家蠅抗真菌肽-溶菌酶基因的克隆、表達及序列分析

彭傳林魏川川吳建偉王宇，3修江帆尚小麗趙學軍

（1.貴陽醫(yī)學院寄生蟲學教研室，貴陽　550004；2.皖北煤電集團總醫(yī)院，宿州　234000；3.貴州省疾病預防控制中心，貴陽　550004）

家蠅抗真菌肽-溶菌酶基因的克隆、表達及序列分析

彭傳林1，2魏川川1吳建偉1王宇1，3修江帆1尚小麗1趙學軍1

（1.貴陽醫(yī)學院寄生蟲學教研室，貴陽550004；2.皖北煤電集團總醫(yī)院，宿州234000；3.貴州省疾病預防控制中心，貴陽550004）

旨在對家蠅抗真菌肽MAF-1-溶菌酶（LZM）基因進行生物信息學分析，并進行融合基因MAF-1-LMZ的克隆和表達分析。從GenBank獲得家蠅抗真菌肽MAF-1和溶菌酶LZM的編碼序列，分析和預測這兩種蛋白質的結構和功能。PCR擴增融合蛋白質抗真菌肽-溶菌酶的基因 MAF-1-LMZ，將其克隆到原核表達載體pET-28a中，重組質粒pET-28a-MAF-1-LMZ在大腸桿菌OrigmiB/DE3中經用IPTG誘導表達，表達產物MAF-1-LMZ通過SDS-PAGE電泳進行鑒定，采用小試管法倍比稀釋法進行活性驗證。結果顯示，融合蛋白質MAF-1-LMZ序列的ORF為969 bp，編碼322個氨基酸殘基，理論分子量為35 468.6 Da，等電點為8.31，在大腸桿菌OrigmiB/DE3中得到成功表達。其純化后的目的蛋白具有抗真菌活性。

家蠅；抗真菌肽-溶菌酶；重組表達；序列分析

深部真菌感染日益成為導致腫瘤放化療、器官移植及艾滋病等免疫力低下病人死亡的主要原因［1］，嚴重威脅著人類的健康［2，3］?？拐婢幬镙^為有限，其本身具有毒副作用并且耐藥現象日益增加。尋求和研發(fā)安全有效的抗真菌藥至關重要。本課題組前期研究中，家蠅抗真菌肽MAF-1（Musca domestica antifungalpeptide-1）在體外被驗證具有抗真菌活性，可能是一種全新的以α螺旋為主的線性昆蟲抗真菌肽［4］。家蠅溶菌酶（lysozyme，LZM）是一類非特異性免疫因子，在機體的先天免疫中發(fā)揮重要作用，可破壞菌體胞壁、導致細菌死亡，而對人體無毒副作用［5］。為了尋求新型的抗菌蛋白質或抗真菌-抗細菌融合蛋白質，近年來國內外先后報道了有關抗菌肽類基因以及與其它相關基因融合的克隆和表達［6-10］，Lu等［11］報道了家蠅天蠶素與人溶菌酶融合表達。但目前將家蠅的抗真菌肽MAF-1與抗細菌的溶菌酶LZM進行融合表達未見報道。將二者構建成融合蛋白質，使其具有真菌肽和溶菌酶的活性，降低細菌的耐受性，對家蠅抗真菌肽和家蠅溶菌酶作為新藥研發(fā)具有重要意義。本研究利用酶切、連接重組家蠅抗真菌肽MAF-1與家蠅溶菌酶LZM的基因，對其編碼的重組蛋白質MAF-1-LMZ結構特征進行預測分析和克隆表達，旨在為進一步研究該重組融合基因的功能奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 家蠅，由貴陽醫(yī)學院寄生蟲教研室常規(guī)飼養(yǎng)；載體pET-28a、大腸桿菌菌株DH5α、OrigmiB/DE3由貴陽醫(yī)學院寄生蟲教研室常規(guī)保存。

1.1.2 主要試劑及設備 限制性內切酶EcoR I、Hind III及Xho I、T4連接酶、rTaq酶、DNA Marker、Protein Marker、PCR產物膠回收試劑盒、DNA產物純化試劑盒、質粒小量提取試劑盒均購于大連寶生物科技公司；其他試劑均為國產分析純。PCR擴增儀（德國Eppendorf公司）；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（美國GE公司）；紫外分光光度計（美國GE公司）；Millipore 0.22 μm/0.45 μm濾器（美國Merck Millipore公司）；Milli-Q超純水儀（法國Mill-ipore Pharmacia公司）。

1.1.3 引物合成和DNA測序 基因擴增引物和重組質粒DNA測序由上海生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 MAF-1、LMZ基因的識別 利用美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）網站的ORF Finder（開放閱讀框探尋器）確定其完整編碼序列和編碼的氨基酸序列。利用瑞士生物信息學研究所的蛋白分析專家系統(tǒng)（Expert Protein Analysis Systerm，ExPASy，http：//ca.expasy.org/）Proteomics Server（http：//ca.expasy.org/）所提供的蛋白質在線分析工具，如protparam（http：//au.expasy. org/tools/protparam.html）預測氨基酸序列的分子量、等電點、穩(wěn)定性指數等理化性質；InterPro Scan（http：//www.ebi.ac.uk/InterProScan/）預測氨基酸序列中的功能域；Sec（https：//www.predictprotein. org/upgrade/Sec/）預測氨基酸序列中的拓撲結構。

1.2.2 MAF-1-LMZ融合基因的擴增 利用prmer5.0軟件，根據GenBank獲得家蠅抗真菌肽（登錄號：HM178948）和家蠅溶菌酶（登錄號：XP_0051784-89.1）基因序列和pET-28a多克隆位點設計特異性引物。引物為：MAF-1 F：5'-GGAATTCGAATCTGCCCCCGCCCCTGAGGT-3'，MAF-1 R ：5'-CCCAAGCTTGGCATGGGGCTTCATTTCCTTGGC-3'，下劃線為EcoR I 和Hind III限制性酶切位點；LMZ F：5'-GCCAAG CTTATGTACAACATTTCTGGTT-3'，LMZ R：5'-CGGC TCGAGTCAAAAACAATCATCAACACT-3'，下劃線為Hind III和Xho I限制性酶切位點。

從家蠅3齡幼蟲提取RNA，逆轉錄cDNA為模板分別進行PCR擴增。MAF-1 PCR條件：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 30 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。LMZ PCR條件：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳回收。

1.2.3 重組原核表達質粒的構建及鑒定 將回收的目的基因MAF-1、LMZ及表達載體pET-28a分別用限制性內切酶EcoR I 和Hind III；Hind III和Xho I；EcoR I和Xho I進行雙酶切。并將目的基因酶切產物按一定比例與表達載體pET-28a酶切產物連接過夜，轉化大腸桿菌OrigmiB/DE3感受態(tài)細胞，卡那霉素篩選陽性克隆。對陽性克隆提取質粒進行PCR、雙酶切和測序鑒定。

1.2.4 MAF-1-LMZ在大腸桿菌Origmi/DE3中的誘導表達 取50 μL培養(yǎng)過夜的陽性克隆菌液，加入含卡那霉素的5 mL LB培養(yǎng)基中（菌液/培養(yǎng)基為1/100），37℃，250 r/min振搖至OD600為0.6時，加入IPTG至終濃度0.25 mmol/L誘導表達16 h。離心收集菌體，在沉淀中加入80 mL 1×SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸8-10 min，12 000 r/min離心取上清10 μL進行15% SDS-PAGE分析。

1.2.5 重組蛋白的大量誘導、純化 按照上述方法對陽性克隆進行大量誘導表達，離心收集菌體，按每克菌體加入3 mL細菌細胞壁裂解液重懸菌體，反復凍融后冰上超聲裂解（功率150 W，持續(xù)1 s，停3 s，共180 s），4℃，12 000 r/min，離心20 min后收集上清，分別取上清和沉淀樣品處理后進行SDSPAGE判斷該重組蛋白的可溶性。收集上清，用0.45 μL濾膜過濾，參照鎳離子金屬螯合劑親和層析柱說明書進行蛋白純化，收集蛋白洗脫液，再將洗脫的目的蛋白在PBS透析液（pH7.4）中4℃透析24 h。并根據說明書，用Bradford法對經過以上步驟獲得的重組蛋白進行蛋白定量，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 重組蛋白質MAF-1-LMZ抗真菌活性檢測 將白色念珠菌Candida albicans ATCC10231制備成新鮮的菌懸液每毫升含1×107個菌細胞。在無菌的96孔細胞培養(yǎng)板中進行，分別于每孔中加入50 μL滅菌雙蒸水后，向第一孔加入50 μL純化后的重組蛋白質，混勻后從第一孔中吸取上述混合液50 μL加入到第二孔，以此類推做倍比稀釋，再向每孔中加入菌懸液50 μL，設置無菌蒸餾水為陰性對照，氟康唑為陽性對照，充分混勻后于30℃培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)物接種至培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)24 h后，觀察有無菌落生長并對菌落計數。

2 結果

2.1 MAF-1-LMZ基因序列及蛋白質理化性質預測

圖1 MAF-1-LMZ序列及其ORF編碼的氨基酸序列

MAF-1基因編碼序列包含一個完整的開放閱讀框（ORF）為537 bp，編碼178個氨基酸；LMZ基因編碼序列包含一個完整的ORF為435 bp，編碼145個氨基酸。融合基因MAF-1-LMZ編碼序列包含的ORF為969 bp，編碼322個氨基酸（圖1）。ExPASy中ProtParam預測MDLMZ的理論分子量為35 468.6 Da，等電點為8.31。280 nm處的摩爾消光系數為39 460 M-1cm-1，0.1%濃度的ABS為1.098。若其成熟肽N-末端為蛋氨酸時，預測在哺乳動物網狀細胞體外表達的半衰期為30 h，在酵母和大腸桿菌中表達的半衰期分別＞20和10 h。預測MAF-1-LMZ在溶液中不穩(wěn)定指數為32.29，低于閾值40，其性質穩(wěn)定；MAF-1-LMZ的疏水指數為85.22，疏水性較高。

2.2 MAF-1-LMZ亞細胞定位分析ExPASy中TargetP預測

MAF-1-LMZ有信號序列，在第18和19個氨基酸之間有斷裂點，提示MAF-1-LMZ在細胞外分泌，未發(fā)現線粒體、過氧化酶體、溶酶體和細胞核等亞細胞定位序列。

2.3 InterPro Scan分析MAF-1-LMZ蛋白質結構域

結果顯示，家蠅抗真菌肽MAF-1-溶菌酶（LZM）融合蛋白中分別含有抗真菌肽MAF-1的結構域（1-178 aa），功能結構域（128-153 aa），是一全新的昆蟲抗真菌肽；溶菌酶（LZM）功能域（182-322 aa），活性位點位于232-250 aa，屬于溶菌酶超家族。

2.4 蛋白質拓撲結構分析Sec預測

α螺旋（H）和無規(guī)卷曲（L）比例是37.67∶53.99，β折疊（E）和無規(guī)卷曲（L）比例是8.34∶53.99，二級結構以α螺旋（H）為主。預測每個氨基酸的溶劑可及性（solvent accessibility，Acc），超過16%的表面暴露的定義為暴露氨基酸（e），其余氨基酸為包埋氨基酸（b）。從分析結果來看，一部分氨基酸殘基（39.63%）包埋在蛋白質內部，一部分氨基酸殘基（44.91%）暴露在溶液界面。

2.5 pET28a-MAF-1-LMZ質粒構建及鑒定

特異性引物分別擴增目的基因MAF-1、LMZ，2%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收目的基因，獲得約534 bp的MAF-1和435 bp的LMZ兩個片段。將重組質粒pET28a-MAF-1-LMZ進行PCR和雙酶切后約在1 000 bp有一清晰的條帶，與目的基因（969 bp）的大小基本相符（圖2），測序結果證實重組質粒中插入序列正確，表明重組質粒構建成功。

2.6 蛋白表達純化結果

將構建好的重組質粒pET28a-MAF-1-LMZ轉化到 E.coli OrigmiB/DE3中經IPTG誘導表達，15% SDS-PAGE分析結果（圖3第 5、6 泳道）顯示，約在 35 kD左右處出現目的表達條帶。將蛋白進行純化，結果如圖 4第7泳道所示，證明目的蛋白純化成功。Bradford 法測得該蛋白濃度為0.37 mg/mL。

圖2 重組質粒PCR及雙酶切鑒定

圖3 SDS-PAGE分析pET28a-MAF-1-LMZ表達純化效果

2.7 重組蛋白質MAF-1-LMZ抗真菌活性

以白色念珠菌（ATCC10231）為指示菌，采用Quantity One克隆菌落計數法檢測重組蛋白質MAF-1-LMZ的抗真菌活性。結果（表1，圖4）顯示，100 μg/mL的重組蛋白質MAF-1-LMZ具有明顯的抗真菌活性。

表1 重組蛋白質MAF-1-LMZ的抗真菌效果

3 討論

抗真菌制劑的活性及選擇性是由其與真菌相互作用的方式決定的。白色念珠菌是臨床常見致病菌，白色念珠菌細胞壁結構復雜，細胞壁厚約25 μm，約占細胞干重的25%，是一種堅韌的結構。其化學組分較特殊，主要由內層的葡聚糖、中間的蛋白質分子及外層的甘露聚糖組成。細胞壁上還含有少量類脂和幾丁質。葡聚糖是白色念珠菌細胞壁含量最高的多糖。大量葡聚糖分子聚集，形成了念珠菌細胞壁的纖維網絡結構［12-14］。溶菌酶主要是通過破壞細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1，4糖苷鍵，使菌體細胞壁出現缺口或被溶解，導致內容物外流，從而達到抑制菌體生長或殺滅菌體的作用?？拐婢腗AF-1吸附在白色念珠菌細胞表面，通過在真菌細胞質膜上形成通道后，進入細胞逐步在細胞內聚集。抑制真菌生物膜的形成，破壞菌體細胞膜的完整性，導致細胞內容物外泄、細胞核碎裂，細胞器結構紊亂［15，16］。另有研究表明，溶菌酶與抗真菌肽具有協同作用，可能是抗真菌肽破壞細菌外膜后利于溶菌酶作用于其細胞壁［17，18］。臨床上聯合應用抗菌藥物治療真菌感染已成共識，其理論基礎是聯合不同藥物在體內的協同作用，增強殺菌作用，減少單藥在體內作用的劑量依賴性，減少藥物的毒副作用。本研究在聯合用藥的理論基礎上，通過基因重組表達，將MAF-1、LMZ構建成融合蛋白，利用融合蛋白協同作用，更好地發(fā)揮其生物學活性。

圖4 重組蛋白質MAF-1-LMZ抗真菌活性檢測

將目的蛋白在核酸水平上連接，一種連接方法是根據表達載體上的酶切位點在目的基因兩端分別引入限制性酶切位點，兩端各有限制性酶切位點供目的基因插入連接。另一種連接方法是通過PCR合成，采用低疏水性及低電荷效應的氨基酸組成的多肽接頭序列直接包含在重組目的基因當中，稱為Gene SOEing［19，20］。本研究采用前者，將限制性酶切位點分別設計在待擴增的引物中，分別擴增獲得目的基因，將待融合的兩個擴增產物用限制性酶酶切后連接起來。此方法簡便易行，因不需要在基因序列上引入氨基酸組成的多肽接頭序列，從而減少了蛋白酶的攻擊［21-24］。

本研究根據GenBank中家蠅抗真菌肽與溶菌酶基因分別設計特異性引物，以家蠅3日齡幼蟲提取總RNA后逆轉錄cDNA為模板，分別成功擴增出目的基因，測序結果證實與 GenBank獲得家蠅抗真菌肽（登錄號：HM178948）和家蠅溶菌酶（登錄號：XP_005178489.1）序列相符，通過生物信息學分析顯示該基因序列的ORF為969 bp，編碼322個氨基酸，理論分子量為35 468.6 Da，等電點為8.31。所構建的重組質粒經PCR、雙酶切及測序鑒定成功。SDS-PAGE結果表明家蠅抗真菌肽-溶菌酶在大腸桿菌OrigmiB/DE3中成功表達。重組質粒在大腸桿菌OrigmiB/DE3中經IPTG誘導表達，并成功純化目的蛋白，15% SDS-PAGE分析顯示純化蛋白與目的蛋白分子量大小相符?？拐婢钚詸z測結果顯示，重組融合蛋白質MAF-1-LMZ，其濃度在100 μg/mL時具有明顯的抗真菌活性。說明重組融合蛋白質在誘導表達過程中沒有降解失活，并證實融合蛋白質具有抗真菌活性，此研究結果與劉文麗等［25］報道蛋白質保守結構域與抗菌活性相關，以及胡國強等揭示了構-效相關是一致的［26］。這為進一步研究新型抗菌融合蛋白MAF-1-LMZ的生物學活性及產業(yè)化開發(fā)奠定了基礎。

4 結論

本研究成功構建pET-28a-MAF-1-LMZ重組原核表達載體并表達出融合MAF-1-LMZ蛋白，對純化條件進行了初探，獲得了純度較高的目的蛋白。實驗顯示重組融合蛋白MAF-1-LMZ具有抗真菌活性。

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（責任編輯 馬鑫）

Cloning，Expression and Sequence Analysis of Musca domestica Antifungal Peptide-1 and Musca domestica Lysozyme

Peng Chuanlin1，2Wei Chuanchuan1Wu Jianwei1Wang Yu1，3Xiu Jiangfan1Shang Xiaoli1Zhao Xuejun1
（1. Department of Parasitology，Guiyang Medical College，Guiyang550004；2. General Surgery of Wanbei Coal-electricity Group General Hospital，Suzhou234000；3. Guizhou Center for Disease Control and Prevention，Guiyang550004）

The aim of this study is to have bioinformatics analysis of Musca domesitca antifungal peptide-1（MAF-1）and lysozymeb（LMZ）， also clone fused MAF-1-LMZ gene and have expression analysis of it. The encoding sequences of MAF-1 and LMZ were fetched from GenBank， and the structures and functions of 2 proteins were analyzed and predicted. The gene MAF-1-LMZ was amplified by polymerase chain reaction（PCR）， then was ligated into pET 28a and transformed into E. coli Origmi（DE3）competent cell， and induced with IPTG. The fusion protein MAF-1-LMZ in the expression vector was analyzed by SDS-PAGE. The activity of the protein was validated by methods of small test tube and doubling dilution. The open reading frame of the MAF-1-LMZ was 969 bp， encoding a putative protein consisting of 322 amino acids with a predicted molecular weight of 35 468.6 Da and pI of 8.31， indicating the gene expressed in E. coli Origmi（DE3）successfully. The purified target protein had the antifungal activity.

Musca domestica；antifungal peptide-1 with Lysozyme；recombinant expression；sequence analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.031

2014-09-01

國家科技支撐計劃（2011BAC06B12），國家自然科學基金項目（81360254），貴州省科學技術基金項目（黔科合J字［2012］2038號）

彭傳林，男，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：分子生物學；E-mail：2463749164@qq.com

吳建偉，男，博士，教授，研究方向：昆蟲免疫及應用；E-mail：wjw@gmc.edu.cn