方格星蟲體腔液多糖的提取及體外抗氧化活性

董蘭芳，張琴，童潼，許明珠

（廣西壯族自治區(qū)海洋研究所，廣西海洋生物技術重點實驗室，廣西北海536000）

方格星蟲體腔液多糖的提取及體外抗氧化活性

董蘭芳，張琴*，童潼，許明珠

（廣西壯族自治區(qū)海洋研究所，廣西海洋生物技術重點實驗室，廣西北海536000）

該試驗分別從濃縮溫度和堿加入量兩個方面初步研究了方格星蟲體腔液多糖的提取條件，得到最佳濃縮溫度為70℃，NaOH最佳加入量為質(zhì)量體積百分比1%，該條件下多糖提取率為0.75 g/L，多糖含量為51.39%。將最佳提取條件下所得多糖進行體外抗氧化活性研究，結(jié)果表明：在該研究設定的濃度范圍內(nèi)，方格星蟲體腔液多糖具有較高的還原能力，對羥自由基和超氧自由基也有一定的清除能力，1 mg/mL時清除率分別為76.88%和26.17%，但還原能力和自由基清除能力均弱于抗壞血酸。

方格星蟲；體腔液；多糖；提取；抗氧化活性

方格星蟲（Sipunculus nudus），俗稱“沙蟲”，隸屬星蟲動物門方格星蟲綱方格星蟲屬，為世界廣布性種類，我國沿海從南到北均有分布。近年來隨著海洋藥物的開發(fā)及糖類藥物的研究進展，人們發(fā)現(xiàn)方格星蟲多糖具有抗病毒、抗輻射、抗疲勞、提高記憶力等生物學功能［1-4］。方格星蟲體腔液是一個復雜的內(nèi)環(huán)境系統(tǒng)，含有多種離子、酶類、抗菌素、色素、細胞毒素、嘌呤化合物及一些代謝產(chǎn)物［5］。在實際生產(chǎn)生活中，方格星蟲體腔液是被丟棄的低值部分，不僅造成資源浪費，對環(huán)境也產(chǎn)生了污染。目前，國內(nèi)外對方格星蟲體腔液功能性成分的研究鮮見報道［6］，該試驗研究了方格星蟲體腔液多糖的提取方法及其體外抗氧化活性，為進一步篩選海洋動物活性多糖及開發(fā)海洋多糖藥物提供理論參考，對于增加方格星蟲的經(jīng)濟附加值有重要的意義。

1材料與方法

1.1試劑與材料

試驗用方格星蟲：購于北海市南珠市場；儀器設備：溶劑蒸發(fā)工作站（Genevac EZ-2，英國），高速冷凍離心機（Thermo KR25i，美國），冷凍干燥機（Coolsafe 1104L，丹麥），紫外可見分光光度計（UV6300，上海）；主要試劑：抗壞血酸，乙醇，三氯甲烷，正丁醇，三氯乙酸，苯酚，葡萄糖，氫氧化鈉、鄰苯三酚、雙氧水、硫酸亞鐵等，均為分析純。

1.2方格星蟲體腔液多糖的提取

方格星蟲用純水洗凈，瀝干水分，用剪刀剖開，收集體腔液。體腔液于溶劑蒸發(fā)工作站，分別設定溫度50、60、70℃進行濃縮，至體積為原來的1/5左右，sevag法去蛋白3次，用截留相對分子量為100 000以上的玻璃紙透析24 h，3 000 r/min離心除去不溶物，上清液加乙醇至終濃度為70%，4℃沉淀過夜，9 000 r/min離心10 min，沉淀冷凍干燥即方格星蟲體腔液多糖，以提取率和多糖含量為指標確定最佳濃縮溫度。體腔液加入NaOH至終質(zhì)量體積百分比分別為1%、2%、3%，用最佳濃縮溫度重復提取操作，確定最佳堿加入量。多糖提取率=m/v。式中：m為粗多糖質(zhì)量，g；v為提取所用方格星蟲體腔液體積，L。

1.3多糖含量測定

多糖含量采用苯酚-硫酸法［7］測定。

1.4多糖抗氧化活性的測定

1.4.1總還原力測定

多糖樣品、pH 6.6 0.2 mol/L磷酸緩沖液和1% K3Fe（CN）6溶液各取1.0 mL混合，50℃水浴20 min，冰水冷卻后加入1.0 mL 10%三氯乙酸溶液，混勻。3 000 r/min離心10 min后取上清1.0 mL，依次加入1.0 mL蒸餾水、0.2 mL 0.1%FeC13溶液，混勻，靜置10 min。蒸餾水做參比，于700 nm處測定吸光度。實驗均重復操作3次，結(jié)果取平均值。

1.4.2羥自由基清除率

羥基自由基測定采用Smimoff法測定［8］，配制一定濃度的多糖溶液以及濃度為8.0 mmol/L的H2O2，8.0 mmol/L的FeSO4和8.0mmol/L的水楊酸-乙醇溶液備用。取上述FeSO4、水楊酸乙醇溶液各1.0 mL于試管中，分別加入不同濃度的多糖溶液和1.0mL8.0mmol/LH2O2各1.0 mL，搖勻，37℃水浴30 min，以蒸餾水做參比，于510 nm處測其吸光度值。實驗均重復操作3次，結(jié)果取平均值。清除率（%）=（A空白-A樣品）/A空白×100%

1.4.3超氧自由基抑制率

超氧自由基測定采用改良的鄰苯三酚自氧化法［9-10］，取50mmol/LTris-HC1緩沖液4.5mL（pH=8.2）和4.2mL蒸餾水混勻后在25℃水浴中保溫20 min，取出后分別加入不同濃度的多糖溶液1 mL和25 mmol/L鄰苯三酚0.4 mL（空白管用8 mmol/L HC1代替鄰苯三酚溶液）。充分混勻后，于25℃水浴鍋中準確反應5 min后（加入鄰苯三酚時開始計時），立即加入8 mmol/L HCl溶液終止反應，在320 nm處測定吸光度。實驗均重復操作3次，結(jié)果取平均值。抑制率（%）=（A空白-A樣品）/ A空白×100%

1.5數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0 for Windows對所得數(shù)據(jù)進行方差分析，若差異達到顯著，則進行Tukey多重比較，顯著性水平為P＜0.05。

2結(jié)果與分析

2.1方格星蟲體腔液多糖的提取

2.1.1濃縮溫度對多糖提取率和多糖含量的影響

該研究優(yōu)化了多糖提取的濃縮溫度，濃縮溫度對多糖提取率和多糖含量的影響結(jié)果見表1。

表1　濃縮溫度對多糖的提取率及多糖含量的影響Table 1Effect of concentration temperature on polysaccharide yield and content

隨著濃縮溫度的升高，多糖含量大幅度提高，70℃達31.74%；50℃濃縮提取率雖較高，但多糖含量很低，70℃提取率最高，為1.03%。溫度越高越有利于胞內(nèi)物質(zhì)的浸出，因此方格星蟲體腔液多糖的最佳濃縮溫度為70℃。

2.1.2堿加入量對多糖提取率和多糖含量的影響

動物中所含的多糖多是酸性多糖，常與蛋白質(zhì)牢固地結(jié)合在一起，目前常用堿液提取法和蛋白酶水解法提取分離［11］。該研究提取多糖時對堿加入量進行了優(yōu)化，結(jié)果見表2。

表2　堿加入量對多糖的提取率及多糖含量的影響Table 2Effect of the amount of alkali on polysaccharide yield and content

隨著NaOH百分比的增加，多糖含量增加，多糖提取率卻大大降低。堿液提取法基于蛋白多糖中的糖肽鍵對堿的不穩(wěn)定性，提取過程應在較溫和條件下，以避免氨基多糖的降解［12］，因此堿加入量增加，濃縮后堿濃度成倍增長，使堿濃度過高，造成多糖降解，因而提取率降低。綜合比較對多糖含量和多糖提取率的影響，選擇NaOH質(zhì)量體積百分比1%為最佳堿加入量。

2.2方格星蟲體腔液多糖的抗氧化活性

2.2.1方格星蟲體腔液多糖的體外還原力

方格星蟲體腔液多糖的體外還原力結(jié)果見圖1。

圖1　方格星蟲體腔液多糖的還原能力Fig.1Reducing power of polysaccharide from S.nudus coelomic fluid at the indicated concentrations

反應體系中，還原物質(zhì)與K3［Fe（CN）6］反應生成K4［Fe（CN）6］，再與Fe3+反應生成普魯士蘭，在700 nm處有特異吸收，吸光值越大還原能力越強［13］。由圖1可知，在試驗濃度范圍內(nèi)，方格星蟲體腔液多糖的還原能力與多糖濃度成正相關，低于相同濃度抗壞血酸的還原能力。試驗結(jié)果表明，方格星蟲體腔液多糖具有一定的還原能力，強于鮑魚臟器多糖（FAVP和 MAVP）和烏賊墨多糖［13-14］，但比抗壞血酸弱。

2.2.2方格星蟲體腔液多糖對羥自由基的清除能力

方格星蟲體腔液多糖對羥自由基的清除能力結(jié)果見圖2。

圖2　方格星蟲體腔液多糖對羥自由基的清除能力Fig.2Hydroxyl radical scavenging ability of polysaccharide from S.nudus coelomic fluid

羥自由基被認為是毒性最強的活性氧自由基，極易造成機體過氧損傷，生物體內(nèi)羥自由基的含量與其衰老、腫瘤輻射損傷和細胞吞噬等具有一定的相關性［15］。該研究考察了方格星蟲體腔液多糖清除羥自由基的能力，結(jié)果見圖2。隨著多糖濃度的增加，多糖對羥自由基的清除能力逐漸增強，在多糖濃度為1 mg/mL時清除率達到76.88%，清除能力較海參臟器多糖HPS1和HPS2高（1 mg/mL時分別為52.76%和64.66%）［16］，比抗壞血酸稍低。試驗結(jié)果表明，方格星蟲體腔液多糖對羥自由基的清除呈劑量依賴性，提示方格星蟲體腔液多糖可能是一種較好的羥自由基清除劑。

2.2.3方格星蟲體腔液多糖對超氧自由基的抑制能力

方格星蟲體腔液多糖對超氧自由基的抑制能力結(jié)果見圖3。

圖3　方格星蟲體腔液多糖對超氧自由基的抑制能力Fig.3Superoxide anion scavenging effect of polysaccharide from S.nudus coelomic fluid

超氧自由基不僅自身具毒性，而且可以經(jīng)過一系列反應生成其它活性氧自由基，進一步對生物體產(chǎn)生損傷作用，且停留時間較長。由圖3可看出，試驗濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，方格星蟲體腔液多糖對超氧自由基的抑制作用先是增加較快隨后有所減緩，這可能是在較高濃度條件下多糖自身的溶解性限制了對超氧自由基的抑制能力。較高濃度的方格星蟲體腔液多糖對超氧自由基的抑制能力遠遠低于相同濃度的抗壞血酸，1 mg/mL時多糖和抗壞血酸的抑制率分別為26.17%和89.72%，多糖的抑制能力低于海參臟器多糖（HPS1和HPS2）［16］及海星多糖［17］。

3結(jié)論

該試驗的研究表明濃縮溫度70℃、NaOH質(zhì)量體積百分比1%時，較適宜方格星蟲體腔液多糖的提取，提取率為0.75 g/L，多糖含量為51.39%。抗氧化試驗表明：在體外環(huán)境中，方格星蟲體腔液多糖有較好的還原能力和羥自由基清除力，對超氧自由基也有一定的抑制能力。因此，方格星蟲體腔液多糖具有良好的開發(fā)應用前景，同時對于增加方格星蟲的經(jīng)濟附加值有重要意義。

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Extraction and Antioxidant Activity in Vitro of Polysaccharide from Sipunculus Nudus Coelomic Fluid

DONG Lan-fang，ZHANG Qin*，TONG Tong，XU Ming-zhu
（Guangxi Institute of Oceanology，Key Laboratory of Marine Biotechnology of Guangxi，Beihai 536000，Guangxi，China）

In this paper，concentrated temperature and the amount of alkali were optimized for extraction conditions of polysaccharide from sipunculus nudus coelomic fluid.The optimal concentrated temperature was 70℃，and the amount of NaOH was 1%（mass to volume ratio）.Under this condition，yield of polysaccharide was 0.75 g/L，and polysaccharide content was 51.39%.The antioxidant activity of polysaccharide obtained under optimum condition was studied in vitro.The results showed that in the indicated concentrations，the polysaccharide possessed strong reducing power，and scavenged hydroxy radical and superoxide radical to a certain extent，the clearance rates were 76.88%and 26.17%respectively at 1 mg/mL.But the reducing capacity and free radical scavenging activity were weaker than ascorbic acid.

sipunculus nudus；coelomic fluid；polysaccharide；extraction；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.11.011

2013-09-30

董蘭芳（1987—），女（漢），助理研究員，本科，研究方向：水產(chǎn)動物天然產(chǎn)物開發(fā)的研究。

張琴（1982—），女，博士，副研究員，主要從事水產(chǎn)動物天然產(chǎn)物開發(fā)的研究。