水蒸氣蒸餾與乙醇提取化橘紅葉成分的GC-MS分析

韓寒冰，王明陽(yáng)，劉杰鳳，馬超，李海航

（1.廣東石油化工學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，廣東茂名525000；2.茂名出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東茂名525000；3.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省植物發(fā)育生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510631）

水蒸氣蒸餾與乙醇提取化橘紅葉成分的GC-MS分析

韓寒冰1，王明陽(yáng)2，劉杰鳳1，馬超1，李海航3

（1.廣東石油化工學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，廣東茂名525000；2.茂名出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東茂名525000；3.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省植物發(fā)育生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510631）

分析比較水蒸汽蒸餾法與乙醇提取化橘紅葉化學(xué)成分的差異。通過(guò)水蒸汽蒸餾提取和無(wú)水乙醇超聲輔助提取化橘紅葉中的化學(xué)成分，運(yùn)用GC-MS技術(shù)對(duì)其成分進(jìn)行分離鑒定，用峰面積歸一化法進(jìn)行定量分析。水蒸汽蒸餾提取法共分離出58種成分，鑒定出其中的18種，主要成分是：β-蒎烯（19.44%）、β-月桂烯（6.95%）、D-檸檬烯（10.49%）、γ-萜品烯（19.30%）和石竹烯（20.46%）等；乙醇提取法共分離出80種成分，鑒定出其中的43種，主要成分是亞油酸（16.8%）、硬脂酸（6.57%）、菜油甾醇（5.82%）、豆甾烯醇（7.12%）和扶桑甾醇氧化物（14.28%）等，同時(shí)鑒定了甲氧基香豆素、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、前胡內(nèi)酯和橙皮油內(nèi)酯等香豆素類(lèi)化合物，以及柚皮素、角鯊烯和VE等活性成分。兩種不同的提取法共分離鑒定了18種相同的化學(xué)成分，乙醇提取法多分離鑒定25種成分。

GC-MS；化橘紅葉；水蒸氣蒸餾法；乙醇提取法

化橘紅為蕓香科植物化州柚（Citrus grandis‘Tomentosa’）或柚［Citrus grandis（L.）osbeck］的未成熟果實(shí)的外果皮，是治療風(fēng)寒咳嗽、健脾消食之常用中藥［1-2］?；偌t主要有效成分為黃酮化合物和揮發(fā)油，目前，常采用水蒸氣蒸餾法［3］、蒸餾萃取法［4］、超臨界CO2萃取法［5］和溶劑提取法［6-8］等提取揮發(fā)油，但由于水蒸氣蒸餾過(guò)程中溫度高，揮發(fā)油成分容易丟失或發(fā)生氧化，其他方法原材料也要在50℃～60℃條件下烘干，極易造成揮發(fā)油成分中單萜或倍半萜烯類(lèi)化合物散失或氧化，因此，鑒定的有效成分種類(lèi)和含量出入較大。本實(shí)驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法和乙醇提取法對(duì)化橘紅葉化學(xué)成分進(jìn)行提取，采用GC-MS法對(duì)其成分進(jìn)行分離鑒定，對(duì)比兩種方法提取的成分和含量的差別，為化橘紅葉資源的綜合開(kāi)發(fā)利用和質(zhì)量控制研究提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與儀器

化橘紅原植物材料在2012年6月期間采自化州市林塵鎮(zhèn)祥秀化橘紅實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)基地，植株經(jīng)廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所向旭研究員鑒定為化州柚（Citrus grandis‘Tomentosa’）的假西洋品種。樣品為30天葉齡的嫩葉，鮮材料磨成漿狀，經(jīng)冷凍干燥后，再用研缽磨成粉末作提取用。

島津GCMS-QP2010plus型氣質(zhì)聯(lián)用儀：日本島津公司；XY-FD-8L冷凍干燥機(jī)：上海欣諭儀器有限公司；無(wú)水乙醇和無(wú)水硫酸鈉等試劑均為分析純。

2方法

2.1水蒸汽蒸餾法

稱(chēng)取500g化橘紅葉樣品粉末，置2000mL圓底燒瓶中，按2010年版中國(guó)藥典一部附錄XD揮發(fā)油測(cè)定法項(xiàng)下甲法操作［9］，提取5 h，經(jīng)無(wú)水硫酸脫水得到淺黃綠色具濃郁香氣透明液體1.2 mL，取揮發(fā)油0.5 mL，用無(wú)水乙醇定容到5 mL，溶液過(guò)0.22 μm濾膜供測(cè)試用。

2.2乙醇提取法

準(zhǔn)確稱(chēng)取化橘紅葉樣品粉末1g置10mL的提取管中，加入10mL無(wú)水乙醇，在30℃超聲提取0.5h，離心，上清液于4℃冰箱中經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水24h，6000r/min低溫離心10min，上清液過(guò)0.22 μm濾膜供測(cè)試用。

2.3氣相色譜-質(zhì)譜條件

HP-5石英毛細(xì)管柱（0.25 mm×30 m，0.25 μm）；升溫程序（起始溫度50℃，5℃/min升至150℃，8℃/min升至250℃，保持6.5 min）；進(jìn)樣口溫度250℃；載氣（He）流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量0.2 μL；分流比5∶1。E I離子源，電子能量70 eV，掃描范圍m/z40～450。NIST 2010標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)自動(dòng)檢索，參考有關(guān)文獻(xiàn)資料，鑒定化學(xué)成分，按面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)含量。

3結(jié)果與討論

在上述GC-MS色譜-質(zhì)譜分析條件下，測(cè)得葉提取成分GC-MS總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1　水蒸氣蒸餾法（A）和乙醇提取法（B）提取成分的總離子流圖Fig.1Total ion chromatogram（TIC）of the extracts by steam distillation（A）and ethanol extraction（B）

分析范圍在5 min～39 min之間。從氣相色譜-質(zhì)譜總離子流色譜圖中，水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油成分中分離出58個(gè)色譜峰，鑒定了18個(gè)化合物，占總量的90.99%；從乙醇提取法提取的成分中分離出80個(gè)色譜峰，鑒定43個(gè)化合物，占總量的88.38%。從圖1中可以看出，兩種提取方法的化學(xué)成分的差異很大，具體成分和相對(duì)含量分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　水蒸氣蒸餾與乙醇提取化橘紅葉成分的GC-MS分析Table 1GC-MS analysis of the extracts by steam distillation and ethanol extraction from Citrus Grandis leaves

從表1可以看出，水蒸氣蒸餾法提取到的成分絕大部分是低沸點(diǎn)的單萜和倍半萜烯類(lèi)化合物，主要有β-蒎烯、β-月桂烯、檸檬烯、γ-萜品烯和石竹烯，它們占分離成分總量的76.64%。乙醇提取法提取得到的化學(xué)成分種類(lèi)多得多，脂肪酸及甾醇物質(zhì)的含量最高，提取分離鑒定了多種香豆素類(lèi)化合物、角鯊烯、柚皮素和VE等多種活性物質(zhì)。

化橘紅葉中的主要成分β-蒎烯、β-月桂烯、檸檬烯、γ-萜品烯和石竹烯等是很好的香料成分，它們均具有祛痰、止咳、驅(qū)風(fēng)、鎮(zhèn)痛和殺菌消炎等作用［8］，甲氧基香豆素、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和橙皮油內(nèi)酯等香豆素類(lèi)化合物具有抗氧化、抗菌抗病毒之功效［10］，柚皮素是柚皮苷的苷元，有研究表明它比柚皮苷具有高得多的活性［11］，角鯊烯和VE均為具有較強(qiáng)生物活性的物質(zhì)，角鯊烯在血液中輸送活性氧的能力很強(qiáng)，VE能抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，清除自由基，兩者均可增加機(jī)體免疫功能，延緩人體衰老，預(yù)防和治療心血管疾病，被廣泛應(yīng)用在醫(yī)療保健品和化妝品等方面［12］?；偌t葉片的資源豐富，每年疏枝帶來(lái)的大量葉片通常作為廢物丟棄。因此，深入研究葉的化學(xué)成分，對(duì)開(kāi)發(fā)利用化橘葉揮發(fā)油、化橘紅葉保健茶或其它化痰止咳的藥用產(chǎn)品，有深遠(yuǎn)的意義。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水蒸氣蒸餾法只能提取到部分的有效成分，乙醇提取法實(shí)驗(yàn)材料用量少，操作過(guò)程簡(jiǎn)單，樣品制備耗時(shí)少，提取得到的化學(xué)成分種類(lèi)多，同時(shí)能最大限度減少揮發(fā)油成分的散失、氧化和轉(zhuǎn)化，分析的結(jié)果更接近其真實(shí)的種類(lèi)數(shù)量和相對(duì)含量。

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GC-MS Analysis of the Extracts by Steam Distillation and Ethanol Extraction from Citrus Grandis Leaves

HAN Han-bing1，WANG Ming-yang2，LIU Jie-feng1，MA Chao1，LI Hai-hang3
（1.College of Chemistry and Life Sciences，Guangdong University of Petrochemical Technology，Maoming 525000，Guangdong，China；2.Maoming Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Maoming 525000，Guangdong，China；3.Guangdong Provincial Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development，College of Life Sciences，South China Normal University，Guangzhou 510631，Guangdong，China）

To analyse the chemical constituent of the extracts from leaves of Exocarpium Citrus Grandis by different extraction methods.The compounds were extracted by steam distillation and ethanol separately，constituents were separated and identified by GC-MS，and were quantified by the accuracy of area percent.58 components were separated，among which 18 were identified，the main components were β-Pinene（19.44%），β-Myrcene（6.95%），Limonene（10.49%），γ-Terpinene（19.30%）and Caryophyllene（20.46%）by steam distillation.80 components were separated，among which 43 were identified，the main components were fatty acids（23.27%）and sterols（27.22%），the main active ingredients were five cumarins（Herniarin，F(xiàn)icusin，Bergapte，Ammidin and Aurapten），Naringenin，Supraene and Vitamin E in the alcohol extraction.18 chemical components of the extracts were the same by the two extraction methods，but there were more than 25 components in the alcohol extraction.

GC-MS；Citrus Grandis leaves；steam distillation；ethanol extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.11.029

2014-02-21

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013B020503069）

韓寒冰（1964—），女（漢），教授，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物的提取與分離。