， 30（2）：41-44.

［17］張萍， 馬宗孚. 幾種絲狀真菌原生質(zhì)體的形成與再生［J］. 云南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版， 1990， 1（3）：255-261.

［18］Mukherjee S， Dawe AL， Creamer R， et al. Development of a transformation system in the swainsonine producing， slow growing endophytic fungus， Undifilum oxytropis［J］. Journal of Microbiological Methods， 2010， 81（2）：160-165.

［19］伏建國， 強(qiáng)勝， 朱云枝. 鏈格孢菌原生質(zhì)體的制備與限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)整合（REMI）轉(zhuǎn)化的致病性誘變［J］. 菌物學(xué)報(bào)，2005， 24（3）：407-413.

［20］陳清霞， 江賢章， 劉錦清， 等. 卷枝毛霉孢子原生質(zhì)體的制備與再生［J］. 生物加工過程， 2011， 9（2）：49-52.

［21］呂天曉， 徐鳳花， 李世貴， 等. 生防木霉菌原生質(zhì)體的制備及再生研究［J］. 生物技術(shù)通報(bào)， 2009（4）：130-134.

［22］趙培寶， 周慶新， 郭芳先， 等. 限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的串珠鐮刀菌插入突變和致病性突變體的分離［J］. 植物病理學(xué)報(bào)，2007， 37（5）：545-548.

［23］徐德峰， 趙海鋒， 趙謀明. 曲霉原生質(zhì)體的制備與非對稱滅活［J］. 華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版， 2010， 38（9）：132-147.

［24］張志光， 李東屏， 方芳， 等. 絲狀真菌原生質(zhì)體技術(shù)研究［J］.湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)， 1998， 21（1）：60-65.

［25］趙竟男， 江梅， 蘇曉慶. 滅蚊真菌貴陽腐霉原生質(zhì)體的制備和再生研究［J］. 貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2008， 33（2）：111-114.

［26］陳飛， 關(guān)艷麗， 吳紅艷， 等. 鏈霉菌11371原生質(zhì)體的制備與再生［J］. 微生物學(xué)雜志， 2011， 31（5）：54-58.

［27］ 馬恒德， 郭成金. 啤酒酵母原生質(zhì)體制備與再生條件的篩選［J］. 中國釀造， 2012， 31（2）：140-143.

（責(zé)任編輯李楠）

Preparation and Regeneration of Protoplasts Isolated from Embellisia Fungal Endophyte of Oxytropis glabra

Hu Jiya Lu Ping Niu Yanfang
（College of Life Science and Technology，Inner Mongolia Normal University，Hohhot010022）

The aim of this research is to obtain more active and larger amount of protoplasts of Embellisia fungal endophyte from Oxytropis glabra， investigate the optimal conditions of protoplast preparation and regeneration， and lay foundation for setting up later exogenous gene transformation system. The protoplasts are made by enzymes， and the influences on protoplast yield regarding different combined enzymes and their concentration， pH， temperatures， osmotic solutions， enzymolysis time and hyphal culture time were discussed. The protoplasts regenerated on TB3 medium were analyzed for understanding the impacts of different enzymolysis time on the regeneration. The protoplast concentration reached to 4.42×105/mL when medium mass was hydrolyzed by enzymes consisting of 2.5%（W/V）lysing enzymes， 2%（W/V）cellulose and 3%（W/V）helicase， the culture time was 10 days， the enzymolysis temperature was set to 30℃， the pH was 5.8， the 1.2 mol/L MgSO4solution was selected as osmotic stabilizer and the cultures were incubated in a flat shaker（80 r/min）for 8 h. The protoplast regeneration rate reached to 46.7% when enzymolysis time was 6 h.

Oxytropis glabra；fungal endophytes；protoplast；preparation and regeneration

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.021

2014-11-24

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30860049，31460235）

呼吉雅，女，碩士研究生，研究方向：植物及真菌分子生物學(xué)；E-mail：hujiya@yeah.net

盧萍，女，博士，教授，研究方向：植物及真菌分子生物學(xué)；E-mail：luping@imnu.edu.cn